Name: マイクロ流体エレクトロスプレー技術を用いた異なる金属イオンを有する架橋アルギン酸ナトリウムミクロスフェアの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶマイクロ流体エレクトロスプレー法による亜鉛・銅イオン架橋アルギン酸ナトリウムミクロスフェアの調製技術。抗菌性と持続的薬物放出特性を持つドラッグデリバリーシステムの開発に応用されます。

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本研究は、浙江樹仁大学の研究プロジェクト(2023R053および2023KJ237)の支援を受けて行われました。

実験で使用した血液は、体重20〜25g、生後約7週間のSPFグレードのBALB/c雌マウスから採取しました。浙江樹仁大学の動物実験倫理委員会は、すべての動物の世話と実験手順を承認しました。
1. 溶液の調製
<ol><li>ALGを礁量し、50°Cのウォーターバスで攪拌して超純水に溶解し、2%ALG溶液を得ます。</li>
	<li>超純水中のCaCl2、FeCl3、ZnSO4、CuSO4 の5%(または分子量濃度が0.3 M)溶液で質量分画を調製します。各溶液を別々に収集皿に注ぎます。</li>
</ol>2. マイクロ流体エレクトロスプレー装置
<ol><li>ガラス製の毛細管を取り、ブロートーチの炎の上に置いて柔らかくしてから、さまざまな直径(50μm〜500μm)に伸ばします。細かい部分をガラスカッターで切り落とし、先端ポートを高品質の炭化ケイ素サンドペーパーで優しく磨きます。洗浄後、キャピラリーチューブの太い端を長いチューブに接続し、チューブのもう一方の端を分注針と5mLシリンジに接続します(補足図1)。 注意: ガラス管のカットの鋭いエッジは、ホースに挿入するのが困難です。したがって、ブレークは炎の端で丸みを帯びている必要があります。</li>
	<li>シリンジをマイクロ流体シリンジポンプに取り付け、キャピラリーチューブの一方の端をホルダーに取り付けます。高電圧電源の赤い高電圧エンドクリップをシリンジの分注針に接続し、銀色のクリップを収集液に入れます。この構成により、単純なマイクロ流体エレクトロスプレーデバイスが作成されます(図1A)。 注意: キャピラリーチューブをテーブルに対して垂直に置きます。</li>
</ol>3. ALGマイクロスフェアの準備
<ol><li>異なる金属イオンを含む別々の収集皿をキャピラリーチューブの真下に置きます。マイクロ流体シリンジポンプをオンにし、[ Fast Forward ]を選択してALGでチューブをプライミングし、適切な流量(2 mL / h)を設定します。</li>
	<li>高容量のスイッチを入れますtage電源スイッチをオンにし、ノブを回して適切なボリュームを設定しますtage(5〜7 kV)。</li>
	<li>90 mmのペトリ皿のそれぞれに20 mLの溶液を加えてALGマイクロスフェアを収集し、異なる金属イオンと架橋されたALGMSを形成します(図1B)。</li>
	<li>ALGは、電場と重力の作用下で、さまざまなイオン収集溶液中で数秒以内にマイクロスフェアを形成します。滅菌したピペットでミクロスフェアを吸引し、個々の1.5 mL遠心分離チューブに移して、Zn2+、Ca2+、Cu2+、およびFe3+ -ALGハイドロゲルマイクロスフェアを取得します(図1C)。Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Fe-ALGMSチューブにラベルを付けます。 注:電圧、先端径、流量、溶液濃度などのパラメータを調整することにより、異なる直径のミクロスフェアを取得できます。</li>
	<li>調製した微小球を少量取り、PBSにできるだけ均一に分散させ、顕微鏡下に置いて可視化します。</li>
	<li>同じバッチのマイクロスフェアでランダムに選択された10の観察フィールド、測定する画像をImageJソフトウェアにインポートし、画像を適切なグレースケールモードに変換し、しきい値セグメンテーション技術を使用してターゲット粒子の領域を正確に定義し、ImageJがターゲット粒子を識別および測定できるように粒子を分析する機能を開始します。ミクロスフェアに関するデータを取得し、そのデータをOriginソフトウェアにインポートして、分析と粒子サイズマッピングを行います。</li>
</ol>4.抗菌性能試験
<ol><li>黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)および大腸菌(E.coli)の懸濁液5 mLを調製し、初期細菌の濁度が0.2 mcFの場合、液体Luria-Bertani(LB)培地を使用します。</li>
	<li>各細菌溶液10 mLを4本の個別の15 mL滅菌遠心チューブに加えます。次に、0.5 mLのZn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、およびFe-ALGMS ALGを各チューブに加え、37°C、200rpmの恒温シェーカーに12時間入れます。コントロールグループに同量の生理食塩水を追加します。</li>
	<li>各細菌溶液を滅菌水で10 5 倍に希釈します。滅菌ガラスビーズを使用して、LB固体培地に200μLの細菌溶液を広げます。</li>
	<li>溶液をコーティングプレート上に迅速かつ均一に広げ、同じ領域で前後にならないようにします。次に、プレートを37°Cのインキュベーターに12時間置きます。さまざまなグループのコロニーを観察します。 注:すべての無菌手順は、アルコールランプの近くで実行する必要があります。微生物培養容器、接種器具、培地の滅菌を行います。</li>
</ol>5. 薬物放出試験
<ol><li>さまざまなミクロスフェアの薬物放出能を評価するには、ロードモデル薬物としてウシ血清アルブミン(BSA)を使用します。各マイクロスフェア(Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、およびFe-ALGMS)500 μLを1 mg/mL BSA懸濁液に24時間加えます。</li>
	<li>薬物放出アッセイでは、各飽和サンプルを5.0 Mのリン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH 7.4)に加え、続いて37°Cで15分間攪拌し、80 rpmで連続振とうします。</li>
	<li>100 μLの溶液を使用し、1、3、6、12、24、36、および48時間後に培地を新しいものと交換します。</li>
	<li>製造元の指示に従って、BCAキットを使用して特定の時間における上清タンパク質濃度を定量します。放出された薬物を酵素マーカーで定量的に測定して対応する吸光度を取得し、測定値を標準曲線に従って実際の薬物濃度に変換します。次の式を使用して薬物放出率を計算します。 薬物放出率=(特定の時点で放出された薬物の濃度/初期薬物濃度)×100%</li>
	<li>一定の間隔で、各ウェルから等量のPBSを取り出し、等量の新鮮な培地と交換します。</li>
</ol>6. 溶血検査
<ol><li>調製したCa-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、Fe-ALGMSをPBSに入れ、37°Cで24時間インキュベートしてインキュベーション溶液を調製します。</li>
	<li>クエン酸ナトリウムを含む抗凝固チューブに集めた眼瀉血により、健康なBALB/cマウスから全血を採取します。ボルテックスし、1509 x g で15分間遠心分離して、赤血球を取得します。</li>
	<li>赤血球をPBSで2〜3倍洗い流し、PBSで10%赤血球溶液を調製します。</li>
	<li>各種ALGMSの調製:実験群には各マイクロスフェアに500μL、ポジティブコントロール群には超純水(ddH2O)1mL、ネガティブコントロールグループにはPBS溶液1mLを摂取し、それぞれに20μLの血球溶液を混合します。</li>
	<li>サンプルを37°Cで4時間インキュベートし、1509 x gで15分間遠心分離します。上清を脇に置いて、溶血後の各グループの赤血球を撮影します。</li>
	<li>陽性対照群の溶血率を100%、陰性対照群の溶血率を0%とすると。各グループの上清の吸光度値を測定し、次の式を使用して溶血速度を計算します。 溶血(%)=(各グループの上清の吸光度値- 蒸留水単独の吸光度値)/(ポジティブコントロール群の吸光度値-蒸留水のみの吸光度値)×100</li>
</ol>7. 細胞生体適合性試験
<ol><li>さまざまなALGMS 2xをPBSで洗浄し、5 mLのペトリ皿に15分間入れて、上清を捨てます。</li>
	<li>10% FBSを含む完全培地(DMEM)に0.2 mLで異なるALGMSを別途添加し、37°Cで24時間インキュベートし、溶液をろ過して浸出液を得ます。</li>
	<li>NIH3T3細胞を24ウェルプレートで約70%の細胞密度で培養し、NIH3T3細胞をマイクロスフェア浸出溶液で処理し、さらに24時間完全培地で培養を続けます。</li>
	<li>細胞培養培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄します。</li>
	<li>Calcein-AM/PIアッセイを用いて細胞生存率を評価します。2.5 μL の Calcein-AM 溶液 (4 mM) と 12.5 μL の PI 溶液 (2 mM) を取り、5 mL の 1x PBS に加えてよく混合し、2 μM Calcein-AM と 5 μM PI のワーキング溶液を得ます。</li>
	<li>以前に播種した細胞培養プレートにワーキング溶液をウェルあたり500 μLで加え、光保護下で37°Cで15分間インキュベートし、倒立蛍光顕微鏡で観察および撮影します。グループごとに 3 つのレプリケートを設定します。</li>
	<li>次の式に従って細胞生存率を計算します。 細胞生存率(%)=生存細胞の数/(生存細胞の数+死んだ細胞の数)</li>
</ol>

バイオメディカル用アルギン酸ナトリウムハイドロゲルマイクロスフェアの開発

<ol><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+advances+of+cellulose-based+intelligent-responsive+hydrogels+as+vehicles+for+controllable+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+BiolMacromol%22%5BJournal%5D)">A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system.</a> Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microfluidic+hydrogel+microspheres+for+cell+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct%22%5BJournal%5D)">Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery.</a> Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).</li>
<li>Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pH-sensitive+alginate-based+hydrogel+by+microfluidic+technology+for+intestinal+targeting+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery.</a> Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).</li>
<li>Lei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+hydrogel+microspheres+for+protein+capture+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Design%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing.</a> Mater Design. 215, 110478(2022).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zn2%2B+incorporated+composite+polysaccharide+microspheres+for+sustained+growth+factor+release+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing.</a> Mater Today Bio. 22, 100739(2023).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antibacterial+hydrogels+based+on+sodium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">New antibacterial hydrogels based on sodium alginate.</a> Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).</li>
<li>Olukman Şahin, M., Şanlı, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+5-fluorouracil+release+properties+investigation+from+pH+sensitive+sodium+alginate+coated+and+uncoated+methyl+cellulose%2Fchitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres.</a> Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).</li>
<li>Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+of+hydrogel+microsphere+and+its+application+in+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+dual-adhesive+particles+from+microfluidic+electrospray+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration.</a> Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol-encapsulated+microspheres+prepared+by+microfluidic+electrospray+for+alleviating+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain.</a> Biomater Adv. 149, 213398(2023).</li>
<li>Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+Janus+microcarriers+with+sequential+actives+release+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration.</a> Chem Eng J. 476, 146797(2023).</li>
<li>Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-inspired+lubricated+drug+delivery+particles+from+microfluidic+electrospray+for+osteoarthritis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment.</a> ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-flexible+stretchable+liquid+metal+circuits+with+antimicrobial+properties+through+selective+laser+activation+for+health+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring.</a> Chem Eng J. 482, 149173(2024).</li>
<li>Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+doping+effect+on+the+physicochemical%2C+antimicrobial%2C+and+wound+healing+profiles+of+alginate-based+composite%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite.</a> Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomass+microcapsules+with+stem+cell+encapsulation+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomicro+Lett%22%5BJournal%5D)">Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair.</a> Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK-Cell-Encapsulated+porous+microspheres+via+microfluidic+electrospray+for+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater%22%5BJournal%5D)">NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy.</a> ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).</li>
<li>Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+future+of+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22LOC%22%5BJournal%5D)">Development and future of droplet microfluidics.</a> LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).</li>
</ol>

利益相反は開示されません。

このプロトコルでは、マイクロ流体エレクトロスプレー技術に基づくALGMSの調製方法を紹介します。この方法は操作が簡単で、均一な真円度と制御可能な直径を持つ多数のミクロスフェアが得られます。このアプローチは、研究者に利便性を提供し、ハイドロゲルマイクロスフェアの研究と応用を促進することができます。さらに、異なる金属イオンと架橋することにより、ALGMSの安定性と生理活性が向上しました。抗菌実験では、Cu-ALGMSとZn-ALGMSは有意な細菌抑制効果を示しました。
ハイドロゲルミクロスフェアは、優れた可塑性を持つ柔軟なミクロ構造であり、特定の材料選択と構造設計を通じて効果的な薬物送達を可能にします。アルギン酸は、温和な条件下でゲル化する天然の多糖類で、生体適合性、生分解性、無毒です。ミクロンスケールのアルギン酸ナトリウムマイクロスフェアは、製薬研究、薬物送達、組織工学など、生化学および生物医学で広く使用されています。薬物送達アプリケーションにおけるアルギン酸ナトリウムマイクロスフェアの主な利点は、持続的な薬物放出の能力であり、高濃度の医薬品有効成分を長期間にわたって維持することが保証されます14。私たちの持続的な薬物放出実験により、異なるイオン性架橋を持つALGMSは薬物放出を持続する能力を持ち、薬物送達アプリケーションに使用できることを明らかにしました。
ハイドロゲルマイクロスフェアの一般的な製造方法には、バッチ乳化、機械的粉砕、リソグラフィー、マイクロ流体エマルジョン、エレクトロスプレー8,15などがあります。バッチ乳化および機械的破砕方法の利点は、製造方法の単純さと高い出力効率にあります。しかし、これらの手法を用いて個々のハイドロゲルマイクロスフェアの形状を制御することは困難です。フォトリソグラフィーでは、マスクプレートまたはモールドに光を集束させて架橋を硬化させ、ハイドロゲルマイクロスフェアを形成します。ただし、この方法の生産効率は、マスクプレート、光源、および金型の影響を受けやすくなります。さらに、マイクロ流体エマルジョン法は、ヒドロゲルマイクロスフェアの成形プロセスをより適切に制御し、指定された形状のヒドロゲルマイクロスフィアを製造することができます。しかし、その生産効率は低い16。これらの方法と比較して、マイクロ流体エレクトロスプレー法は、均一なサイズ、規則的な形状、および調整可能な粒子サイズ17のヒドロゲルマイクロスフェアを生成することができます。このプロトコルの重要なステップは、マイクロスフェアの調製です。微小球体のサイズおよび形状は、ガラス管の平坦度、電圧値、および流量18によって異なり得る。また、マイクロ流体エレクトロスプレー技術を使用してミクロスフェアを調製することには、マイクロチャネルが詰まりやすく歩留まりが限られていること、材料の適合性が限られていること、プロセスのスケールアップが難しいこと、プロセスの制御と監視が難しいことなど、いくつかの制限があります。これにより、それらの広範な適用がある程度制限されます19。
要約すると、マイクロ流体エレクトロスプレー技術は成熟したマイクロスフィア調製方法であり、ワンステップ合成の利点を提供します。流路サイズパラメータを最適化し、材料の濃度と流量を制御することにより、さまざまな形態とサイズのミクロスフェアを簡単に取得できます。特に、このプロセスには水相のみが含まれ、追加の界面活性剤は含まれていないため、環境に優しく、操作が簡単で、複雑な洗浄プロセスが不要です。この方法は、アルギン酸ゲル化プロセスと同様に、ハイドロゲル材料からミクロスフェアを生成するための戦略を提供します。

ドラッグデリバリーシステムは、バイオティッシュエンジニアリングの分野における研究のホットスポットであり、ドラッグデリバリーの効率と有効性を向上させ、副作用と副作用を減らすことを目指しています1。これらの系の中で、良好な生体適合性、調整可能な機械的特性、および機能的可塑性を特徴とするハイドロゲルマイクロスフェアは、薬物のローディングおよび送達に最も一般的に使用されるビヒクルの1つです2。これらは、薬物の徐放と制御された放出の両方に使用され、薬物に良好な保護効果を提供し、他の組織における薬物の非特異的影響を回避または最小化し、特定の組織構造への薬物送達を標的とすることができる3。したがって、ハイドロゲルマイクロスフェアは新しく効率的な薬物送達システムになり、この分野の研究が徐々に出現しています4。
ハイドロゲルマイクロスフェアは、通常、多糖類、タンパク質、天然ポリマー5などの生分解性材料から合成されます。その中でも、ALGは海産褐藻6から抽出された生体適合性のある生分解性多糖類である。その分子鎖には遊離ヒドロキシル基とカルボキシル基が含まれており、ほとんどの二価または多価の陽イオンと架橋して、三次元ネットワーク5を持つ水不溶性ヒドロゲル構造を形成することができます。ALGによって形成されたハイドロゲルマイクロスフェアは、中性およびアルカリ性溶液中で負に帯電した高分子電解質に変換することができます。この負電荷間の反発により、ミクロスフェアが膨らみ、カプセル化された有効成分または薬物が放出されます。これらの特性により、ALGマイクロスフェアは、薬物のローディングおよび制御放出7に広く使用されている有望な薬物担体として考慮されるようになりました。
ヒドロゲルマイクロスフェアの調製には、さまざまな方法が存在します。従来のALGMS調製方法には、通常、ゾルゲル法またはエマルジョンゾル法が含まれます。これらの方法は、標的のミクロスフェア8を得るための沈殿、共沈、ゲル化反応などのステップを含む。近年、マイクロ流体技術の継続的な発展に伴い、マイクロ流体エレクトロスプレー法は徐々に効率的で正確なマイクロスフェア調製方法9になりました。この方法は、マイクロ流体技術を利用して、マイクロファインノズルを介してポリマー溶液をエレクトロスプレーし、その後の硬化または架橋プロセス10中にマイクロメートルサイズの液滴およびマイクロスフェアを形成する。従来の方法と比較して、マイクロ流体エレクトロスプレーは、溶液の流量、電圧、微細ノズルサイズ11などのパラメータを調整することにより、マイクロスフェアの粒子サイズと形態を正確に制御できます。また、ミクロスフェアの高速連続調製が可能となり、調製効率が向上し、温和な反応条件が維持されます。また、ALGMSは、放出制御薬や充填触媒など、さまざまな機能を持つように準備することができ、様々な分野での応用が容易です。
ここでは、マイクロ流体エレクトロスプレー法を用いたALGマイクロスフェアの調製に関するプロトコールを紹介します。このプロセスでは、ALG溶液をマイクロ流体デバイスに通し、エレクトロスプレーにかけます。得られた液滴を、異なる金属イオン(Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+)を含む溶液に集めて、架橋反応を開始しました。この反応により、ミクロスフェアの安定性と接着性が向上し、マイクロスフェアにさまざまな機能が付与されます。この方法は簡単に実行でき、合成されたミクロスフェアは、その形態において良好なサイズ均一性を示します。さらに、それらの抗菌特性、緩慢な薬物放出能力、および生体適合性を調査しました。このプロトコールは、さらなる医薬品の開発と生産に役立ちます。

<table><tbody><tr><td>120メッシュスクリーン</td><td>Solarbio、中国</td><td>YA0946</td><td></td></tr><tr><td>アルコールバー</td><td>ナーSolarbio、中国</td><td>YA2320</td><td></td></tr><tr><td>BALB / cマウス</td><td>Wukongバイオテクノロジー、中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchonin酸アッセイ試薬</td><td>Meilunbio、中国</td><td>MA0082</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Lablead、中国</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;粉末</td><td>アラジン、中国</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM/PI</td><td>Biosharp、中国</td><td>BL130A</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>コーニング、アメリカ</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&nbsp; 粉末</td><td>Jnxinyuehuagong、中国</td><td>7758-99-8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibicol、中国</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&nbsp; 粉末</td><td>アラジン、中国</td><td>7705-08-0</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>博多、中国</td><td>HN-FBS</td><td></td></tr><tr><td>ガラス管</td><td>ザルトリウス、ドイツ</td><td>CC0028</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>Evidentscientific、日本</td><td>BX53(LED)</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ流体シリンジポンプ</td><td>Longerpump、イギリス</td><td>LSP01-3A</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3</td><td>HyGyte、中国</td><td>TCM-C752</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>サーモフィッシャー、アメリカ</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水</td><td>サーモフィッシャー、アメリカ</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>サーモフィッシャー、アメリカ</td><td>アクシアChemiSEM</td><td></td></tr><tr><td>アルギン酸ナトリウム粉末&nbsp;</td><td>Bjbalb、中国</td><td>Y13095</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4粉末</td><td>Jnxinyuehuagong、中国</td><td>7733-02-0</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体エレクトロスプレー技術を用いた異なる金属イオンを有する架橋アルギン酸ナトリウムミクロスフェアの調製

Preparation of Cross-Linked Sodium Alginate Microspheres with Different Metal Ions Using the Microfluidic Electrospray Technology

マイクロスフェアはマイクロメートルサイズの粒子で、表面やポリマー内で物理的なカプセル化や吸着によって薬物をロードし、徐々に放出することができます。生物医学の分野では、ハイドロゲルマイクロスフェアは、薬物投与の頻度を減らし、副作用を最小限に抑え、患者のコンプライアンスを向上させる能力があるため、薬物担体としての応用について広く研究されてきました。アルギン酸ナトリウム(ALG)は、3つの骨格グリコシド結合を持つ天然に存在する線状多糖類です。ポリマーの各部分には2つの補助ヒドロキシル基が存在し、これらはアルコールヒドロキシル部分の特性を持っています。合成ALGユニットは、金属イオンとの化学架橋反応を起こし、ポリマースタックの架橋ネットワーク構造を形成し、最終的にハイドロゲルを形成することができます。ハイドロゲルミクロスフェアは、ALGのイオン性架橋特性を含む簡単なプロセスを使用して調製できます。本研究では、マイクロ流体電着法を用いてALGベースのハイドロゲルマイクロスフェア(ALGMS)を作製しました。調製したヒドロゲルマイクロスフェアは、マイクロ流体エレクトロスプレーの流れを正確に制御するため、サイズが均一で十分に分散していました。異なる金属イオンと架橋したALGMSを、マイクロ流体と高電場を組み合わせたマイクロ流体エレクトロスプレー技術を用いて調製し、その抗菌特性、薬物放出遅延能、生体適合性について検討した。この技術は、高度な医薬品の開発・生産への応用が期待されています。

異なる金属イオンと架橋されたALGMSの特性評価 Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、およびFe-ALGMSの光学形態を 図2に示すと、良好な球形度、滑らかな表面、均一な粒度分布(補足図2)、および優れた単分散性を示します。さらに、走査型電子顕微鏡(SEM)とエネルギー分散型分光法(EDS)分析を用いた顕微鏡的評価を行いました。 図3に示すように、ミクロスフェアは一般的に球形で、真円度が明確に定義されていました。Zn-ALGMSの表面は不均一に分布しており、シワが多くざらざらして見えました。エネルギー分散型分光法を行い、ゲル中の架橋反応に関与する金属イオンの含有量分布を決定しました。特に、マイクロスフェアのサイズは、収集距離、ゲル濃度、および電界電圧12などのパラメータを変更することによって調整することができる。概説されたプロトコルでは、マイクロ流体デバイスのパラメータと液体濃度を調整することにより、特定の要件に応じて異なるサイズの粒子を容易に得ることができます。
抗菌特性の評価 図4に示すように、プレート法を使用して、さまざまなミクロスフェアの抗菌能力を評価しました。さまざまなミクロスフェアが大腸菌と黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を示し、Cu-ALGMSとZn-ALGMSが最も強い抗菌特性を示しました。この高い有効性は、金属、すなわち銅(Cu)および亜鉛(Zn)13の抗菌活性に起因する可能性があります。Sukhodubらは、Fe3+、Zn2+、Ca2+、およびCu2+がキトサンと相乗的な抗菌効果を示したが、キトサンを含まないサンプルはそのような活性を示さなかったことを示し、形成された複合体の相乗的な抗菌効果を検証した14。得られた結果は、細菌性感染症の治療において、Cu-ALGMSおよびZn-ALGMSが他のハイドロゲルマイクロスフェアよりも優れているという、この研究と一致しています。
薬物放出特性の評価 BSAをモデル薬物として、さまざまな金属ベースのアルギン酸ヒドロゲルマイクロスフェアからの薬物放出を評価したところ、それらの放出プロファイルの違いが明らかになりました。(補足図3)。イオンは、他の材料よりも優れたゆっくりとした薬物放出能力を示しました。Fe2+ の薬物放出速度は他の3つのイオンよりも比較的速かったのに対し、Ca2+ とZn2+ の薬物放出速度は比較的遅かった。これらの結果は、異なるイオンが薬物放出に及ぼす影響の違いを浮き彫りにしています。我々は、Fe2+ が薬物と相互作用するか、または放出を容易にする方法で結合するのに対し、Ca2+ とZn2+ は薬物により強く結合するか、または放出速度を制限する他の要因があると仮定しています。このヒドロゲルマイクロスフェアからの持続的な薬物放出は、金属とアルギン酸多糖類との間の架橋強度に関連している可能性があります。さらに、BSAと比較したさまざまな金属の吸着能力の違いが、薬物遅延能力に観察された違いに貢献した可能性があります。
生体適合性評価 良好な生体適合性は、臨床応用における薬物送達担体の前提条件です。そこで、 in vitro 溶血試験を用いてミクロスフェアの血液適合性を評価しました。ポジティブコントロールとして純水を使用し、ネガティブコントロールとしてPBS溶液を使用しました。実験結果を 補足図4に示し、懸濁液中の赤血球が異なるマイクロスフェアと接触しても無傷のままであったことを明らかにし、マイクロスフェアによる溶血が最小限であることを示しています。細胞生体適合性の結果は、マイクロスフェアが細胞活性に影響を与えないことを示しました(補足図5)。これらの結果から、ミクロスフェアは良好な血球適合性を有することが示されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig01.jpg"> 図1:アルギン酸ヒドロゲルマイクロスフェアの調製(A)マイクロ流体エレクトロスプレー技術の導入。(B)マイクロ流体エレクトロスプレープロセスのリアルタイム画像。(c)調製したCa2+、Cu2+、Zn2+、およびFe3+アルギン酸ヒドロゲルマイクロスフェア。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig02.jpg"> 図2:アルギン酸ヒドロゲルマイクロスフェア顕微鏡写真。 PBS(pH 7.4)中の(A)Ca-ALGMS、(B)Cu-ALGMS、(C)Zn-ALGMS、および(D)Fe-ALGMSの顕微鏡写真。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig03.jpg"> 図3:走査型電子顕微鏡とエネルギー分散型分光法。 画像は、(A)Ca-ALGMS、(B)Cu-ALGMS、(C)Zn-ALGMS、(D)Fe-ALGMSの特性を示しており、走査型顕微鏡データにはiとii、分光データにはiii-vがあります。画像iii-vはEDSマッピングを示しており、EDSはサンプル表面上の面を選択してスキャンし、領域全体の元素分布情報を取得します。マップスイープモードは、図に示すように、各要素が異なる色で表される材料の組成分析、位相ゾーン分析、および材料の粒度分布のアプリケーションで使用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig04.jpg"> 図 4. ミクロスフェアの抗菌特性。(A) グループの抗菌特性は、細菌塗抹法を使用して試験されました。 (B、C) 各グループの細菌塗抹標本プレートカウント結果の定量化。対照サンプルは、LB培地で増殖したコロニーを添加せずに示しています。他の細菌の相対的なコロニーは、対照群のクローン数を100%とし、それをベースラインとして使用することによって計算されました。エラーバー:標準偏差、n = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:ガラス管は、長いゴム管を介してシリンジに接続されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:粒子サイズ。 (A)Zn-ALGMS、(B)Ca-ALGMS、(C)Cu-ALGMS、(D)Fe-ALGMS。すべてのサンプルに5%のモル濃度を使用しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:薬物放出。 PBS(pH 7.4)におけるCa-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、およびFe-ALGMSの薬物放出曲線。エラーバー:標準偏差、n = 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%203_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図4:Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS、およびFe-ALGMSの溶血アッセイ。 PC(ポジティブコントロール):ddH2O;NC(ネガティブコントロール):PBS。エラーバー:標準偏差、n = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%204_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図5:異なるイオンと架橋されたミクロスフェアの細胞毒性。 Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、およびFe-ALGMSの生体適合性評価を行いました。Calcein-AM/PIを使用してテストを実行し、ここでの結果については、5つの視野をランダムに選択しました。ImageJを使用して、赤血球と死細胞の比率を分析し、相対的な細胞生存率を取得しました。1.PC、ポジティブコントロール、2.NC、ネガティブコントロール、3.Zn-ALGMS、4。Ca-ALGMS、5.Cu-ALGMS、6。Fe-ALGMS、エラーバー:標準偏差、n = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%205_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、薬物担体設計のためのマイクロ流体デバイスを使用して、異なる金属イオンと架橋されたアルギン酸ナトリウムマイクロスフェアの調製について説明しています。これらのマイクロスフェアの抗菌特性とゆっくりとした薬物放出についても調査しました。

Microspheres are micrometer-sized particles that can load and gradually release drugs via physical encapsulation or adsorption onto the surface and within ...

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Research

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