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```html
<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C storage</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>0.1% gelatin in water</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>0.2 &micro;m filter units</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>0.5% trypsin-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7.5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>オプション：エキソヌクレアーゼタグ付きタンパク質をリボソームタンパク質の内因性遺伝子座に挿入する場合</td></tr><tr><td>1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes, autoclaved</td><td></td><td></td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>1.5, 2 mL, and 5 mL protein low-binding microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>10 cm tissue culture plates</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>10x Tris/glycine/SDS running buffer concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>37 &deg;C tissue culture incubator x 2</td><td></td><td></td><td>細胞培養用。1台は主要な細胞培養インキュベーターおよびトランスフェクト細胞の照明用として機能し、2台目はALIBi活性化日のテンポラリスペースとして、主インキュベーター内のトランシリミネータのセットアップ中にトランスフェクト細胞を収容する。</td></tr><tr><td>37 &deg;C water bath</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>50 mM biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>6x Laemmli buffer</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td>消毒用</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>AcTEV protease kit</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>ALIBi C-fragment plasmid</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>トランスフェクション用にはMidi-prepスケールが必要</td></tr><tr><td>ALIBi N-fragment plasmid</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>トランスフェクション用にはMidi-prepスケールが必要</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>ammonium bicarbonate</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>anti-FLAG antibody</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-mouse secondary antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-rabbit secondary antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-Rpl12 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-Rpl31 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-Rpl5 antibody</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-V5 antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (small) or DR196 (large)</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>C18 tips (OMIX C18 tips)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>Cell freezing container</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Centrifuge fitted for 15 mL and/or 50 mL conical tubes</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Centrifuge for 1.5-2 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用。4 Cまで冷却可能、17,000 gまでの速度が可能なこと。理想的には、チューブを出し入れする際に一時的に暗くできる部屋に配置されていること。</td></tr><tr><td>Clarity ECL kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Criterion gel tank</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Criterion TGX pre-cast gels, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>ウェスタンブロット用。追加のウェルサイズとレイアウトが利用可能</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Deoxycholate</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>ES-qualified FBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-009-B</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Gold Shield</td><td>412828</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>459828</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>MilliporeSigma</td><td>A117</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>Fragment size analyzer and consumables</td><td></td><td>Agilent</td><td>オプション：RNAシーケンスライブラリ調製用。Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Freezing media</td><td>ThermoFisher</td><td>12648-010</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis

isolation-subcellular-ribosome-subpopulations-based-on-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ペプチジル- tRNAの初期段階を含むリボソームの生化学的解析への大きな障害は、同じサンプル中の他のリボソーム、解析対象の特定のmRNA配列の翻訳に関与していないリボソームの存在となっています。我々は、排他的に、興味の発生期のペプチジル-...

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mRNA上の翻訳停止部位を同定する技術が記載されている。この手順は、変性ゲル電気泳動を用いた初期のチェーンの大きさの分析に続いて標的mRNAのin...

リボソーム結合した新生ポリペプチドの分離<em&gt; in vitroで</em&gt; mRNAに沿って並進一時サイトを識別するために

ここでは今定期的に安定的に結合したリボソーム新生鎖複合体（のRNC）を分離するために使用される手法について説明します。この手法は、17アミノ酸長いSECM...

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機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。...

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。...

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

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ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。...

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

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選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

プロテオームスケールでのタンパク質の発見と定量に適合する高品質のミトコンドリア単離のための2段階プロトコルを提示します。私たちのプロトコルは遺伝子工学を必要としないため、あらゆる初代細胞や組織からのミトコンドリアの研究に適しています。...

タンパク質の発見と定量を改善するためのミトコンドリアの2段階タグフリー分離

Stanford School of Medicine.  AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)は、リボソームの細胞内集団を標識し親和性を精製し、下流のシーケンスおよびプロテオーム解析のために開発された新しいオプトジェネティック活性化法です。

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

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