Name: 変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶマウス胚盤葉上から胃腸終末までのシングルセルRNAシーケンス法。変異体胚から高品質な細胞懸濁液を調製し、早期細胞運命決定と系統突然変異のオミクス解析を可能にします。

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Fox Chase Cancer CenterのGenomics Coreと、Dr. Johnathan Whetstineの研究室メンバーであるZach Gray氏、Madison Honer氏、Benjamin Ferman氏には、シーケンシング実験の技術サポートに感謝いたします。私たちは、Estaras博士と、シングルセル研究の初期分析に貢献したローテーション大学院生のAlex Morrisの研究室メンバーに感謝します。この研究は、NIHの助成金R01HD106969およびConchi EstarasへのR56HL163146によって資金提供されています。さらに、エリザベス・エイブラハムは、T32トレーニング助成金5T32HL091804-12の支援を受けました。

シングルセルシーケンシングのためのGastrulating Mouse Embryoの単離とジェノタイピング

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

この論文では、原腸陥入マウス胚から高品質の単一細胞および核懸濁液を得るための堅牢なパイプラインが紹介されており、特に初期発生における細胞運命の特異性メカニズムの研究を促進するために設計されています。この方法は、性別や体細胞遺伝子などの遺伝子型を必要とする胚の解析を最適化することにより、原腸陥入の分野における重大なギャップに対処します。このパイプラインは、遺伝子突然変異マウスモデルを利用し、マウス胚全体に対して高解像度のシングルセルシーケンシングを採用することにより、初期のマウス原腸の遺伝子発現プロファイルの理解を深めることができます。この方法は、Creリコンビナーゼシステムによる遺伝子変異マウスモデルを使用して、シングルセルオミクスの初期発生時点で高品質の細胞と核を得ることの実現可能性を示しています。この方法は、何度も試行を重ねて進化してきましたが、その間、サンプルはライブラリの調製とシーケンシングに必要な品質基準を満たしていませんでした。説明された方法論は、(1)胚の数を増やすための同期した時限妊娠、(2)凍結/融解を回避するための即日ジェノタイピング、(3)死にかけている細胞のシーケンシングを回避するための細胞/核の生存率の評価という3つの重要なステップの最適化を通じて、E8より若い胚から十分な細胞/核を生成します。このプロトコルは、シングルセルRNASeqで良好な結果をもたらしますが、このプロトコルで得られた細胞または核懸濁液は、細胞生存率が制限要因である他のシーケンシングプラットフォーム(smart-seq、drop-seq、cel-seq16など)で処理できます。
E7胚では、細胞の数は株や変異体の遺伝子型によって異なります。通常、E7胚は数百から数千の細胞に及ぶことがあり、目的の遺伝子型の胚を得ることは困難であり、基準を満たすのは妊娠中の母体ごとに1つまたは2つしかありません。このプロトコルにより、E7胚あたり約300個の生細胞を捕捉し、シングルセル解析を行うことができます。妊娠中の母動物から採取した胚を異なる日に急速冷凍することで胚プールのサイズを大きくする試みは、融解後に凍結保存剤を添加しても細胞の生存能力が著しく損なわれたため、失敗に終わった。この課題に対処するために、妊娠中の母犬の繁殖戦略と同期が最適化されました。複数の分離の可能性を高めるために、繁殖前に1〜2回出産した雌マウスを分離に使用することをお勧めします。女性の発情周期を監視することは非常に重要です。交配は、発情前期と発情期に発生する可能性が高くなります。繁殖に問題が発生した場合、プラグが生成されない場合は、4日後に繁殖パートナーを切り替えることも役立ちます。
この方法には制限があることに注意することが重要です:観察されたプラグに依存しており、プラグが観察されたとしても、妊娠を保証するものではなく、性行為を示すだけです。したがって、1日に観察されるプラグの数を増やすと、1日に複数の妊娠した母を持つ可能性が高くなり、遺伝子型が陽性になる可能性が高くなります。このプロトコルは、原腸陥入中の概念実証として、E7 から E7.75 までの胚期を使用することの実現可能性を実証しました。ただし、このパイプラインはE6.5からE8胚に適用できます。E6.5胚の場合、プールする目的の遺伝子型を持つ少なくとも7つの胚を得るために、同期妊娠の数を増やすことをお勧めします。代わりに、E8胚については、各胚の解離に使用されるトリプシンの量を20μLではなく~40μLに増やします。目標は、分配を進める前に、1μlあたり700〜1200細胞の濃度範囲で細胞/核懸濁液を得ることです。
良好な細胞生存率を持つことは、シングルセルシーケンシングの成功に不可欠です。製造業者によって提供されたマイクロ流体チップ設計では、単一細胞は、既知のバーコード化されたゲルビーズ11を含むチップ内のゲルビーズインエマルジョン(GEM)に分割される。ただし、このプロセスの顕著な制限は、高品質の単一細胞と低品質の単一細胞の両方を分割できることです。十分な数の生細胞(すなわち、1000細胞/μL)であっても、懸濁液の生存率が低い場合(すなわち、1000個の細胞が生きていて、1000個の細胞が死んでいるため、生存率は50%)、シーケンシング実験は失敗する可能性があります。最適な結果を得るには、約90%の生存率を目指すことをお勧めします。細胞の生存率が約60%〜89%の間にある場合、実験の生存率を高めるための特定の対策を講じることができます。ただし、細胞生存率が60%未満の場合は、実験を続行しないことを強くお勧めします。これは、死にかけている細胞が分配ゲルに「捕捉」され、その後のライブラリ調製と品質管理が目立った問題なしに通過するためです。しかし、実際のシーケンシング実験では、ほとんどのシーケンシングリードがミトコンドリア、リボソーム、またはアポトーシス遺伝子をマッピングし、最初から細胞生存率の低下の兆候を示しているため、完全に失敗する可能性があります。この論文で紹介されているデータは、高品質の細胞を持つ原腸陥入型マウス胚のシングルセルシーケンシングのパイプラインを示しています。この方法論は、開発中の多くの異なる遺伝子変異マウスモデルの理解に適用することができます。

生殖は、正常な発達に必要な基本的なプロセスです。この急速でダイナミックなプロセスは、多能性細胞が臓器の形成方法を定義する系統特異的な前駆体に移行するときに発生します。長年にわたり、原腸陥入は、中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの大部分が均質な集団の形成と定義されてきました。しかし、高解像度技術と新たな数の胚性幹細胞モデル1,2により、初期の胚細胞層3,4の間に前例のない不均一性が明らかになりました。このことは、原腸の異なる細胞集団を調節するメカニズムについては、まだ解明されていないことがたくさんあることを示唆しています。マウスの胚発生は、原腸陥入中の初期の細胞運命決定を研究するための最良のモデルの1つです3,5。マウスの胃腸陥入は急速で、原腸陥入の全過程は胚の日E6.5からE85までの48時間以内に起こります。
近年のシングルセル技術の進歩により、野生型マウスの胚発生の詳細なマッピングが可能になり、原腸陥入中の胚の細胞および分子ランドスケープの包括的な概観が得られました3,4,6,7,8。しかし、これらの段階での変異胚の解析はあまり一般的ではなく、しばしばFACSで選別された集団に限定されている9,10。この希少な文献は、ジェノタイピングを必要とする原腸陥入胚の操作と単一細胞調製に関連する技術的な課題を反映しています。原腸陥入のダイナミックな過程を捉えることは、特に変異胚を理解するために、その急速な性質のために課題を引き起こす可能性があります。妊娠のタイミングと同期は不可欠であり、妊娠のタイミング間のわずかな違いでさえ、突然変異遺伝子に起因する発生表現型と誤解される可能性があります。これは、突然変異遺伝子が原腸陥入のプロセスに影響を与える場合に特に重要になります13,14。この研究では、膣栓(つまり、交尾後に女性の膣内に形成される凝固した精液の塊)の視覚化を通じて同期妊娠を取得するためのガイドラインが確立されています。さらに、E6.5からE8までの突然変異原腸陥入胚から堅牢な単一細胞データを取得する戦略が設計されています。この戦略は、妊娠ごとに目的の遺伝子型を持つ胚の数が少ないこと、および凍結融解する胚または細胞によって引き起こされる生存率の低下に関連する制約を克服するために考案されています。
この論文では、膣プラグによる時限妊娠の確立から、単一細胞/核の最終的なシーケンシングまで、最適化された方法論について説明します。この方法は、所望の遺伝子型を持つ胚の数を増やすために同期妊娠の数を増やす方法、細胞の生存率を改善するための細胞/核の単離、および同日のジェノタイピングプロトコルを説明する。この原稿では、さまざまな原腸陥入の時点での胚分離のプロセスについても説明しています。この方法論は、シーケンシングのための最終生存胚細胞/核の数を増やすのに役立ち、高品質のシーケンシングデータを確保します。したがって、この方法は、ジェノタイピングを必要とする原腸陥入胚の単一細胞研究への扉を開くことになります。

<table><tbody><tr><td>10 cmシャーレ</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 & マイクロ;L リーチ バリア チップ</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 & マイクロ;Lリーチバリアチップ</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro;Lリーチバリアチップ</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro;m リバーシブルストレーナー、小さな</td><td>幹細胞</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>6 cm ペトリ皿</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>8ストリップPCRチューブ</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>アペックス・バイオリサーチ 製品</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>ベンチマーク・サイエンティフィック BSH300 MyBlock ミニ・ドライバス</td><td>ジェネシー</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle 冷蔵微量遠心分離機</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>Countess Cell Couning Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR 卵黄嚢</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>GenClone</td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000イメージングシステム</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ-シャープ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2グリーンマスターミックス</td><td>プロメガ</td><td>M7823</td><td></td></tr>グレー<tr><td>フ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン SMZ 1000 実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー 水</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>光学管 8x ストリップ (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>光学管キャップ 8x ストリップ (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>ポセイドン 31-511、HS24 微量遠心分離機、1.5/2.0 mL ローター 24 個、遠心分離機/単位</td><td>1 個 ジェネシー</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット dsDNA 定量アッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット Flex 3</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 阻害剤</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>テープステーションローディングのヒントア</td><td>ジレント</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>テープステーション4150</td>ア<td>ジレント</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>トリスHCL(Ph7)</td><td>品質生物学的</td><td>351-007-101</td><td></td></tr>トリ<tr><td>パンブルーステイン0.4%</td><td>セロモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>トライプルエクスプレス</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>Vortex ミキサー IKA MS3 96 ウェルサンプルプレートアダプター</td>付き <td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

変異体全マウス胚のシングルセルrnaシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

過去10年間で、シングルセルアプローチは、遺伝子発現ダイナミクス、細胞の不均一性、およびサンプル内の細胞状態を研究するためのゴールドスタンダードになりました。シングルセルが進歩する前は、発生初期に動的な細胞状況と急速な細胞遷移を捉える可能性は限られていました。この論文では、原腸陥入の開始と完了に対応する、胚のE6.5日目からE8までのマウス胚の単一細胞および核分析を実行するための堅牢なパイプラインを設計しました。胃腸形成は、器官形成に不可欠な中胚葉、外胚葉、内胚葉の3つの胚葉を確立する発達中の基本的なプロセスです。野生型の腹陥陥胚に適用されたシングルセルオミクスに関する広範な文献が入手可能です。しかし、変異胚のシングルセル解析はまだ少なく、多くの場合、FACSで選別された集団に限定されています。これは、ジェノタイピングの必要性、時限妊娠、妊娠ごとに目的の遺伝子型を持つ胚の数、およびこれらの段階での胚あたりの細胞数に関連する技術的な制約に一部起因しています。ここでは、これらの制限を克服するために設計された方法論を示します。この方法は、望ましい遺伝子型との同期妊娠の可能性を高めるために、繁殖と時限妊娠のガイドラインを確立します。胚単離プロセスの最適化ステップと同日ジェノタイピングプロトコル(3時間)を組み合わせることで、微小液滴ベースのシングルセルを同日に実施することができ、細胞の高い生存率と堅牢な結果が保証されます。この方法には、胚からの最適な核単離のためのガイドラインがさらに含まれています。したがって、これらのアプローチは、原腸陥入期における変異胚のシングルセルアプローチの実現可能性を高めます。この方法により、突然変異が原腸の細胞ランドスケープをどのように形成するかの解析が容易になると期待しています。

この論文で設計された方法論は、E6.5からE8までのシングルセルオミクス用の胚サンプルの調製を強化することを特に意図しています。この堅牢なパイプラインは、同期した妊娠、胚の分離、即日ジェノタイピング、細胞解離、細胞生存率の評価という5つの主要なステップで構成されています(図1A)。提示されたデータはE7からE7.5までの時点に焦点を当てていますが、手順にわずかなバリエーションがあるE8(図1B)までの胚にも適用できます(プロトコル全体の注を参照)。同期した時限妊娠は、2匹の雌マウスを雄のマウスと一緒にケージに入れることによって達成されました。膣栓は毎朝午前10時前にチェックされ、栓が観察された場合は、その日の正午までにE0.5と見なされました(図2A)。この研究では、プラグの最適な条件として、発情期または発情促進期の雌マウスを、以前の繁殖中に複数のプラグを成功裏に配置した履歴を持つ雄とペアにする必要がありました(図2B)。胚の分離には、明らかなプラグのみが考慮されました(図2C)。
発生時期は、図2Aのタイムテーブルに従って推定した。E7.5では、プラグ検出日の翌日7日目の午後12時に胚解剖が開始されました。図3は、E7.5での胚の単離の成功例です。妊娠中の母を安楽死させた後、子宮角を解剖し、脱落膜の腫れを個別に切開して胚を明らかにし、卵黄嚢をジェノタイピングのために分離しました(図3)。
同日ジェノタイピングは、図4Aのステップに従って、胚単離から3時間以内に行った。胚は、その完全性を維持するために、ジェノタイピングの過程で氷上に保管されました。胚を凍結すると、胚あたりの生存細胞の数が減少するため、凍結しないでください。図4B、Cは、内臓卵黄嚢、頭頂内胚葉嚢、および関連する母体血液を伴う外胎盤円錐を示しています。内臓卵黄嚢をジェノタイピングに利用しました(図4C)。卵黄嚢を消化した後、PCRミックスを調製し、PCR反応を実行しました。次いで、得られたPCR産物をアガロースゲル上で分離した。図4Dは、LoxPおよび野生型対立遺伝子(それぞれ597 bpおよび498 bp)およびCre対立遺伝子(650 bp)の予想されるフラグメントサイズを示しています。図4Eでは、CreおよびLoxP(flox)対立遺伝子を運ぶ育種ペアから得られた6つの胚からの卵黄嚢ジェノタイピングの例が示されている。ゲルは、分析した6つの胚のCreおよびLoxP対立遺伝子のPCR産物を示しています。胚番号2と5番は、2つのflox対立遺伝子と1つのcre対立遺伝子を持っています。したがって、それらは条件付きKO胚と見なされます(図4E、赤い点)。胚1と3は2つのflox対立遺伝子を持っていますが、Creに対して陰性です。したがって、それらはFLOXコントロールと見なされます。胚4には2つのflox対立遺伝子とCre対立遺伝子のかすかなバンドがあり、遺伝子型は「不明瞭」です。この胚は、さらに処理されませんでした(あるいは、実験家は、ジェノタイピングを繰り返すか、Creを発現する細胞を用いた条件付きKOの二次検証を行うことを検討してもよい)。この実験で使用されたCreドライバーは、内臓卵黄嚢15で発現されていないことに注意することが重要です。したがって、LoxP対立遺伝子は、Cre陽性胚と比較して、Cre陽性胚のゲル上でシフトしているようには見えません。
シングルセル実験を成功させるには、細胞数と良好な生存率が必要です。細胞生存率が低い、死細胞の割合が高い、凝集している、または大きな破片がある懸濁液は、さらなる処理には適していません。最適な条件は、マイクロリットルあたり700〜1200個の生細胞と&gt;90%の生存率です。 図5A は、良好な細胞生存率と最適でない細胞生存率の両方を示すパネルを示しています。 図5Bに示すように、同じ基準を核の単離にも適用できます。ただし、トリパンブルーの評価は細胞や核とは異なることに注意することが重要です:生存細胞はトリパンブルーを取り込まないのに対し、生存核は取り込む。細胞/核懸濁液が最適(生存率&gt;90%)の場合は、メーカーの手順に従ってマイクロ流体チップを使用したシングルセル分割を進めてください11。 図5Cに示すように、細胞/核の生存率が60%〜89%の懸濁液に対して、トラブルシューティングオプションが提供されています。細胞の総数に関係なく、生存率が60%を下回った場合は、実験の中止を検討してください。
妊娠中のダムの淘汰から図書館の建設までの全パイプラインは、同じ日に合計8時間かかります(つまり、プロトコルステップ2から6は同じ日に実行する必要があります)。シングルセルメーカーの手順11で概説されている手順に従って、E7胚から得られた細胞を用いたシングルセルRNAシーケンシングのためのライブラリー構造を調製し、細胞生存率は最適でない状態から最適な状態までの範囲であり、2000細胞の推定標的回収率を目指した(図6)。 図6A は、最適でない条件と最適な条件の両方におけるscRNAseqライブラリの代表的なフラグメントサイズ分布を示しており、細胞生存率がシングルセル分割プロセス全体に大きな影響を与えないことを示しています。フラグメントサイズ分布は400〜500bpの範囲でした。これは、最適でない条件がライブラリ調製のプロセスに影響を与えないことを示しています。 図6B は、成功したシングルセルRNAseq実験と最適でないシングルセルRNAseq実験の両方の結果を示しています。シーケンシング後、サンプルの品質管理チェックが行われ、細胞生存率が最適でない場合、細胞の10%のみが成功裏にシーケンシングされたことが観察されました。対照的に、最適なサンプルはより高い割合を示し、全細胞の91%がシーケンシングされました。これはバーコードプロットによってさらに証明されており、最適でない条件は最適な条件と比較してバックグラウンドノイズが大きいことを示しています。両方の実験でクラスタリング分析が行われ、最適な条件で9つのクラスターと最適でない条件で4つのクラスターが明らかになりました。既知のマーカー3 を用いたクラスターのアノテーションは、E7胚における予想される細胞型、すなわち、胚盤葉上および原始線条を含む(図6B)を明らかにした。最適でない実験では、各クラスターの既知のマーカーに濃縮がなかったため、クラスターアノテーションは不可能でした。このことは、これらの開発段階でデータを適切に表現するために必要な高品質の細胞の重要性を浮き彫りにしています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> 図1:シングルセルRNAシーケンシングのための原腸陥入型マウス全胚の最適化。 (A)原腸陥入胚から高品質の細胞および/または核を得るためのワークフロー概略図。(B)E7からE8への原腸陥入中のマウス胚の代表的な明視野画像と適応スキーム3 。スケールバー:125μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> 図2:原腸陥入中の胚分離のための効率的な同期時限妊娠のための戦略。 (A)時限妊娠のパイプラインを示す概略図と、特定の原腸陥入期の分析のためのプラグ検出から胚分離までの時間を説明するタイムテーブル。(B)雌マウスの発情周期の段階の代表的な画像。繁殖に最も受容性の高いフェーズが示されています。(C)膣プラグのチェック方法を示す概略図と、プラグのない膣口、部分プラグ、または胚分離のために考慮すべき適切なプラグの例。膣口は各画像の下に拡大されています。プラグ(膣口の凝固した精液)は、赤い矢印で強調表示されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> 図3:シングルセルRNAシーケンシングのためのE7.5胚の解剖とジェノタイピング。 E7.5胚を分離し、内臓卵黄嚢を解剖するプロセスの概略図と画像。黄色の矢印は妊娠中の母の子宮を示し、黄色の破線の円は胚の位置の輪郭を示しています。破線は、解剖中に切断された領域を表します。「M」は中間体末端を示し、「AM」は反中間体末端を示します。ステレオスコープ画像のスケールバーは400μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> 図4:原腸陥入マウス胚からの卵黄嚢の同日ジェノタイピング (A)卵黄嚢の同日ジェノタイピングのワークフロー概略図。(B)頭頂内胚葉嚢と外胎盤円錐体と関連する母体血液の代表的な画像。(C)破線で強調表示されたE7.5胚の内臓卵黄嚢。スケールバー:200 μm. (D) 野生型(+/+)、ヘテロ接合型(Flox/+)、ホモ接合型flox(Flox/Flox)、およびCreジェノタイピング(Mesp1cre15)の代表的なゲルと観察されたDNA断片サイズ。(E)6つの胚(1〜6)の卵黄嚢からのCreおよびflox対立遺伝子の同日ジェノタイピング結果が提供されます。flox/flox と Cre 陰性 (-) ジェノタイピングの 2 つの胚は flox コントロール (青い点) であり、flox/flox と Cre 陽性 (+) のジェノタイピングを持つ胚は条件付き KO (赤い点) です。胚4は、かすかなCreバンド(flox/floxおよびCre-unclear)のために最適ではなく、したがって、さらなる処理から除外されます。同じ遺伝子型の胚をプールし、シングルセルRNAシーケンシングのためにプロセシングします。卵黄嚢中のCre対立遺伝子の存在は、使用されるCre(Mesp1cre)が卵黄嚢で発現されないため、floxバンドのサイズに影響を与えないことに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> 図5:細胞の品質と核の生存率の評価 (A)E7.5胚からの最適な細胞生存率条件と最適でない細胞生存率条件の代表的な画像。(B)E8胚からの最適および準最適の核生存率条件の代表的な画像 (C)単一細胞分割を開始する前に、細胞の生存率を向上させるのに役立つ可能性のある解決策を示すトラブルシューティングスキーム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> 図6:E7マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング (A)E7マウス胚からのシングルセルRNAシーケンシングライブラリのフラグメントサイズ分布の代表的なトレースで、細胞生存率の最適条件と最適条件の両方について、メインピークが400-500 bp付近。これらの条件間でトレースは類似しており、細胞生存率がライブラリの品質管理に影響を与えないことを示しています。(B)E7マウス胚の単一細胞RNAシーケンシング結果を、最適でない条件と最適な条件の両方で解析し、観察されたターゲット回収率、バーコードランキング、およびUMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)分布による細胞タイプのクラスタリングを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">溶解バッファー</td>
		</tr><tr><td>試薬名</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>総容量 1 mL</td>
		</tr><tr><td>トリス-HCL (Ph7)</td>
			<td>1メートル</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>NaClの</td>
			<td>5メートル</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0.1メートル</td>
			<td>3メートル</td>
			<td>3 μL</td>
		</tr><tr><td>Tween-20 (トゥイーン 20)</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>ノンディードP40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>ジジトニン</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>DTTの</td>
			<td>1メートル</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>RNase阻害剤</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>25μL</td>
		</tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924μL</td>
		</tr><tr><td colspan="4">ウォッシュバッファー</td>
		</tr><tr><td>試薬名</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>総容量 1 mL</td>
		</tr><tr><td>PBSのBSA</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100μL</td>
		</tr><tr><td>PBSの</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900μL</td>
		</tr></tbody></table>表1:核単離溶解バッファーおよび洗浄バッファーの組成。

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。

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