Name: 生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを用いて、HEK293T細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を定量的に測定する方法。この技術は、細胞内オルガネラ間通信と神経変性疾患の研究に有用です。

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<meta charset="utf8"></head><body>ハイスループットスクリーニングのためのER-ミトコンドリア接触を測定するためのシンプルなアッセイ

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+regulates+ER-mitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts.</a> Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.7 mL SafeSeal 微量遠心チューブ</td><td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート TC 処理済み</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ピペットチップ OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;LピペットチップOneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu;L 斜めの先端 OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレン コニカル チューブ</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル フリッパー マイクロチューブ ラック</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル プレート TC 処理済み&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 20 mm TC処理ディッシュ</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu;LのヒントOneTip</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機5910&nbsp;RI - 冷蔵遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド、無水、&ge;99.9%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グル</td><td>コース ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>DMSO に溶解; -70 °C;C</td></tr><tr><td>EnduRen Live Cell Substrate</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>アリコートを-70°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>エッペンドルフ 2-20 &mu;Lピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 100-1000 &mu;Lピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 &micro;Lピペット</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 12チャンネル</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu;Lピペット</td><td>エッペンドルフ&nbsp;</td><td></td><td></td>3123000055</tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、USDA承認地域</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp;インキュベーター、184 L、ポリッシュステンレススチール</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>ハンドタリーカウンター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>ミニ遠心分離</td>機<td>ベンチマークサイエンティフィック</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>マルチチューブラック50mlコニカル、15mlコニカル、およびマイクロ遠心チューブ用</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX-トランスフェクショングレードリニアポリエチレンイミン塩酸塩(MW 40,000)</td><td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine 臭化水素酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhosin 塩酸塩</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>5003</td><td>DMSO に溶解; -70 °C で保存;C</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX マルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>ボルテック</td>ス <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2215365</td><td>レベル 8</td></tr><tr><td>VWR 真空吸引システム</td><td>VWR</td><td>75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>DMSOに溶解し、-70°Cで保存します。ハ</td></tr></tbody></table>

生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

我々は、上記のプロトコルを使用して、特定のGTPaseを阻害することが知られている3つの化合物を添加したときのER-ミトコンドリア接触のレベルを測定しました。CDC42、RHO、およびRACは、活性化されるとアクチン重合28を促進するGTPアーゼであり、それぞれZCL278、Rhosin、およびEhop-016によって阻害される24。split-RlucでトランスフェクションしたHEK293T細胞をDMSO(コントロール)、ZCL278(50 μM)、Rhosin(50 μM)、またはEhop-016(25 μM)で処理し、1時間、2時間、および5時間インキュベートしました。プレートリーダーを使用して、定義された時点でのsplit-Rluc活性を測定しました(図2)。
Rhosin(RHO GTPase阻害剤)処理細胞は、1時間、2時間、および5時間の処理で、対照DMSO処理細胞と比較してルシフェラーゼ活性に有意な変化を示さなかった（p &gt; 0.9999、p = 0.6956、p &gt; 0.9999)）(図2)。これらの結果は、RhosinがER-ミトコンドリアの接触に影響を与えないことを示しており、RHO GTPase活性が2つの細胞小器官間の接触の調節に関与していないことを示唆しています。
対照的に、RAC GTPase阻害剤Ehop-016は、治療の1時間、2時間、および5時間でDMSOよりも有意に低いルシフェラーゼ活性を示しました(p = 0.0106、p = 0.0009、p = 0.0024)(図2)。これらのデータは、細胞内の正常なER-ミトコンドリア相互作用を維持するためには、RAC GTPase活性が必要であることを示しています。
最後に、CDC42阻害剤ZCL278は、ルシフェラーゼ活性の最も劇的な変化を示しました(図2)。ZCL278で処理した細胞は、対照DMSOと比較してルシフェラーゼ活性の有意な低下を示し、3つの時点すべてを通じて最も低いp値を示し、全体を通してp&lt;0.0001を維持しました。我々のデータは、CDC42 GTPase活性がZCL278によってブロックされると、ERミトコンドリア結合の強力な阻害を示しており、これは、split-ルシフェラーゼの各半分を別々にコードする2つのベクターと共トランスフェクトした細胞で実施された元のsplit-Rlucアッセイを使用した以前の報告と一致しています24。
ZCL278の顕著な結果を考えると、特に他のGTPase阻害剤と比較した場合、ZCL278活性は、DMSOコントロールに対してさまざまな濃度[0.5μM、5μM、50μM]でさらに試験されました。治療後1時間、2時間、および5時間で測定されたルシフェラーゼ活性は、用量依存的な反応を示しました。0.5 μMのZCL278はルシフェラーゼ活性に対する影響が最も弱くなり、5 μMはより強く、50 μMは再構成酵素活性の最も強い低下を示しました(図3)。まとめると、私たちの結果は、ZCL278が用量依存的にsplit-Rluc活性をダウンレギュレートし、時間が経つにつれて、高濃度のZCL278(CDC42阻害剤)は、低濃度と比較して対照DMSOと比較して有意な変化を示すことを示しています。
当社のsplit-Rlucアッセイを検証する方法として、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、透過型電子顕微鏡(TEM)、ミトコンドリアカルシウム取り込みモニタリングなどの確立された独立したアッセイを実施することができます(図4およびデータは示されていません)24。β2アドレナリン受容体アゴニストであるイソプロテレノールは、ER-ミトコンドリア接触プロモーター(図4A)のスクリーニングで同定された化合物の1つであり、イソプロテレノール治療時のsplit-Rlucのルシフェラーゼ活性が、PLAシグナル強度の変化とミトコンドリアカルシウムの取り込み(図4B-E)によって示されるように、ERミトコンドリア接触の増強により増加したことを確認しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> 図1:split-Rluc再アセンブリアッセイ (A)Split-RLucアッセイの概略図。ミトコンドリアと小胞体との間に膜接触がない場合、Mito-R lucNとRlucC-ERは相互作用せず、したがってRluc8活性はありません。しかし、Mito-R lucNとRlucC-ERとの間の相互作用は、ER膜とミトコンドリア膜が接触することで、完全な酵素活性をもたらし、これは基質の発光への変換によって検出されます。(B)split-Rluc DNAコンストラクト(pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry)の模式図。(C)HEK293T細胞におけるsplit-Rlucアッセイのワークフローの図。略語:水戸=ミトコンドリア;ER =小胞体;IRES、内部リボソームエントリーサイト。rb_glob pA、ウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナル;T2Aは、Thosea asignaウイルス由来の自己切断ペプチド2A配列です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> (A-C) DMSO(コントロール)、Rhosin [50 μM]、Ehop-016 [25 μM]、または ZCL278 [50 μM] 処理後 (各群で n = 12) の (A) 1 時間後、(B) 2 時間後、または (C) 5 時間後に再構成されたルシフェラーゼ活性。すべてのデータは、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。p 値は、p &gt; 0.05 (ns)、p ≤ 0.05 (*)、p ≤ 0.01 (**)、p ≤ 0.001 (***)、p ≤ 0.0001 (****) として報告されます。エラーバーは±測定の平均誤差標準誤差を示します。略語:水戸=ミトコンドリア;ER =小胞体;RLU = 相対光単位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> 図3:ZCL278で処理した細胞内のER-Mito接触のレベルを測定するsplit-R luc活性。(A-C) DMSO(コントロール)またはZCL278の(0.5 μM]、5 μM]、または[50 μM]濃度(各群でn = 12)の(A)1時間後、(B)2時間後、または(C)5時間後にルシフェラーゼ活性を再構成した。すべてのデータは、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。p 値は、p &gt; 0.05 (ns)、p ≤ 0.05 (*)、p ≤ 0.01 (**)、p ≤ 0.001 (***)、p ≤ 0.0001 (****) として報告されます。エラーバーは±測定の平均誤差標準誤差を示します。略語:水戸=ミトコンドリア;ER =小胞体;RLU = 相対光単位。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> 図4:split-Rlucアッセイの検証。 (A)ER-ミトコンドリア接触プロモーターの化合物スクリーニングで同定された、イソプロテレノールを含む11種類の薬物でHEK293T細胞を処理した後のsplit-Rluc活性の定量化の例。(B)DMSOまたはイソプロテレノール(1 μM)で処理したHeLa細胞における近接ライゲーションアッセイの一例。PLA信号(赤)は、ERと水戸の密接な接触を示します。Sec61-GFP(緑):ERにラベルを付けます。DAPI(青):核。(C)AにおけるPLAシグナルの定量化(n = 4、それぞれ77〜97個の細胞を用いた実験。Mann-Whitney test)。(D)ヒスタミン(100μM)に反応したミトコンドリアカルシウムの取り込み。DMSOまたはイソプロテレノール処理細胞で2.5秒ごとにプロットされたMito-R-GECO1蛍光強度変化(平均は複数のHeLa細胞で取得)。矢印はヒスタミン添加を示す。(E)左: Aにおけるミトコンドリアカルシウム取り込みの最大ピーク。対応のない両側 t検定(n = 10、DMOS;14、イソプロテレノール)。右:ミトコンドリアのカルシウム取り込み率( Aと同様、7.5〜12.5秒)。マンホイットニー検定(n = 12、DMSO;11、イソプロテレノール)。この図は、Lim et al.24から修正されています。略語:RLU =相対光単位;PLA = 近接ライゲーションアッセイ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:ER-ミトコンドリア接触の現在の技術の要約。 各方法の利点と制限の一覧。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherryのDNA配列(PDFおよびGBK形式)を含むZipファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherryの地図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。...

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

このビデオでは、タンパク質間相互作用を検出するための分割ルシフェラーゼ相補アッセイを実演しています。このアッセイでは、目的のタンパク質がルシフェラーゼ酵素の小さなフラグメントと大きなフラグメントにタグ付けされます。タンパク質が相互作用すると、大小の断片が結合して活性酵素複合体を形成し、特定の基質の存在下で測定可能な明るい発光を放出します。...

特異的なタンパク質間相互作用を同定するためのスプリットルシフェラーゼ相補アッセイ

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

この資料は、調査するホタルルシフェラーゼ-GFP融合タンパク質の使用を記載...

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。...

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

タンパク質間の相互作用は、すべての細胞プロセスの基本である。生物発光共鳴エネルギー転移を用いて、タンパク質の対の間の相互作用は、生細胞におけるリアルタイムでモニターすることができる。さらに、潜在的に病原性の変異の効果を評価することができる。...

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

ここでは、固定された細胞内小胞体とミトコンドリアの間に内因性の相互作用を視覚化し、高感度で定量化するための手順について説明します。プロトコルは、ミトコンドリア関連膜界面での75 /電位依存性アニオンチャネル/シクロフィリンD複合体イノシトール1,4,5-三リン酸受容体/グルコース調節タンパク質を標的と現場での近接連結アッセイに最適化されています。...

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

ここで提示されたプロトコルは、スプリットルシフェラーゼ相補アッセイの最新の変異体を用いて、生きた哺乳動物細胞におけるゴルジ常駐III型膜タンパク質と細胞質的に露出したN末端および/またはC末端との間の異種相互作用の発生を実証することを意図している。...

スプリットルシフェラーゼ相補アッセイを用いたゴルジレジデントIII型膜タンパク質によって形成される異種複合体の実証

膜接触部位(MCS)を研究するための新しいアプローチの必要性は、これらの細胞構造とその構成要素の研究への関心の高まりにより高まっています。ここでは、MCSに存在するオルガネラ内およびオルガネラ間タンパク質複合体を同定および定量するために、以前に利用可能であった顕微鏡技術を統合したプロトコルを紹介します。...

近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量

このプロトコルは、生細胞中のCRAFキナーゼと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するためのBRETベースのアッセイを説明しています。このプロトコルでは、細胞の調製、BRET排出量の読み取り、およびデータ解析の手順を概説しています。また、アッセイ最適化のための適切なコントロールとトラブルシューティングの特定を含む結果の例も示します。...

生細胞におけるCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのアッセイ

学ぶスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを用いて、HEK293T細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を定量的に測定する方法。この技術は、細胞内オルガネラ間通信と神経変性疾患の研究に有用です。

生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ

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