Name: 人間の手に対するCulex tarsalis蚊の調査および摂取行動の研究のためのAC-DC電気浸透学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 学ぶAC-DC電気浸透学を用いたCulex tarsalis蚊の人間への吸血行動と病原体伝播メカニズムの解析手法。この非侵襲的手法は、媒介疾病管理戦略の開発に貢献する。

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蚊の配線手順の先駆者としてオクラホマ州立大学のAstri Wayadande教授に感謝します。また、カリフォルニア州パーリアのUSDA-ARSのElaine Backus博士、フロリダ州ゲインズビルのEPG Technologies Inc.のAndrew Dowell氏には、EPG機器のトラブルシューティングの支援をいただきました。また、蚊を提供してくださったカンザス州マンハッタンのUSDA-ARS昆虫館のダスティン・スワンソン博士とウィリアム・ヤーネル氏、カンザス州マンハッタンのカンザス州立大学のミリアム・ルヒンダさんにも、手続き用ビデオの撮影に協力していただいたことに感謝します。この研究は、カンザス州立大学のIntegrated Molecular Entomology Core(IEMC)へのアクセスによって可能になりました。この研究は、USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement(#58-3022-0-002)およびHatch Multistate Project(NE1943)の支援を受けました。この原稿は、米国カンザス州マンハッタンにあるカンザス州立大学カンザス農業試験場からの寄稿番号24-194-Jです。

Non-invasive Electropenetrography to Study Mosquito Probing Behaviors

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著者には開示すべき利益相反はありません。この出版物での商品名または市販製品の言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、米国農務省による推奨または承認を意味するものではありません。このレポートの結論は著者のものであり、必ずしもUSDAの見解を表すものではありません。

AC-DC EPGを使用する場合は、ハードウェアとソフトウェアの動作30の基本的な理解を持ち、機器の損傷を避けるために、ここに記載されているプロトコルに注意深く従うことが重要です。最も注目すべきは、ファラデーケージに接地されていない限り、ヘッドアンプがオンになっているときにヘッドアンプに触れないようにすることです。ファラデーケージの中でできるだけ遠くまで録音することをお勧めします30。周囲の電気ノイズが過剰な環境で記録しない限り、解釈可能な波形を得るためにケージのドアを必ずしも閉じる必要はありません。ファラデーケージには電動のものは何も入っていません。ファラデーケージ自体が適切に動作するには、ヘッドアンプのみを介して電気的に接地する必要があることに注意することが重要です。これは、ヘッドアンプを金属製の実験用スタンドに接続し、塗装をスタンドの片足から研磨して、ファラデーケージによって捕捉された電気が実験用スタンドに流れ、ヘッドアンプの金属ケーシングに流れ込み、コードを下ってコントロールボックスに流れ込むことによって達成されます。 電源を介して適切に接地された壁のコンセントに、および建物の地面30を通って地球に。マルチメーターを使用して、さまざまな点間の抵抗率 (導電率の逆数) を測定することにより、ケージ内のコンポーネント間の接続の品質を確認できます。ワイヤレスAMラジオをファラデーケージ内に配置して、ドアを閉めたときに音が大幅に減少(または理想的には除去)されることを確認し、ファラデーケージが空中電気信号を適切にキャプチャしていることを確認することもできます(E. Backus per. Comm.)。
使用可能な記録を得るには、銀接着剤の適切かつ標準化された準備と昆虫への記録電極の取り付けが重要です。昆虫キューティクルは絶縁体であり、銀接着剤がキューティクルの細孔に十分に浸透して、昆虫の内部から前胸板30の表面の金線に電気が伝わる経路を作成しない場合、コンデンサとして機能します。各 EPG セッションの前に同時に銀接着剤を準備し、チューブから新鮮な銀接着剤を使用し、配線手順中に頻繁に激しくボルテックスされた銀接着剤と交換します。金のループが胸部に対して配置されていることを確認して、ループ全体がキューティクルに接触し、片側に傾いたり、銀の接着剤と鱗の厚い層で分離したりして、強力な電気接続を形成し、蚊の外れやワイヤーからの逃げを防ぎます。
ここで説明するプロトコルは、さまざまな蚊種を扱う場合に最適化する必要があります。特定の節足動物で記録するための最適なEPG設定(Riレベル、電圧、電流タイプ、およびハードウェアゲイン)は、実験的に決定する必要があります12,30。ただし、オフセットを一度調整すると、同様の蚊を扱うときに再調整する必要はありません。Ae. aegypti26 および Cx. tarsalis27 を伴う AC-DC EPG の最適な設定が決定されています。追加の種の波形ライブラリ(表2で定義)は、蚊へのEPGの採用を促進します。また、蚊の種類や麻酔の選択によって摂血行動が異なる影響を受ける可能性があるため、目的の蚊の麻酔を最適化することも必要です。たとえば、Cx. tarsalis は CO2 による 15 分間の麻酔後、4 時間の回復期間を必要としますが、Ae. aegypti の場合、氷による 15 分間の麻酔期間の後、15 分間の回復期間で十分です。しかし、キュレックス足根は低温にさらされても倒れにくいため、回復期間が長いにもかかわらず、主にCO2が使用されています。
AC-DC EPGモニタは、オンラインリソース30,31を確認したり、経験豊富なユーザによるトレーニングを行ったりした後、簡単に使用できますが、いくつかのトラブルシューティングが必要です。当初、著者の蚊プローブのEPG記録には、ワヤダンデらによって観測または報告されていなかった予期しない11Hzのサイン波がプレシグナルにあった26。E. Backusとの協議により、ファラデーケージが干渉するグランドループが問題である可能性が高いことが示されました。下の表から分離するためにゴム足で支えられた大きなアルミニウム製床板にボルトで固定されたアルミニウムフレームに接続された高導電性の銅製スクリーンで構成された新しいファラデーケージ(図1B)は、11Hzのノイズ信号を解決しました(図3C、C')。さらに、EPG 電源を最初にオンにしたときに、整流前および整流後の信号が、直線で滑らかで細い線ではなく、太くてぼやけた線として表示されることがありました。これは通常、楽器の電源を切り、すべてのコード接続を確認することで修正されました。それが失敗した場合は、通常、機器のプラグを1〜3分間抜くと効果的でした。ごくまれに、動作中に事前信号と事後信号が太くあいまいになることがありますが、これは、機器の電源を切って別のコンセントに差し込むか、電圧レギュレータとパワーコンディショナーを使用してEPGを壁に接続する前に差し込むことで対処しました。理想的には、EPG モニターの専用ラインは、EPG30 と同じ電気回路に接続された冷蔵庫やその他の機器から発生するライン ノイズを排除します。
現在、蚊の研究に EPG を使用することには、主に 2 つの制限があります。まず、どのプロービング挙動が波形に対応するかを検証するための相関研究はほとんど行われていません。各波形ファミリー(表1)および一部の波形タイプ(M1およびM2)で何が起こっているかについては強力な仮説がありますが、血液摂取が波形ファミリーM26,27と相関していることを除いて、これらの仮説は実験的に確認されています。最も重要なことは、多くの病原体が唾液中に伝染するため、唾液分泌イベントに対応する波形を特定する必要があります。治療グループ間の波形の持続時間と数の有意な違いを有意義に解釈するには、EPG 波形と蚊の生物学的活性との相関関係が必要になります。次に、EPG 中のプロービングおよび取り込み率は、予想よりもはるかに低くなる可能性があります27。蚊を短いワイヤーに個別につなぎ、宿主に直接置くと、探査や摂取行動に影響を与える可能性のある長距離の宿主探索行動や社会的摂食行動を防ぐことができます。正しく配線された昆虫は、正常に歩いたり飛んだりすることができます。それでも、蚊はワイヤーに引っ張られることが多く、時には絡まったり、不自然な角度で体を保持したりすることがあり、ワイヤーで接続されていることが蚊の行動にある程度影響を与えることを示しています。著者らは、EPG中のプロービング率を高めるための多くの戦略をテストし、蚊を一晩絶食させ、高齢者を使用し、手に置く直前に人間の息にさらし、人間の唾液を手に塗布することが最も効果的であり、蚊がプローブするのに理想的な位置にあることを確認するために、手の位置を常に微調整する宿主を使用した27。
これらの制限にもかかわらず、AC-DC EPGには、プロービングおよび摂取挙動を研究するための他のアプローチに比べて多くの利点があります。BiteOScope11、flyPAD15、および自動生体材料プラットフォーム14 などのシステムは、血液供給中のプロービングおよび摂取行動と唾液分泌物を定量化するように設計されており、正常な宿主組織システムと宿主の手がかりを欠いている透明な人工基質と流動食を利用しています。これらの合成プラットフォームは多くの実験目的に役立ちますが、AC-DC EPGの明らかな利点は、自然宿主システム内でこれらの節足動物の行動と関心のある変数を研究できることです。さらに、AC-DC EPGシステムのユーザ定義の適応性は、他のEPG機器22,33およびEPGのような電子監視デバイス16,21よりも追加の利点を提供しますが、これらは、最大量の情報で波形を取得し、広範囲の宿主および節足動物への悪影響を最小限に抑えるために必要な調整可能なRiレベル、電流タイプ、および電圧レベルを有しません22、23.筋電図検査 (EMG) 技術は、血液供給の研究にも使用されます。しかし、電気回路は通常、節足動物のみを含み、記録電極に最も近い筋電位のみが記録されるため、波形は、細胞の破裂、スタイレットの位置と活動、口器を通るストリーミング電位など、宿主と昆虫の界面で発生する詳細な活動に関する情報を提供しません28,34.生体内顕微鏡技術を使用して、生体宿主組織における詳細な口器の動きと活動を直接視覚化することができますが、これらの技術には、生きた動物モデル9での侵襲的処置が含まれます。AC-DC EPGモニターのみが、侵襲的な処置を必要とせずに、生きた不透明な宿主組織で発生するプロービング、摂取、および唾液分泌行動について非常に詳細な情報をリアルタイムで提供でき、さまざまな節足動物での使用に適応できます10,12。
これは、蚊の配線、昆虫吸引器の構築、およびヒト宿主に対する EPG の実行に関する最初の詳細な段階的な手順です。これらのプロトコルは、人間の宿主を餌とする蚊に対する AC-DC EPG の採用を促進することが期待されています。AC-DC EPGを用いた将来の研究の例としては、血液摂取前のプロービング行動のステレオタイプなシーケンスの同定、口器を通る血流の調査、節足動物種/発達段階間の摂食可塑性の比較など、血液摂食と宿主組織損傷の基本的なメカニズム10に関する研究が含まれる可能性がある26.EPGは、殺虫剤、摂食防止剤、忌避剤の効果を定量化するためにも使用できます12。AC-DC EPGを使用して人間の手に付いた蚊を研究するためのここで紹介する手順は、これらの研究を加速し、蚊の血液摂食者の生物学に関する新しい洞察を可能にします。

蚊は、病気の媒介者や迷惑な害虫としての役割により、世界中で苦しみと経済的損失を引き起こしています1.ハマダラカはマラリアを媒介し、世界中で年間推定2億1,900万人の症例、40万人以上の死者2、120億米ドルの直接費用3を引き起こしています。ネッタイシマカは、ほぼ全世界に存在し、チクングニア熱、デング熱、リンパ系フィラリア症、リフトバレー熱、黄熱病、ジカ熱などの感染因子を持ち、命を奪い、医療システムを圧倒し、慢性的な苦痛、生涯にわたる罹患率、および障害をもたらすため、公衆衛生上の重要性の最も顕著な媒介者です4,5。さらに、Culex蚊は、馬脳炎、日本脳炎、リンパ系フィラリア症、セントルイス脳炎、および西ナイル熱の病原体を媒介し、人間と動物の健康の両方に影響を与えます3,4。
殺虫剤ベースのアプローチによるベクターコントロールは、ベクター媒介性疾患をグローバルに制御するための主要な方法です6,7.しかし、蚊の駆除に利用できる殺虫剤の数は限られています。さらに、殺虫剤耐性は多くの種、特にネッタイシマカで進化しており、ベクター媒介性疾患と戦う能力に影響を与え、新しい防除戦略の必要性を推進しています6,8。蚊の生物学、蚊と宿主と病原体の相互作用、および病原体の伝播を調節するプロセスについての理解を深めることで、ベクター制御のための新しいツールの開発を促進することができます6。
宿主組織におけるプローブと摂取の挙動は、病原体の伝染と疾患の病理に影響を与える可能性があります9,10,11,12.例えば、ネッタイシマカが破裂した血管の外側に溜まった血液ではなく、毛細血管から直接栄養を与えた場合、より多くのミクロフィラリアが摂取されました13。したがって、このトピックに関する基礎研究と応用研究は、蚊の制御戦略や病原体伝染に対するその他の対策の開発、改良、評価に役立ちます。しかし、宿主の皮膚の表面下で発生する不可解な給血行動の詳細には、これらの行動がしばしば生きた動物モデルに対する侵襲的な手順を必要とするか、透明な人工基質や流動食を使用するため、大きな知識のギャップが存在します9,11,14,15.非侵襲的電気浸透法(EPG;電気浸透グラフとも呼ばれる)技術は、植物病原体の伝染、宿主植物の抵抗性、および殺虫剤の作用機序に関連する植物摂食昆虫の摂食行動を研究するために使用されてきました。なぜなら、研究者は宿主組織内で発生する口の動きや行動を間接的に観察、記録、定量化できるからです10,12。
1950年代以降、蚊を含む給血節足動物に電子侵入監視技術が適用されてきました。16,17,18,19,20.しかし、EPGは、波形に対応する生物学的活性が検証されなかったため、採血節足動物に広く採用されることはありませんでした21。さらに、初期の機器の設計と電子機器は、一部の電気信号の過度な強調、高いノイズ対信号比、波形の低分解能と歪み、および脊椎動物の宿主に刺激をもたらしました12,22。より新しい機器であるAC-DC EPGモニター23は、変数設定と改善された信号処理を備えているため、採血節足動物の記録や、実験的相関研究での波形の生物学的起源の解読に適しています10,12。
EPGの場合、電気信号は基板電圧プローブ(つまり、参照電極)を介してホストに印加されます。節足動物は記録電極に取り付けられ、宿主に配置されます。節足動物がマウスパーツ(スタイレット)をホストに挿入すると、電気信号はAC-DC EPGモニタに伝達され、信号処理されます。電気信号は、口の部分の動き、摂取、唾液分泌、病原体の獲得/接種などの特定の行動に対応する「波形」としてコンピューターに表示されます10,12。波形の持続時間と数に関連する逐次応答変数と非逐次応答変数24,25 で、波形の周波数と持続時間に基づいて計算し、種内および種間で発生する摂食行動、および生物的および非生物的要因に応答して発生する摂食行動についての洞察を得ることができます。 宿主、病原体、農薬、環境条件など10,12.
これまで、AC-DC EPGモニターは、人間の手を食べるAe. aegypti26およびCulex tarsalis27の蚊、およびウシの子牛を食べるDermacentor variabilisおよびAmblyomma americanumのダニ28のプローブおよび摂取行動を特徴付けるために使用されてきました。さらに、この装置を使用した病原体研究を容易にするために、EPG29のマウスモデルが最近開発されました。人間の手は、蚊のプローブやその他の行動をいつ感じたかを人間のホストが報告できるため、最初の蚊の波形特性評価に最適です。これにより、波形と行動の相関が容易になります(表1)。さらに、さまざまなヒト集団の蚊の摂食行動の可塑性をよりよく理解することで、蚊と蚊が媒介する病原体に対するより専門的な管理介入の開発に貢献できる可能性があります。
表1:AC-DC EPGを使用して人間の手でCulex tarsalisから記録された電気信号を分類するために使用される波形ファミリの説明。 各波形ファミリーに対応するプローブフェーズと生物学的活性。詳細については、Cooper et al.27 を参照してください。略語:AC =交流、DC =直流、EPG =電気透過計。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/Table1_31July2024.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
蚊の生物学と宿主とベクターの相互作用を研究するためのEPGの使用を容易にするために、AC-DC EPGモニターを使用して人間の手に対するCx. tarsalis蚊の摂食行動を定量化する方法論がここで提示されます。これらのプロトコルは、オンライン リソースで説明されている基本的な AC-DC EPG 手順に基づいています30 は、ユーザーが AC-DC EPG および関連ソフトウェア31 に関する基本的な実務知識を持っていることを前提としています。概説されている手順は、他の蚊や宿主種に合わせて変更でき、蚊の摂食行動に関する仮説主導の研究を促進するための基盤を提供します。
表 2: 一般的な AC-DC EPG 用語の定義。 定義は、オンラインリソースに記載されているものに基づいています30,31および科学文献32。略語:AC =交流、DC =直流、EPG =電気透過計。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/66877_Table 2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

人間の手に対するculex tarsalis蚊の調査および摂取行動の研究のためのac-dc電気浸透学

AC-DC Electropenetrography for the Study of Probing and Ingestion Behaviors of Culex tarsalis Mosquitoes on Human Hands

蚊は、人間や動物の健康に悪影響を及ぼす病原体を媒介します。蚊の採血生物学や宿主や病原体との相互作用について理解を深めることで、蚊が媒介する病気を制御するための新たな標的を開発できる可能性があります。残念ながら、蚊のプローブ(つまり、刺す)行動は、宿主組織内で発生するため、よく理解されていません。ここでは、AC-DC電気浸透法(EPG)を使用して、人間の手でプローブして摂取するときに生成される電気信号の変化を記録することにより、蚊の摂食行動を間接的に視覚化および定量化するための非侵襲的な手順について説明します。細い金線を導電性の銀接着剤を使用して蚊に取り付け、EPG装置に接続します。人間の宿主は、基板電圧プローブを手に持っています。有線の蚊による宿主のプローブにより、電気回路が完成し、電気信号は「波形」としてコンピューターに記録され、分析のために測定および列挙できます。この方法論は、ネッタイシマカとネッタイシマカの探索と摂取行動を特徴付けるために使用されており、他の蚊種にも適用できます。EPGは、病原体、殺虫剤、およびその他の要因が蚊の摂食行動に及ぼす影響を研究するために使用できます。

ヒトの手に対するCx. tarsalis蚊の吸血に関するAC-DC EPG記録（図4）により、解析および出版に適した解釈可能な波形が得られた27。波形レビューソフトウェアにおいて、圧縮（表2で定義）およびソフトウェアゲインを調整すると、解釈可能な波形には、波形ファミリー（表1および図4）、タイプ、およびサブタイプに分類可能な、明確で区別可能な繰り返しパターンが含まれていた27,31。ヒトの手を吸血するAe. aegyptiにおいて以前に記述されたすべての波形ファミリー（J、K、L、M、N）およびタイプ（L1、L2、M1、M2）26が、ヒトの手を吸血するCx. tarsalisによって生成された波形においても同定され、本手法の妥当性が検証された。さらに、3つの新しい波形タイプ（M3、N1、N2）およびL1、L2、M1、M2の多数のサブタイプが同定された27。加えて、口器が宿主から引き抜かれた際のベースラインへの電圧降下を、波形ファミリーWと命名した27。
ここに概説した手順に従い、機器の設定（電流タイプおよびRiレベル）を系統的に変化させることで、Cx. tarsalisの人手への吸血を記録するための最適設定、各波形の電気的な起源、蚊1匹あたりの完全および不完全なプローブの平均持続時間（秒）の決定、ならびに設定間における昆虫1匹あたりの波形持続時間（秒）（WDI）、昆虫1匹あたりの波形イベント数（NWEI）、および昆虫1匹あたりのイベントごとの波形持続時間（秒）（WDEI）の統計的比較が可能となった27。また、異なる波形が出ている最中に蚊の吸血を中断させ、解剖を行うことで、どの波形が血液摂取と相関しているかを特定した27。同様の調査を、同等の手法を用いてAe. aegyptiに対しても実施した26。
EPGは感度が高く複雑な性質を持つため、すべての記録が図 4に示されているものほど鮮明であったわけではありません。ピークオーバー（図 3A,C）、ハードウェアゲインの変動（図 3A,C）、不適切な配線（図 3B）、波形Jにおける整流器のフォールドオーバー（図 3C,C'）、および電気的ノイズ（図 3C,C'）によって、時折波形が歪んだり遮られたりし、出版品質の図に使用するには不適切であり、スコアリングや解析を困難にさせました。したがって、配線技術の習熟、ゲインと電圧設定の最適化、オフセットの調整、および電気的ノイズの制御など、事前の準備が推奨されます。興味深いことに、整流器のフォールドオーバーはCx. tarsalisの波形ファミリーJでのみ観察され（図 3C,C'）、一度オフセットを調整すると、他の蚊の種（Ae. aegyptiおよびCulex quinquefasciatus）を用いた場合でも再発しませんでした（データ未掲載）。さらに、トラブルシューティングの結果、図 3（パネルCおよびC'）に示されている制御不能な電気的ノイズは、ファラデーケージの欠陥に起因していたことが判明しました。欠陥のあるファラデーケージで行われた記録も依然として使用可能でしたが、改良したファラデーケージを製作したことでノイズの問題は解決されました（図 1B）。
あらゆる予防措置とフロントエンドの最適化を講じたとしても、蚊への電極装着品質のわずかな変動や、信号を歪ませし、信号対雑音比（S/N比）を変化させるその他の未知の要因により、信号が可視範囲内にあり、各波形のピーク分解能が波形の同定および特性評価に十分であることを保証するため、記録途中でハードウェアゲインを調整する必要が定期的に生じました。残念ながら、記録途中でハードウェアゲインを調整すると、急激な電圧シフトが発生する場合があり（図 3A, C）、その波形は出版には不適切となりますが、測定および解析には（全体または一部において）依然として使用可能です。
<img alt="力の分析を示す静的平衡図。グラフはΣFx=0、ΣFy=0の式を強調している。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66877/66877fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="図 4"> 
図 4: 人の手に配置したCulex tarsalisプローブから、印加信号 250 mV AC、Ri 107 Ω で記録した代表的な波形。各パネルの上部に科レベルの（NP, J, K, L, M, W）波形名が示されている。下段のパネルは、パネルAの特定領域の拡大図である。挿入パネルは、指定された領域の拡大図である。時間スケールとソフトウェアゲインは、(A) 7.0 s/div, 16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 s/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x である。略語：AC = 交流, Ri = 入力抵抗, mV = ミリボルト, Ω = オーム, s/div = 1目盛りあたりの秒数。この図は Cooper et al.27 のデータを用いて作成された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66877/66877fig04large.jpg" target="_blank">こちらのリンクから、この図の拡大版を表示してください。</a>

AC-DC電気浸透学を使用して、人間の手に対するCulex tarsalis蚊の調査と摂取行動を研究するための手順が説明されています。

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