Name: ヤギ腸逆嚢を用いたヒスチジンの膜輸送のデモンストレーション:学部生のための体験型教育ツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: 学ぶヤギ腸逆嚢を用いたヒスチジンの膜輸送実験。ナトリウム共輸送メカニズムを可視化し、学部生の体験型学習を支援する再現性の高い教育ツールです。

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<meta charset="utf8"></head><body>ヤギ空腸逆嚢におけるナトリウム依存性ヒスチジン吸収

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry.+7th+Edition%22">Lehninger Principles of Biochemistry. 7th Edition</a>. , W.H. Freeman and Company. (2017).</li>
<li>Stillwell, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStillwell%2C+W+%22Membrane+Transport.+An+Introduction+to+Biological+Membranes%22">Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes</a>. , Elsevier Science. (2013).</li>
<li>Fick, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+liquid+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+London%2C+Edinburgh%2C+and+Dublin+Philosophical+Magazine+and+Journal+of+Science%22%5BJournal%5D)">On liquid diffusion.</a> The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).</li>
<li>Sherwood, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherwood%2C+L+%22Introduction+to+Human+Physiology%22">Introduction to Human Physiology</a>. , Brooks/Cole Cengage Learning. (2013).</li>
<li>Bröer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+amino+acid+transport+and+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Intestinal amino acid transport and metabolic health.</a> Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).</li>
<li>Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-dependent+neutral+amino+acid+transporter+ATB0+is+a+rabbit+epithelial+cell+brush-border+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).</li>
<li>Bröer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+transport+across+mammalian+intestinal+and+renal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia.</a> Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).</li>
<li>Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uptake+of+amino+acids+by+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The uptake of amino acids by the intestine.</a> BBA - Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).</li>
<li>Pauly, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+die+Konstitution+des+Histidins%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Mitteilung.+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Über die Konstitution des Histidins.</a> I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).</li>
<li>Wilson, T. H., Wiseman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+sacs+of+everted+small+intestine+for+the+study+of+the+transference+of+substances+from+the+mucosal+to+the+serosal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface.</a> J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).</li>
<li>Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everted+gut+sac+model+as+a+tool+in+pharmaceutical+research%3A+Limitations+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications.</a> J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).</li>
<li>Pento, J. T., Mousissian, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+deterioration+of+active+transport+in+duodenal+segments+of+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Methods%22%5BJournal%5D)">Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine.</a> J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).</li>
<li>Williams, L., Sembiante, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiential+learning+in+U.S.+undergraduate+teacher+preparation+programs%3A+A+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Teach+Teach+Educ%22%5BJournal%5D)">Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature.</a> Teach Teach Educ. 112, 103630(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL マイクロ遠心チューブ</td><td>TARSONS</td><td>500020</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 試験管</td><td>BOROSIL</td><td>9800U04</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 滅菌ファルコンチューブ</td><td>TARSONS</td><td>546041</td><td></td></tr><tr><td>500 mL ビーカー</td><td>ボロシル</td><td>10044977</td><td></td></tr><tr><td>500 mL コニカルフラスコ</td><td>ボロシル</td><td>691467</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>SRL</td><td>42738</td><td></td></tr><tr><td>デジタル分光光度計</td><td>SYSTRONICS</td><td>2710</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>EMSURE</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>フィンピペット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>ガラススターラーロッド</td><td>ボロシル</td><td>9850107</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン&nbsp;</td><td>SRL</td><td>17849</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>KIMTECH</td><td>112-4847</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿&nbsp;</td><td>TARSONS</td><td>460090</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>緩衝生理食塩水(ph 7.4)</td><td>SRL</td><td>95131</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>ABDOS</td><td>P10102</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>SRL</td><td>89382</td><td></td></tr><tr><td>硝酸ナトリウム&nbsp;</td><td>SRL</td><td>44618</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二塩基性ナトリウム(無水)</td><td>SRL</td><td>53046</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基性(無水)</td><td>SRL</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>スルファニル酸&nbsp;</td><td>SRL</td><td>の15354</td><td></td></tr></tbody></table>

ヤギ腸逆嚢を用いたヒスチジンの膜輸送のデモンストレーション:学部生のための体験型教育ツール

Demonstration of Membrane Transport of Histidine using Goat Intestinal Inverted Sacs: An Experiential Pedagogical Tool for Undergraduates

腸絨毛によるヒスチジンの逆嚢の内腔への吸収によるヒスチジンの腸内可動性を実証するための実験ワークフローを、 図4、 表1 および 表2に示す。3つの独立した実験セットアップを実行し、代表的なデータを 図6に示します。
与えられた実験条件下で、Paulyの反応を用いたヒスチジン推定は、300μMまでLambert Beerの法則に従いました(図6A)。このヒスチジンの試験は、試薬中のアミノ酸とジアゾニウムイオンとの結合に依存しています。ポーリーの試薬は、スルファニル酸を濃塩酸に溶かしています。この酸は、硝酸ナトリウムとHClの存在下でジアゾ化を受けます。ジアゾニウム塩p-フェニルジアゾスルホン酸は、アルカリ条件下でヒスチジン分子と反応して、暗赤色/オレンジ色から黄色の錯体を形成し、490 nmで分光光度法で読み取ることができます(図5)9。このテストはヒスチジンとチロシンによって行われることに注意してください。この研究で使用された試験は、硝酸ナトリウムを冷却条件下で使用するのではなく、室温(~20°C)で直接硝酸ナトリウムを使用するように、元の反応をわずかに修正したバージョンです9。
逆嚢の内側から回収されたサンプルで観察された陽性のポーリー反応は、腸絨毛全体でのヒスチジンの吸収を示しています。 図6B は、空腸細胞におけるヒスチジンの取り込みとナトリウム濃度との間の相関を示しています。インキュベーション時間が30分から60分に増加するにつれてヒスチジンの吸収が増加することは、二次能動輸送を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig01v2.jpg"> 図1:さまざまな種類の膜輸送。 さまざまな種類の膜輸送システムを示す模式図。(A)受動的拡散。(B)促進された拡散。(C)一次能動輸送(左)と二次能動輸送(右)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig02.jpg"> 図2:腸絨毛内の腸細胞の組織化。 この図は小腸に焦点を当てており、十二指腸、空腸、回腸の3つの異なる部分を示しています。小腸にはさらに、絨毛と呼ばれる指のような突起があり、摂取した食物の吸収のための表面積を増加させます。微絨毛には、アミノ酸吸収のための特定のトランスポーターを含む腸細胞と呼ばれる細胞があります。タイトジャンクションは、細胞間の溶質の移動を防ぎます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig03.jpg"> 図3:アミノ酸トランスポーターを持つ腸細胞。 漫画は、頂端と基底外側の端を示す1つの腸細胞を表しています。頂端にはB0ATやSNAT5タンパク質などのトランスポーターがあり、基底外側メンブレンはLAT1トランスポーターを含んでいます。一緒に、これらのタンパク質は、腸管腔から門脈循環へのヒスチジンの取り込みに関与しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig04.jpg"> 図4:ヤギの腸逆嚢を使用したヒスチジンの膜輸送を示すプロトコルの概略図。 ヤギの腸は、説明されているように調達され、前処理され、洗浄されました。簡単に言うと、空腸を切除し、逆嚢を作製しました。これらの嚢は、さまざまな塩濃度でのヒスチジンの取り込みを定量化するための実験を設定するために使用されました。絨毛は、光学顕微鏡を使用して400倍の倍率で観察されました。詳細な手順は本文に記載されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig05.jpg"> 図5:ポーリーの方法に対する反応。 ポーリーの試験では、濃塩酸中にスルファニル酸を含む試薬でジアゾニウムイオンが形成されます。アルカリ性条件下では、ヒスチジンはジアゾニウム塩と反応し、赤色の化合物が形成され、その吸光度は分光光度計を使用して490nmで測定できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66882/66882fig06.jpg"> 図6:Paulyの方法によるヒスチジンの推定(A)ヒスチジンの標準曲線。0〜300μMの範囲の様々な濃度のヒスチジンをポーリー反応にさらし、形成された錯体を波長490nmで測定した。(B)腸嚢中のヒスチジンの輸送を、150 mM(固体黒)および200 mM NaCl(固体灰色)塩溶液の存在下で30分間および60分間追跡した。逆嚢内のヒスチジンの濃度は、標準曲線を使用して推定しました(図6A)。値は、コントロール(0 mM NaCl)を基準にして報告されます。3回のテクニカルリプリケートを実施し、代表的なデータを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/66882fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:ヒスチジンの腸内可動性の実験セットアップ。 この表は、2つの時点における異なる濃度の塩化ナトリウムでの腸嚢のインキュベーションを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:ヒスチジンの標準曲線の作成。 この表は、0〜300μMの範囲の既知の濃度のヒスチジンに対するポーリー反応のさまざまなステップと成分を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66882/Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Histidine is an essential amino acid that is also a precursor for metabolites implicated in the immune system, pulmonary ventilation, and vascular ...

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ヤギ腸逆嚢を用いたヒスチジンの膜輸送のデモンストレーション:学部生のための体験型教育ツール

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