Name: ベイカーにおけるミトコンドリア形質転換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶベイカー酵母を用いたミトコンドリア形質転換法。高速粒子銃法でミトコンドリアDNAを導入し、呼吸鎖複合体の組み立てとタンパク質合成制御の分子メカニズムを解明する。Saccharomyces cerevisiaeモデルでエネルギー代謝研究に貢献する。

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この出版物は、Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M] の支援を受けました。UPD は CONAHCYT フェロー (CVU:883299) です。光学顕微鏡の画像に関する技術的な支援を提供してくださったAriann Mendoza-Martínez博士に感謝いたします。バイオレンダリングライセンス:DU26OMVLUU(図2)。BK26TH9GXH(図3)。GD26TH80R5(図4)。PU26THARYD(図7)。ML26THAIFG(図 9)。

注:ミトコンドリアの形質転換効率は通常低いため、各コンストラクトに対して6つの形質転換を行うことをお勧めします。異なる増殖培地の組成を 表2に示します。
1. タングステン粒子の調製
<ol><li>0.7 μmのタングステン粒子(WP、マイクロキャリア)30 mgをマイクロチューブ内で秤量します。70%エタノール(EtOH)を1.5mL加えて滅菌します。WPをボルテックスし、室温で10分間休ませます。</li>
	<li>13,200 x g で室温で15分間遠心分離します。WPを洗浄するには、粒子に1.5 mLの滅菌水を加え、ボルテックスし、室温で13,200 × g で15分間遠心分離します。上清を捨てます。</li>
	<li>滅菌済み50%グリセロール500μLを添加します(最終濃度は60μgのWPs/μLです)。 注:WPは-20°Cで少なくとも6か月間保存できます。このストックから、6回の形質転換に必要な量(100μL)を取ります。</li>
</ol>2. WPs DNAコーティング
<ol><li>2 μプラスミド 5 μg とミトコンドリア配列を含む細菌プラスミド 15 μg を氷上のマイクロチューブに加えます。 注:DNAコーティングに必要な試薬がさらに希釈されるのを避けるために、最終容量は50μLを超えてはなりません。</li>
	<li>100 μLのWP懸濁液とボルテックスを5秒間加えます(6 mgのWPs)。</li>
	<li>1 Mスペルミジンを4 μL加えます。簡単に渦巻きます。</li>
	<li>氷冷した2.5 M CaCl2 100 μLを加え、短時間ボルテックスします。氷上で10分間インキュベートします。3分ごとにミックスを短時間ボルテックスします。 注:CaCl2 溶液はフィルター滅菌されており、オートクレーブ滅菌しないでください。</li>
	<li>WPを4°Cで13,200 × g で30秒間遠心分離し、上清を捨てます。粒子を-20°Cで200μLの100%EtOHに穏やかに再懸濁して洗浄します。</li>
	<li>WPを4°Cで13,200 × g で30秒間遠心分離し、上清を捨てます。洗濯を繰り返します。</li>
	<li>ピペットチップを使用して、WPを室温100%EtOHの60〜70μLに再懸濁します。渦を巻かないでください。 注:プラスミドの品質を確保するために、DNAコーティングはバイオリスティック形質転換と同じ日に行う必要があります。</li>
</ol>3. バイオリスティック材料の調製
<ol><li>砲撃の前に、6つのマクロキャリアホルダー(図5)をオートクレーブで滅菌し、完全に乾燥させます。あるいは、それらをEtOHに浸し、鉗子の助けを借りて炎を使用して滅菌します。滅菌ガラスプレートの上に置きます。</li>
	<li>DNA沈殿中(ステップ2.4で氷上で10分間インキュベーション)、滅菌鉗子を使用して、6つのマクロキャリアホルダーのそれぞれに6つのマクロキャリア(またはフライングディスク)を挿入します。 注意: マクロキャリアを滅菌しないでください。</li>
	<li>DNAでコーティングされたWPをピペットと混合します。10 μL の WP を各マクロキャリア表面に加え、ピペットチップで表面全体に分散させます。必要に応じて、マクロキャリアの表面に数マイクロリットルの100%EtOHを追加して、WPが均一に広がるようにします。懸濁液を室温で~20分間乾燥させます。</li>
</ol>4.酵母細胞と衝撃板の調製
<ol><li>rho0 受容体株を2 mLのYPR培地に接種します(表2)。回転するホイールで30°Cで一晩育てます。</li>
	<li>培養物300 μLを30 mLの新鮮なYPR培地で希釈します。ロータリーシェーカーで30°C、200rpmで培養物が飽和するまで2晩成長させます。</li>
	<li>酵母細胞を600 × g で室温で5分間遠心分離します。上清を捨て、酵母細胞を600μLのYPD培地に再懸濁します(表2)。</li>
	<li>滅菌ガラスハンドルを使用して、100 μLの酵母細胞懸濁液を固体の衝撃培地プレートに広げます。 注:爆撃培地には、形質転換に使用される2 μプラスミドの選択マーカーが欠けている必要があります。</li>
	<li>他の5つのプレートについても手順4.4を繰り返します。</li>
	<li>衝撃前に室温で1〜3時間インキュベートし、液体媒体がプレートの表面に完全に吸収されることを確認します。</li>
</ol>5. 生物形質転換による合成rho-株の生成
注意: 始める前に、バイオリスティック機器のユーザーマニュアルを必ずお読みください。参照された機器のプロトコルについて説明します(資料の表 と 図5)。
<ol><li>バイオリスティック粒子送達システムのチャンバーを70%エタノールで洗浄して汚染を防ぎ、少なくとも10分間放置します。砲撃の直前に、清潔なペーパータオルで表面を拭きます。</li>
	<li>ヘリウムタンクバルブを開いて、約2,000psiに設定します。</li>
	<li>装置の電源を入れ、真空源をオンにします。</li>
	<li>鉗子を使用して、マクロキャリアを下向きにしてマクロキャリアホルダーに置きます。 注意: 機器に付属の停止画面は使用しないでください。</li>
	<li>マクロキャリアの蓋をマクロキャリアの上にねじ込みます。すべての部品が一緒になってマイクロキャリア発射システムを構成します(図5)。</li>
	<li>マイクロキャリア発射システムを下から5番目のレベルの真空チャンバー内に配置します。</li>
	<li>rho0 ひずみ芝生を含むプレートの1つを、チャンバーの底から2番目のレベルに置きます。プレートが上を向き、蓋がないことを確認します。</li>
	<li>滅菌鉗子を使用して、保持キャップに1つのラプチャーディスクを置きます。加速チューブの保持キャップをねじ込みます。保持キャップがぴったりと固定されていることを確認してください。 注:形質転換効率が低下することが観察されているため、マニュアルで提案されているように、破裂した椎間板をイソプロパノールで処理しないでください。</li>
	<li>真空チャンバーのドアを閉めます。</li>
	<li>VAC / VENT / HOLDスイッチをVACの位置に置きます。25〜28 inHgの真空度に達したら、VAC / VENT / HOLDスイッチをHOLDの位置に変更します。 注意: 達成可能な真空は海面によって異なる可能性があることに注意してください。その結果、25 inHgに達することに成功しました。</li>
	<li>加速チューブに圧力がかかるのを待ち、1,300 psiに達するとラプチャーディスクが壊れて破裂音がします。</li>
	<li>ラプチャーディスクが壊れた直後は、VAC/VENT/HOLDスイッチをBENTの位置に変更することで、FIREスイッチとバキュームが解除されます。</li>
	<li>滅菌鉗子を使用して、プレートの表面に存在するラプチャーディスクの破片を慎重に取り除き、プレートを蓋で覆います。</li>
	<li>残りの5枚のプレートについてもこの手順を繰り返し、各ラウンドに新しいラプチャーディスクとマクロキャリアを配置します。</li>
	<li>最後に、ヘリウムタンクのメインバルブを閉じます。</li>
	<li>チャンバーを閉じ、 VAC / VENT / HOLD スイッチを VAC の位置にして真空にします。 FIRE スイッチを数回押して放すことにより、システムをヘリウム圧力から解放します。ドアを開けた状態で繰り返します。</li>
	<li>真空ポンプと爆撃装置の電源を切ります。</li>
	<li>70% EtOHで送達システムを清掃します。マクロキャリアサポートを0.1%SDS溶液で洗浄します。滅菌蒸留水と100%EtOHですすいでください。</li>
</ol>6.合成rho- コロニーの選択
<ol><li>砲撃プレートを30°Cで5〜7晩インキュベートします。 注意: プレートに汚れがないか毎日チェックすることが重要です。必要に応じて、汚染された領域を滅菌ヘラで切り取り、さらなる汚染を避けることができます。</li>
	<li>反対の嵌合タイプのテスター株を2 mLのYPD培地に一晩接種します( 図2D、Eの具体例を参照)。</li>
	<li>150 μLのテスター株培養物をYPDプレートに接種します。滅菌ガラスハンドルを使用して、テスターをプレート表面に均等に広げます。プレートを少なくとも5分間乾かします。</li>
	<li>ベルベットの複製パッドとレプリケータースタンプを使用して、砲撃プレートのレプリカを作成します。<ol><li>形質転換された2 μプラスミド補助栄養マーカーに対応するドロップアウト培地プレート上に複製します。成長には、30°Cで一晩インキュベートする必要があります。 その後、さらに使用するまで4°Cで保存してください。このプレートが マスタープレートです。</li>
		<li>ステップ6.3のテスターの芝生を含むYPDプレートに複製します。30°Cで2晩インキュベートします。その後、このプレートを選択培地で複製して、目的のミトコンドリア遺伝子(例えば、呼吸用培地やアルギニンを欠く培地)の存在を検出し、30°Cで一晩インキュベートします。 ミトコンドリアに合成細菌プラスミドを保有する細胞のみが、テスター株と交配した後、選択培地上で増殖します。</li>
	</ol></li>
	<li>マスタープレート(ステップ6.4.1)で、ステップ6.4.2で成長した対応するコロニーを特定します。 注:爆撃プレート(したがってマスタープレート)は形質転換コロニーで密集しているため、テスターの交配プレートで観察された陽性のコロニーを特定するのが難しい場合があります。このため、油性マーカーを使用して、すべてのプレートの両側に数本の小さな線を引くことを強くお勧めします。複製スタンプのリングにも同様の線を引きます。これらの線は、マスタープレート上のポジティブコロニーの向きと位置を特定するのに役立ちます( 図2Dの例を参照)。</li>
	<li>ステップ6.4.1のように、ポジティブコロニーをマスタープレートから2番目の選択的ドロップアウトプレートにストリーキングして、ポジティブコロニーを精製します。30°Cで2晩インキュベートします。 注:ストリーキングにより、単一のコロニーの成長が可能になり、純粋な菌株が確保されることが不可欠です。</li>
	<li>選択プロセス(ステップ6.2-6.5)を繰り返して、ミトコンドリア中の細菌プラスミドの存在を確認します。 注:通常、このプロセスをさらに2回繰り返すことで、安定した合成rho- 株を選択できます。</li>
	<li>合成rho- 株がミトコンドリアのプラスミドDNAを安定して維持したら、3〜5の異なる陽性コロニーを選択し、それらを2mLのYPDに接種します。この培養物を使用して、クライオバイアルストックを調製し(600 μLの培養物と600 μLの50%グリセロールを混合して-70°Cで保存)、プラスミド配列を目的のmtDNAにサイトダクションにより挿入します(ステップ6.7)。 注:合成rho- 株からのミトコンドリア内の形質転換プラスミドを維持するための選択圧がないため、プラスミドは容易に失われる可能性があります。そのため、できるだけ早くサイトダクションを行うことをお勧めします。</li>
</ol>7. 合成rho株に存在する構造をサイトダクションによるミトコンドリアゲノムの標的部位に統合する
<ol><li>2本のチューブに3mLのYPD培地を接種し、1本はドナー細胞(合成rho細胞 )を、もう1本はアクセプター細胞(最終的な構築が予想される酵母細胞)に接種します。30°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>ドナー株750 μLと受容体株250 μLを滅菌マイクロチューブに混合します(3:1の比率)。</li>
	<li>混合物を13,200 × gで1分間遠心分離します。上清を捨てます。端を切り落とした1 mLピペットチップを使用して、細胞ペレットを1滴取り、YPDプレートに置きます。30°Cで2〜4時間インキュベートします。 注:交差汚染を避けるために、1つのプレートに2つ以上の細胞懸濁液を入れないでください( 図4Aの例を参照)。</li>
	<li>細胞混合物を少量取り、スライド上に15 μLの滅菌水に再懸濁し、カバースリップを置きます。光学顕微鏡で、40倍または100倍の対物レンズを備えたshmoosの存在を確認します。この特徴的な形状は、2つの嵌合タイプが存在する場合に現れます(図3B)。</li>
	<li>shmoosが存在する場合は、2 mLのYPD培地に少量(~0.5 mm3)の細胞塊を再懸濁します。回転ホイールで30°Cで2時間インキュベートし、二核受精卵が回復するまで待ちます。</li>
	<li>混合物をボルテックスし、細胞懸濁液10 μLを990 μLの滅菌水(1:100希釈)で希釈します。ガラスビーズまたは滅菌ガラスハンドルを使用して、アクセプター株(および散発性二倍体)のみが増殖するドロップアウト培地に100 μLの細胞希釈液を広げます。30°Cで2〜3泊インキュベートします。</li>
	<li>得られたコロニーを、導入部(ステージ4)で説明したように、必要な選択培地に複製します。具体的な例については 図4C を参照ください。</li>
	<li>陽性コロニーを同定した後、それらを同じ選択培地に再投与して、目的のmtDNAを運ぶ一倍体株を精製します。</li>
	<li>少なくとも 2 つの陽性コロニーを選択し、2 mL の YPD 培地で 30 °C で一晩増殖させます。600 μLの50%グリセロールと600 μLの飽和YPD培養物を混合して、極低温バックアップを作成します。-70°Cで保存してください。</li>
	<li>得られた株31,32のDNAを単離する。PCRとシーケンシングにより目的の領域を増幅し、ミトコンドリア変異の存在を確認します。 注:各陽性コロニーは、ミトコンドリアゲノムの正しい配列を確保するために独立して確認する必要がある技術的な複製です。</li>
</ol>

変異原性解析のための酵母ミトコンドリアのバイオリスティック形質転換

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</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

本研究では、酵母 S.cerevisiae からミトコンドリアを成功裏に形質転換する方法について説明しました。このプロセスは、高速微小発射体衝撃から目的の酵母株の精製まで、合成rho- 株の精製のラウンド数に応じて、8~12週間かかります。この方法の重要なステップのいくつかは次のとおりです。まず、ミトコンドリア遺伝子コンストラクトの突然変異部位の周囲に付加される隣接領域が大きければ大きいほど、標的変異がうまく統合される確率が高くなります。隣接する領域の最小サイズは ~100 nt です。ただし、突然変異の両側で500を超えるNTを使用することを強く推奨します。第二に、形質転換後に合成rho-コロニーを選択する場合、3〜4ラウンド以下の精製が行われることが推奨されます。そうしないと、プラスミドをミトコンドリアに保持するための選択圧力がないため、最終的にミトコンドリア構築物が失われるリスクが高くなります。第三に、ユーザーや機器に害を与えないように、手順を開始する前に爆撃機のマニュアルを注意深く読む必要があります。この装置はデリケートで、高圧と真空を使用しています。
この手順の1つの制限は、これまでのところ、酵母と緑藻 C.reinhardtii のみがこの方法でミトコンドリアを形質転換する候補であることです。他の生物のミトコンドリアゲノムに部位特異的な突然変異を導入できれば、それは関連性があります。もう 1 つの制限は、同じセッションで多くの異なる構成体を変換するのが難しいことです。各構造に対して 6 つの変換を行い、それぞれをテスト、選択、および精製することをお勧めします。これにより、単一のミトコンドリア変異の純粋なrho- コロニーを得るためだけに、50プレート以上の培地が得られます。
これらの制限にもかかわらず、酵母のミトコンドリアゲノムを操作する能力は、呼吸複合体の生合成の多くの経路を理解するのに大きく貢献しています。このアプローチは、ミトコンドリア翻訳1,7,36,37をモニターおよび定量するためのレポーター遺伝子の導入、ミトコンドリア遺伝子の中断38、呼吸複合体のアセンブリシャペロンの同定39、ミトコンドリアの結合翻訳およびアセンブリ7,11,12,36のメカニズムの理解を深めるために使用できますそして、変異したミトコンドリア遺伝子の発現を追うときにサプレッサーを探す40。これまでのところ、哺乳類のミトコンドリアゲノムを操作する特定のアプローチは以前に報告されているが41、これらの生物に対してミトコンドリアDNAを形質転換する広範な方法は存在しない。

<table><tbody><tr><td>1 mLピペットチップ</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロチューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;Lピペットチップ</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルボトムチューブ&nbsp;</td><td>アクシゲン</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;Lピペットチップ</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐底&nbsp; チューブ</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>分析天秤</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>タミー</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Biolisitic Macrocarrier holder&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>フォーミディアム</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>フォーミディアム</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>フォーミディアム</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>フォーミディアム</td><td></td><td></td>DCS0169</tr><tr><td>培養ガラスフラスコ</td><td>KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>培養ガラス管</td><td>パイレックス</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>JT ベーカー&nbsp;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ミリポア</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>シグマ</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>ガラスハンドル</td><td>シグマ</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>JTベイ</td><td>カー2136-01</td><td></td></tr><tr><td>ヘリウムタンクグレード5(99.99%)</td><td>-</td><td>HSTaq</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;キット</td><td>PCR BIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ニューブランズウィック州 scientific</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>PCRチューブ</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>レプリカ プラター</td><td>Scienceware</td><td>Z363391</td><td></td></tr><tr><td>ラプチャー ディスク 1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>ソルビトール</td><td>シグマ</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>シグマ</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>組織培養ローテーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882015</td><td></td></tr><tr><td>タングステンマイクロキャリア M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>100L /分容量</td><td></td><td></td><td></td>の真空ポンプ</tr> - <tr><td>ベルベットパッド</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス&nbsp;</td><td>サイエンティフインダストリー</td><td>ズSI-0236</td><td></td></tr><tr><td>ウッドアプリケータースティック</td><td>PROMA</td><td>1820060</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr>アミノ酸<tr><td>なし酵母窒素ベース</td><td></td><td>BD291920</td><td></td></tr></tbody></table>

ベイカーにおけるミトコンドリア形質転換

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

ベーカー酵母 Saccharomyces cerevisiae は、何十年にもわたってミトコンドリアの生物学を理解するために広く使用されてきました。このモデルは、真核生物間の本質的で保存されたミトコンドリア経路、および真菌または酵母特異的な経路に関する知識を提供しました。 S. cerevisiae の多くの能力の1つは、ミトコンドリアゲノムを操作する能力であり、これは今のところ S. cerevisiae と単細胞藻類の Chlamydomonas reinhardtiiでのみ可能です。酵母ミトコンドリアの生物学的な形質転換により、部位特異的な突然変異の導入、遺伝子の再配列、レポーターの導入が可能になります。これらのアプローチは主に、ミトコンドリアにおける2つの高度に協調したプロセス、すなわちミトリボソームによる翻訳と呼吸複合体およびATP合成酵素の集合のメカニズムを理解するために使用されます。しかし、ミトコンドリアの形質転換は、他の経路の研究にも利用できる可能性があります。本研究では、高速微小発射体衝撃によって酵母ミトコンドリアを形質転換し、目的の形質転換体を選択して精製し、ミトコンドリアゲノムに目的の突然変異を導入する方法を示します。

この研究では、バイオリスティックな方法を使用して酵母ミトコンドリアを形質転換する方法を説明しています。また、形質転換体の選択方法と精製方法、およびミトコンドリアゲノム内の標的位置に目的の突然変異を導入する方法も示します。

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about ...

mitochondrial-transformation-baker-s-yeast-to-study-translation

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ベイカーにおけるミトコンドリア形質転換

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