Name: ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: 学ぶラット肝臓灌流と初代肝細胞単離法。コラゲナーゼ灌流技術を用いて高生存率の肝細胞を取得し、3Dオルガノイド培養による長期機能維持を実現する方法を解説します。

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<ol><li>Heslop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+evaluation+of+primary+human+hepatocyte+culture+using+global+proteomic+analysis+reveals+a+selective+dedifferentiation+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile.</a> Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).</li>
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<li>Raju, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pluripotent+stem+cell+differentiation+to+hepatocyte+ceases+further+maturation+at+an+equivalent+stage+of+e15+in+mouse+embryonic+liver+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development.</a> Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).</li>
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<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+functional+mouse+and+human+hepatocytes+as+3d+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocytes+undergo+phenotypic+transformation+to+biliary+epithelium+in+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+%28Baltimore%2C+Md%29%22%5BJournal%5D)">Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures.</a> Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGF%CE%B2-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
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<li>Ng, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+hepatocytes+with+multiparameter+perfusion+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control.</a> J Vis Exp. (170), e62289(2021).</li>
<li>Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+hepatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat hepatic cells.</a> J Vis Exp. (64), e3917(2012).</li>
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<li>Shulman, M., Nahmias, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+and+coculture+of+primary+rat+and+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).</li>
<li>Knobeloch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes%3A+isolation%2C+culture%2C+and+quality+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures.</a> Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).</li>
<li>Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+collagenases+on+the+isolation+of+viable+hepatocytes+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver.</a> Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A83-01- ALK5阻害剤IV</td><td>ツインヘリックス</td><td>&nbsp;T3031</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect リアルタイム PCR 解析システム&nbsp;</td><td>&nbsp;バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Twin Helix</td><td>T2310</td><td></td></tr><tr><td>Click EdU Alexa 488 イメージングキット</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>C10499</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン、I型、ラットテール由来の溶液</td><td>Merck</td><td>C3867-1VL</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン&nbsp;</td><td>メルク</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>メルク</td><td>&nbsp;E9644</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ユーロクロン</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>GELTREX LDEV FREE RGF BME</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム 25000 IU/5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HGF</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;100-39H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン溶液100倍&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>ユーロクロン</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>肝臓消化培地&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;17703-034</td><td></td></tr><tr><td>肝臓灌流培地</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>サイエンティフィック 17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>メルク</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>メルク</td><td>&nbsp;N-0636</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Merck</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Aurogene</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 緩衝液 1X</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0964,9050</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン溶液 100x</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-296039A</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>イスマテック&トレード;&nbsp;</td><td>MS-4/12 レグロ デジタルポンプ</td><td></td></tr><tr><td>TNFa</td><td>ペプロテック</td><td>&nbsp;300-01A</td><td></td></tr><tr><td>TRI試薬</td><td>メルク</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>チューブ&nbsp;</td><td>イスマテック&トレード;&nbsp;</td><td>&nbsp;ID.2,79mm</td><td></td></tr><tr><td>ウィリアムズ E ミディアム、グルタミンなし</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>31415029</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>ツイン ヘリックス</td><td>T1725</td><td></td></tr></tbody></table>

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

セットアップ手順(ステップ6.13)の終了時に、ラットの約300gの肝臓からの単離ごとに最大1×108 細胞の細胞収量を得ました。78%から97%の細胞生存率は、トリパンブルーカウンティングによって確立されました。
以前の研究1,18,19ですでに述べられているように、培養中の初代肝細胞は、その形態、肝臓特有の機能を失い、数日以内に死滅する。
文献23,24では、初代成体肝細胞がすぐに立方体六角形の形態を失い、数日以内に「線維芽細胞様」の形状に変わり、死滅することがよく知られている。図1は、コラーゲンコーティングされたプレートにプレーティングした後4時間で、肝細胞が表面に付着し、立方体の形態を示す典型的な単層に広がり、細胞のエッジが定義され、細胞間の接合部は直線的であり、細胞の表面は滑らかに見えます(図1A)。1日目には、初代肝細胞が典型的な六角形を獲得し、脂肪滴が見えるようになります(図1B)。2〜3日目には脂肪滴が増加し(図1C-1D)、4〜5日目には細胞にアクチンストレス繊維が蓄積します(図1E-F)。また、1日目から5日目までの初代2D培養における生細胞の割合を評価し、0日目のプレーティング前の生存率と比較しました(図2)。培養の最初の数日間で生存率の劇的な低下が観察され、1日目には49.5%(SD 12.7)に達し、2日目には45.2%(SD 18.2)、3日目には33.5%(SD 0.77)に低下します。4日目の生存細胞の割合はすでに16.9%(SD 5.4)ですが、5日目には9.1%(SD 0.38)に達しています。したがって、形態の喪失は、2D培養における成体肝細胞の急速な進行性細胞死を伴うことは明らかです。
単離された肝細胞は、プレーティング前(0日目)に、RT-qPCRで評価した肝マーカー遺伝子(ABCD3、ALB、KRT18、PCK1、SERPIN、TDO2)のmRNA発現が高いことを示しました(図3)。解析されたすべての遺伝子は、培養1日目にすでに培養時間依存的な発現の減少を示しています。mRNAの発現レベルは、期間中の初代肝細胞の機能的および生存能力の喪失を浮き彫りにしています。
単離された肝細胞を3Dマトリックス液滴に播種し、3Dオルガノイド細胞構造を経時的に追跡しました。培養の1日目に、単一の肝細胞をマトリックス液滴に懸濁します(図4A)。細胞濃度は意図的に低く保たれ、肝細胞が成長するための十分なスペースを提供します。また、これにより、オルガノイドの成長を視覚的に追跡することができます。初代肝細胞は、培養の最初の数日間で細胞分裂を示しました(図4C)。さらに、0日目にはHep-Orgsが30μm測定されましたが、2日目にはHep-Orgsはその寸法をほぼ2倍にし、15日目まで維持されたサイズの増加を強調しています(1日目33.08μm、2日目64.86μm、5日目45.06μm、7日目55.19μm、10日目51.93μm、Fay 156μm)。Hep-Orgsの形状については、1日目は丸い形状でしたが、翌日には「ブドウの房型」(肝臓オルガノイドの典型)に達しました。
3Dマトリックスに播種した肝細胞は、トリパンブルーアッセイを使用して15日後に23%±10%の生存率を示す数週間培養中に生存します(図4B、1行目)。ラットHep-Orgの増殖を検証するために、15日目にEdU試験を実施しました(図4D)。それにもかかわらず、Hoechst染色はHep-Orgよりも多数の単一細胞を示し、EdUの取り込みが低かった(9%±7%)場合でも、肝細胞(緑色細胞)の増殖活性が存在しました(図4B、2行目)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig01.jpg"> 図1:コラーゲンコーティングプレート上での初代肝細胞の経時的な2D培養。 画像は、(A)めっき後4時間で位相差顕微鏡法、(B)1日目、(C)2日目、(D)3日目、(E)4日目、(F)5日目に20倍倍で撮影しました。各写真には50μmに対応するスケールバーが報告されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig02.jpg"> 図2:コラーゲンコーティングプレート上の2D培養における生存初代細胞。 グラフは、1日目から5日目までの生細胞の割合を示しており、0日目に播種された生細胞と比較して、100%と見なされます。結果は、3 つの異なる実験の 1 回の反復、平均、および SD として報告されます (* p 値 ≤ 0.05、** p 値 ≤ 0.005)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig03.jpg"> 図3:初代肝細胞におけるRT-qPCRで測定した肝マーカーのmRNA発現。 結果は、β-Actinおよび/またはGAPDH(ハウスキーピング遺伝子)で正規化され、0日目にプレーティング前に収集された初代肝細胞に対する相対値として表され、1と見なされます。結果は、少なくとも3つの異なる実験の平均±SDとして報告されます(**+ p値 ≤ 0.001)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66857/66857fig04.jpg"> 図4:マトリックス液滴中の3D肝細胞の経時的な培養。(A) 長期Hep-Org用のマトリックス液滴に播種された単離された肝細胞:写真では、ウェルの表面にマトリックス液滴が見えます(赤丸=1液滴)。 (B) 継代前の15日目におけるトリパンブルーによる生細胞およびEdUによる増殖細胞の割合。EdU陽性細胞の定量は、ImageJ2ソフトウェアによって行われました。結果は、少なくとも3つの異なる実験の平均±SDとしてパーセンテージで報告されます。 (C) 3D培養における成長の異なる日におけるラットHep-Orgs 3D培養の位相コントラスト画像:1日目、2日目、5日目、7日目、10日目、15日目。画像倍率20倍。各写真には50μmに対応するスケールバーが報告されています。 (D) 15日目のラットHep-OrgsのEdU組み込みアッセイ。画像倍率 20倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/66857fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1: バッファーとメディアの構成。 この表には、プロトコールで使用されたすべてのバッファーおよび細胞培地の名前と成分(およびそれらの最終濃度)が報告されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:ラットプライマーのリスト。 この表は、RT-qPCR実験に使用したプライマーのリストを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66857/2024.05.08%20Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ない細胞株が存在しないと肝類洞内皮細胞（SECS）の研究は、動物から得られた初代培養細胞を使用して実行する必要があります。このメソッドは、その後の培養と実験のためのSECの浄化のための肝臓の消化および分画遠心法に依存しています。...

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