Name: マウスにおける幼少期の逆境のモデルとしての限られた寝具と営巣 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: 学ぶ限られた寝具と営巣モデルを用いたマウスの幼少期逆境実験法。この神経科学的手法は、ミクログリアとストレス感受性ニューロンの役割を解明し、後の精神疾患リスクメカニズムを理解するのに役立ちます。

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この研究は、NIMH K99/R00 Pathway to Independence Award #MH120327、Whitehall Foundation Grant #2022-08-051、NARSAD Young Investigator Grant #31308 (Brain & Behavior Research FoundationおよびThe John and Polly Sparks Foundation)の支援を受けました。著者は、ジョージア州立大学の動物資源部門が動物に卓越したケアを提供してくれたこと、そしてライアン・スリースがビデオ管理システムのセットアップと保守に優れた技術サポートを提供してくれたことに感謝します。ボルトン博士はまた、タリー・Z・バラム博士がポスドクフェローシップ中にLBNモデルの適切な実装に関する優れたトレーニングを提供してくれたことに感謝したいと思います。

限られた寝具とネスティングを使用したマウスの幼少期の逆境のモデル化

著者には利益相反はありません。

この記事では、マウスにLBNモデルを適用するための詳細なプロトコルを提供します。このモデルは、幼少期における慢性ストレスの病理学的および翻訳的に関連する形態が、子孫の神経精神障害の発症にどのように寄与するかを理解するための重要なツールである13。また、母親の行動や母親の脳の変化を分子、神経内分泌、または回路ベースの視点から研究するのにも有用です24。このような質問では、多文化性がより重要な変数となる可能性があります。母親の行動エントロピースコアは、同じダム内の複数の同腹児にわたって一貫していることが観察されており(図2C)、エントロピーが各ダムにとってある程度安定した形質である可能性があることを示唆しています。この知見は、高価なまたは希少なトランスジェニックマウスの場合のように、未経産の雌のみを使用することが不可能な場合に、多経産の雌マウスの使用を正当化する可能性がある。多産性が他の変数(子宮内環境など)に意図しない影響を与える可能性があるため、実験者はデータ分析中に多経産の女性の使用を統計的に制御することをお勧めします。
このモデルは環境障害に非常に敏感であることに注意することが重要です。複数の要因が動物を混乱させ、ケージの浸水や近くの建設物などの大きな音など、問題や最適でない結果を引き起こす可能性があります。通常、これらの障害は対照動物にストレスを与えるため、対照動物とLBN条件の間に違いはありません。これらの問題の指標は、P10でのコントロールとLBNの子犬の同様の重みと、母親のケア行動における同様のエントロピー値である可能性があります。このため、理想的なセットアップは、この目的のためだけに使用され、静かでコロニーや他の研究所の人員から離れた母体ケアルームです。攪乱は、特にP75より若い母犬の子犬の共食いにもつながる可能性があります。共食いで子犬を失うリスクは、P75以降のダムで、多くの場合、最初の同腹児の後に低くなります。この方法の代替バージョンは、カニバリズムのリスクをさらに減らすために、実験的操作のタイミングをP4-P11にシフトする25,26;ただし、現在の実験室条件ではこれは必要ありません。LBNの別のバージョンは、メッシュディバイダーを採用していませんが、それでも離乳前の出生後期間全体について寝具と巣材の量を制限します27。タイムラインを変更すると、虐待的な母親の行動など、異なる結果につながる可能性があり、その結果、不安のような行動などの異なる子孫の結果が生じる可能性があることに注意することが重要です25,28。その他の一般的な問題には、カメラアングルと大きな巣のサイズによる母親の行動データの喪失が含まれます。これを助けるために、ケージの後ろに鏡を置き、巣が大きくなりすぎて子犬がカメラから隠されるのを防ぐために、制御条件で単一の巣のみを提供することをお勧めします。最後に、子犬が動けなくなったり怪我をしたりしないように、メッシュがケージに適切に収まるようにすることが不可欠です。
LBNモデルの利点は、簡単にカスタマイズでき、他の実験要因と組み合わせることができることです。このプロトコルに追加できる変数の例としては、食事29,30、免疫チャレンジ30,31、異なるトランスジェニック系統32,33、および化学遺伝学19があります。さらに、このモデルの一部のバージョンは、P10-P17時間枠を採用し、それを母体分離(MS)34,35,36と組み合わせます。このパラダイムは、出生前のストレッサーとしても適応されており、E14からE1937,38までのLBN環境にダムが収容されていますが、子犬がストレスに直接さらされることは決してありません。最後に、一部の研究では、ELAと組み合わせた2ヒットモデルを使用し、子孫が成人期に達したときにさまざまなストレステストを行います19,39。
この方法の制限の 1 つは、スループットが高くないことです。生成されるデータの量は、一度に利用可能なカメラの数とスペースによって制限されますが、同腹児は時間の経過とともに簡単にずらすことができます。母親の行動の手動採点は特に時間がかかり、観察者バイアスを引き起こす可能性がありますが、機械学習ベースのアプローチの出現により、自動採点は現在開発されています40。データを手動で採点する場合は、観察者間のばらつきを減らすために、同じ人が 1 つの実験のすべてのビデオを採点することをお勧めします。また、このモデルは主に母親のケアに依存するげっ歯類向けに設計されているため、両親ケアの研究が難しいという制約もあります。しかし、一部のグループは、カリフォルニアマウス41,42などの双親種でMSの代替として父性剥奪を採用しているため、LBNもこれらの種に適応できると考えられます。
LBNは別として、母親の分離はELAの他の最も顕著なモデルであり、なぜなら、成体に用いられる他の形態のストレス(すなわち、拘束ストレス)は動物性論的に関連性がなく、子犬に同じように影響を与えないからである。LBNは、断片的で予測不可能な母親の行動を誘発する慢性ストレスの一種であるという点でMSとは異なりますが、MSでは、剥奪は断続的であり、通常は毎日予測可能な時間に発生します43。興味深いことに、どちらのモデルもげっ歯類のHPA軸の変化および抑うつ様行動を引き起こす可能性があるが、LBNは、実験者の相互作用が少なく、実験室間での一貫性が高い、より再現性の高いプロトコルである可能性がある1,11,13,16。このプロトコルは、一部の変動要因(実験者関連など)を軽減するのに役立ちますが、動物施設の違い、動物の起源、系統など、他の側面が結果に影響を与える可能性があります。例えば、BALB/cマウスは、C57BL/6J27,44よりも慢性的な拘束ストレスに対してより顕著な反応を示し、ELAに対して異なる感受性を有する可能性があることが知られている。
結論として、LBNモデルは、予測不可能な母親のケアを伴う低リソース環境を採用しており、ストレスへの生理学的適応、母親の行動、脳の発達など、幼少期のストレスがさまざまなプロセスにどのように影響するかを理解するための有用なアプローチです。特に、このモデルは、ELAが神経精神障害の危険因子である方法と理由を理解するために採用されています1,5,9,12。将来的には、LBNの使用により、心疾患と身体障害の両方の生物学的基盤の理解が深まり、敏感な周産期のストレスの影響を治療するための新しい治療標的の解明に役立ちます。

出生後早期は、環境の影響が発達の軌道を変える可能性のある重要な発達の窓です。例えば、幼少期の逆境(ELA)は、脳の発達を変化させ、認知機能や感情機能に長期的な変化を引き起こす可能性があります。ELAの例としては、身体的または感情的な虐待、ネグレクト、不十分なリソース、および小児期または青年期に発生する予測不可能な家庭環境が含まれます1。ELAは、うつ病、物質使用障害、心的外傷後ストレス障害(PTSD)、不安などの障害を発症する危険因子であることが知られています2,3,4,5。これは、米国における子供の貧困レベルが最近、2021年の5.2%から2022年の12.4%へと2倍以上に増加していることを考えると重要です6、また、貧困自体が必ずしもELAではないものの、さまざまなタイプのELA7が発生する可能性を高めています。
動物モデルは、幼少期のストレスが脳の発達と成人の転帰に及ぼす影響を理解するために長い間不可欠でした。この現象を解剖するために近年使用されている2つの主要な動物モデルは、母性分離(MS)と、限られた寝具および営巣材料によって引き起こされる貧困環境(LBN)です。MSは、親の剥奪のモデルとして開発されました8。その中で、げっ歯類のダムは、離乳するまで毎日数時間、通常は数時間、子犬から連れ去られます。MSパラダイムは、成人期にうつ病や不安のような行動を引き起こすことがわかっています9、および慢性ストレス10,11に対する異常な反応をもたらします。一方、バラム研究所12で最初に開発されたLBNモデルは、ダムを子犬から分離するのではなく、子犬が育てられる環境を変更し、低資源環境12,13を模倣している。このモデルでは、ネスティング材の量を減らし、寝具に直接アクセスできないようにすると、ダムからの母親のケアが中断されます3。認知的および感情的な脳回路の適切な発達には、堅牢で予測可能な母親のケアが必要であるため14、LBNによる断片化された母親のケアは、視床下部-下垂体-副腎(HPA)軸の過活動、複数の脳領域における興奮性抑制性バランスのシフト、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)レベルの上昇、および子孫の抑うつ様行動13を含むさまざまな結果をもたらす可能性があります。15、16、17、18、19。
ELAが神経精神疾患のリスクを増加させる正確なメカニズムは完全には理解されていません。これは、HPA軸回路19,20の変化に関連していると考えられており、最近の証拠は、これがミクログリアシナプス刈り込み19の変化によって引き起こされる可能性があることを示しています。LBNモデルは、周産期環境が脳の発達と長期的な行動結果に与える影響を理解するための重要なツールであることが示されています。このモデルは当初、ラット用に開発されたが、既存のトランスジェニックツール12,13を利用するためにマウスにも適合されている。特に、このモデルは両種で非常に類似しており、HPA軸の変化、認知障害、抑うつ様行動など、非常に収束的な結果を引き起こし、その種間有用性と翻訳の可能性を強調しています。この記事では、マウスで制限付き寝床とネスティングモデルを採用し、母親の行動と子孫の結果を収集および分析して、モデルの有効性と期待される結果を検証する方法について詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>2 インチ 4 MP 4x ズーム IR ミニ PT ドーム ネットワーク カメラ</td><td>Hikvision</td><td>DS-2DE2A404IW-DE3(S6)</td><td></td></tr><tr><td>Amazon Basics アルミ ライト写真三脚スタンド ケース付き - 2 個パック、2.8 - 6.7 フィート、3.66 ポンド、ブラック</td><td>アマゾン</td><td></td><td>アマゾン ブルー</td></tr><tr><td>アイリス</td><td>ブルー アイリス セキュリティ</td><td></td><td>オプションのビデオ管理ソフトウェア</td></tr><tr><td>CAMVATE 1/4 "-20ミニボールヘッド、CCTV用天井マウント付き&ビデオウォールモニターマウント - 1991</td><td>Camvate</td><td></td><td>アマゾンから</td></tr><tr><td>トウモロコシの穂軸の寝具</td><td>アンダーソンズ</td><td>4B</td><td></td></tr><tr><td>コットン nestlet</td><td>Ancare NES3600</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メッシュ ディバイダー</td><td>マクニコール</td><td>ズ 4700313244</td><td>標準、アルミニウム、合金 3003-H14、3/16" No. .032 標準 (隆起)、70% オープン エリア</td></tr><tr><td>Tendelux DI20 IR イルミネーター</td><td>Tendelux</td><td></td><td>からアマゾン</td></tr></tbody></table>

マウスにおける幼少期の逆境のモデルとしての限られた寝具と営巣

Limited Bedding and Nesting as a Model for Early-Life Adversity in Mice

虐待、ネグレクト、リソースの不足、予測不可能な家庭環境などの幼少期の逆境(ELA)は、うつ病などの神経精神障害を発症する既知の危険因子です。ELAの動物モデルは、慢性的なストレスが脳の発達に及ぼす影響を研究するために使用されており、ヒトを含む哺乳類の早期の経験の主要な源泉である母親のケアの質や量を操作することに依存しているのが一般的です。ここでは、マウスにLimited Bedding and Nesting(LBN)モデルを採用するための詳細なプロトコルを提供します。このモデルは、低資源環境を模倣しており、重要な発達期間(出生後2〜9日目)に、子犬の巣を作るためにダムに与えられる巣材の量を制限し、ケージ内のメッシュプラットフォームを介してマウスを寝具から分離することにより、断片的で予測不可能な母親のケアのパターンを引き起こします。代表的なデータは、LBNモデルから生じる母親の行動の変化、子犬の体重の減少、および基礎コルチコステロンレベルの長期的な変化を示すために提供されています。LBN環境で育てられた子孫は、成人すると、異常なストレス反応、認知障害、および無快感症のような行動を示すことが示されています。したがって、このモデルは、ストレス感受性脳回路の成熟がELAによってどのように変化し、精神障害に対する脆弱性を与える長期的な行動変化をもたらすかを定義するための重要なツールです。

代表的な結果は、LBNケージの劣悪な環境によって課せられたELAが、母体からの母親のケアと子孫の生理学的結果にどのように影響するかを示しています。母親のケア行動における毎日のエントロピーは、P3-P6の日間でLBNで高くなります(F1,58 = 7.21、 p = 0.0094; 図2A)、およびこの期間の各ダムの平均エントロピー(t15 = 3.03、 p = 0.0085; 図 2B)。注目すべきは、同じ処理群内で維持された場合、同じダムの異なる同腹仔間で平均エントロピー率に有意差がないことです(F1.699,4.247 = 0.57, p = 0.58; 図2C)、エントロピー率が各ダムについていくらか安定した形質である可能性があることを示唆しています。すべての行動の中で、舐めたりグルーミングしたりすることは、LBN3によって最も断片化されることが示されている行動です。LBNダムは、子犬を舐めたりグルーミングしたりする頻度が高いことを示しています(LG)(t16 = 4.04、 p = 0.0010; 図2D)そして短い試合では(t16 = 3.25、 p = 0.0050; 図2E)。しかし、コントロールダムとLBNダムの間でLGの合計持続時間に大きな差はありません(t16 = 1.52、 p = 0.15; 図2F)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66879/66879fig02.jpg"> 図2:母性行動分析 (A) 日次エントロピー率は、LBN(Limited Bedding and Nesting)ダムと同ダム で高い。混合効果モデル(F1,58 = 7.21、 p = 0.0094)によって分析された制御(CTL)。(B)平均エントロピー率は、LBNダム の方が高くなっています。CTL (t15 = 3.03、 p = 0.0085)。(C)平均エントロピー率(P3-P6)は、同じ処理群(F1.699,4.247 = 0.57、 p = 0.58)で維持された場合、同じダム内の複数の同腹仔間で有意差がない。各ラインは 1 つのダムを表します。(D)舐めとグルーミング(LG)イベントの累積頻度は、LGダム の方が高くなっています。CTL (t16 = 4.04、 p = 0.0010)。(E)LGの平均試合長は、LGダム の方が短いです。CTL (t16 = 3.25, p = 0.0050) です。(F)LGに費やされた累積時間は、LBNによる有意差はありません(t16 = 1.52、 p = 0.15)。データはSEM±平均値、* p &lt; 0.05です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66879/66879fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
LBN条件で飼育された仔は、P10で大幅に小さくなります(t61 = 6.30、 p &lt; 0.0001; 図3A)。この差は通常、離乳年齢(t62 = 6.29、 p = &lt;0.0001; 図3B)しかし、成人期にはもはや観察されません(t38 = 1.08、 p = 0.29; 図3C)。ただし、コルチコステロンレベルは成人期のベースラインで増加します(t18.79 = 2.23、 p = 0.038; 図3D)は、LBNの持続的な生理学的効果を示唆している。これらは、実験のセットアップが成功した場合に予想される違いです。最適でないセットアップの場合、LGの試合の長さ、エントロピー、および子犬の重みの値は、おそらく「コントロール」グループにストレスがかかっているため、違いを示さない可能性があります。この論文の目的のために、ここで説明した生理学的結果では性差は通常観察されないため、子孫の結果を分析するときに性別は崩壊しました。ただし、認知行動や感情行動などの他のタイプの結果の性差は、このモデルで一般的に報告されており、さらに調査する必要があります4。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66879/66879fig03.jpg"> (A)限定的な寝具と営巣(LBN)は、標準ケージに戻る直前のP10で測定された子犬の体重を減少させます(t61 = 6.30、p &lt; 0.0001)。(B)離乳年齢(t62 = 6.29、p &lt; 0.0001)でもLBNによって体重が減少します。(C)LBNによる成人の体重の差はなくなりました(t38 = 1.08、p = 0.29)。(D)成人期のコルチコステロンのベースライン濃度は、ウェルチのt検定(t18.79 = 2.23、p = 0.038)によって分析されたように、LBNによって増加します。.すべてのグラフで、女性は円で、男性は三角形で示されています。データはSEM±平均、*p &lt; 0.05です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66879/66879fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、出生後初期の貧困環境と予測不可能な母親のケアによって引き起こされる幼少期の逆境が、脳の発達と精神障害の将来のリスクにどのように影響するかを研究するための動物モデルを示しています。

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