Name: 組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-24T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶALIBi法による細胞内リボソームサブポピュレーションの単離技術。光遺伝学的近接標識を用いて、特定の細胞小器官における局在翻訳とリボソーム組成を詳細に解析する革新的な手法を習得できます。

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<table><tbody><tr><td>-80 &deg;C storage</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>0.1% gelatin in water</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-006-B</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>0.2 &micro;m filter units</td><td>Fisher</td><td>04-977-158</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>0.5% trypsin-EDTA (10X)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 7.5</td><td>ThermoFisher</td><td>15567027</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9855G</td><td>オプション：エキソヌクレアーゼタグ付きタンパク質をリボソームタンパク質の内因性遺伝子座に挿入する場合</td></tr><tr><td>1.5 and 2 mL microcentrifuge tubes, autoclaved</td><td></td><td></td><td>トランスフェクション用</td></tr><tr><td>1.5, 2 mL, and 5 mL protein low-binding microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>022431081, 022431102, 0030108302</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>10 cm tissue culture plates</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>72068-100ML</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>10x Tris/glycine/SDS running buffer concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>37 &deg;C tissue culture incubator x 2</td><td></td><td></td><td>細胞培養用。1台は主要な細胞培養インキュベーターおよびトランスフェクト細胞の照明用として機能し、2台目はALIBi活性化日のテンポラリスペースとして、主インキュベーター内のトランシリミネータのセットアップ中にトランスフェクト細胞を収容する。</td></tr><tr><td>37 &deg;C water bath</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9010</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>50 mM biotin</td><td>ThermoFisher</td><td>B20656</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>6x Laemmli buffer</td><td>FIsher</td><td>50-196-784</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td></td><td></td><td>消毒用</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>AcTEV protease kit</td><td>ThermoFisher</td><td>12575015</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>ALIBi C-fragment plasmid</td><td>Addgene</td><td>#235615, 235636 &ndash; 235641</td><td>トランスフェクション用にはMidi-prepスケールが必要</td></tr><tr><td>ALIBi N-fragment plasmid</td><td>Addgene</td><td>#235614, 235635, 235642, 235643</td><td>トランスフェクション用にはMidi-prepスケールが必要</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>ammonium bicarbonate</td><td>MilliporeSigma</td><td>5.3305</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>anti-FLAG antibody</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3165</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5174</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-mouse secondary antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931V</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-rabbit secondary antibody</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934V</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-Rpl12 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab175219</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-Rpl31 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab103991</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-Rpl5 antibody</td><td>ProteinTech</td><td>15430-1-AP</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>anti-V5 antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>R960-25</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>M0398L</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Beta-mercaptoethanol (55 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator</td><td>Clare Research Chemical</td><td>DR46B (small) or DR196 (large)</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>C18 tips (OMIX C18 tips)</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>Cell freezing container</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Centrifuge fitted for 15 mL and/or 50 mL conical tubes</td><td></td><td></td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Centrifuge for 1.5-2 mL microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用。4 Cまで冷却可能、17,000 gまでの速度が可能なこと。理想的には、チューブを出し入れする際に一時的に暗くできる部屋に配置されていること。</td></tr><tr><td>Clarity ECL kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Criterion gel tank</td><td>Bio-Rad</td><td>1656001</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Criterion TGX pre-cast gels, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>5671095</td><td>ウェスタンブロット用。追加のウェルサイズとレイアウトが利用可能</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7698-5G</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Deoxycholate</td><td>MilliporeSigma</td><td>S1827</td><td>溶解 &amp; アフィニティ精製用</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>PIA39255</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>ES-qualified FBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>ES-009-B</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Gold Shield</td><td>412828</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>459828</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>MilliporeSigma</td><td>A117</td><td>オプション：マススペクトルサンプル調製用</td></tr><tr><td>Fragment size analyzer and consumables</td><td></td><td>Agilent</td><td>オプション：RNAシーケンスライブラリ調製用。Agilent 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Freezing media</td><td>ThermoFisher</td><td>12648-010</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

Isolation of Subcellular Ribosome Subpopulations Based on Recombinant Peptide Tag-Specific Location-Restricted Illumination-Enhanced Biotinylation

Growing evidence suggests that mRNA translation is a highly compartmentalized process within a cell, and that subcellular trafficking and localization of ...

Our research investigates how ribosome composition and mRNA translation vary across subcellular domains to regulate local protein synthesis. Current methods lack spatial and temporal precision. ALIBi addresses this through optogenetically controlled proximity labeling of ribosomes.To begin, obtain L31FTA mouse embryonic stem cells and transfect them with ALIBi, GFP control, or full length BirA plasmids. After 24 to 48 hours of transfection, pre-chill the centrifuge to four degrees Celsius. With the lights off, move the transfected plates to a temporary 37-degree Celsius incubator.To prevent temperature fluctuations, once the transilluminator is placed in the main incubator, using 70%ethanol, wipe down the blue light transilluminator. After connecting the transilluminator to power, place it in the main incubator. Allow the incubator conditions to reequilibrate, while continuing the setup.Warm an aliquot of media to 37 degrees Celsius for dosing with biotin and cyclohexamide, or CHX. If preparing control samples without supplemental biotin, warm a separate aliquot for CHX-only dosing. Chill an aliquot of DPBS intended for CHX dosing.Prepare the RNase removal buffer, salt wash, lysis

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ペプチジル- tRNAの初期段階を含むリボソームの生化学的解析への大きな障害は、同じサンプル中の他のリボソーム、解析対象の特定のmRNA配列の翻訳に関与していないリボソームの存在となっています。我々は、排他的に、興味の発生期のペプチジル-...

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雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

単一分子蛍光エネルギー移動は、リボソームタンパク質合成中のtRNAダイナミクスを追跡する方法である。個々のリボソームを追跡することにより、不均一な集団が同定され、メカニズムに光が当たります。この方法は、生物学的立体構造の変化を一般的に追跡し、他の多くの複雑なバイオシステムにおける動的機能関係を明らかにするために使用することができる。単一分子法は、平均効果のために従来のアンサンブル法ではアクセスできない非レート制限ステップおよび低人口のキー中間体を観察することができる。...

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物...

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

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タンパク質の発見と定量を改善するためのミトコンドリアの2段階タグフリー分離

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組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

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