Name: ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: 学ぶ ELISAアッセイによるMCF-7細胞の8-oxo-dG定量法。過酸化水素処理による酸化的DNA損傷を効率的に評価し、従来法より簡便で費用対効果の高い検出プロトコルを確立する。

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この研究は、江蘇省高等教育機関科学技術革新研究チーム(2021年)、江蘇専門大学工学技術研究センタープログラム(2023年)、蘇州人民生活技術プロジェクトの主要技術プログラム(SKY2021029)、江蘇バイオバンク臨床資源オープンプロジェクト(TC2021B009)、放射線医学と防護の国家重点研究所のプロジェクトによって支援されました。 蘇州大学(GZK12023013)、蘇州職業健康学院プログラム(SZWZYTD202201)、中国江蘇省清蘭プロジェクト(2021年、2022年)

1.MCF-7細胞におけるH2O2誘導DNA酸化損傷モデルの構築
<ol><li>MCF-7細胞回収<ol><li>3.5 x 106 MCF-7細胞を含み、-80°Cの冷蔵庫に保存されている細胞培養極低温チューブを、液体窒素の入った発泡スチロールボックスに迅速に移します。鉗子でチューブを取り出し、37°Cの恒温水浴に約1分間入れて、保存された細胞を解凍します。 注:水浴での解凍プロセス中は、細胞を断続的に振とうして、クライオバイアルが均一に加熱されるようにします。</li>
		<li>クライオバイアルを遠心分離機に入れ、室温で150 x g で5分間遠心分離します。</li>
		<li>ピペットを使用して上清を極低温保存チューブから捨て、1 mLの完全培地を加えます。よく混ぜて10 mmの培養皿に移し、さらに7 mLの完全培地を補充します。</li>
		<li>培養皿を十字型に振って均一に混合し、5% CO2を含む37°CのCO2インキュベーターで培養します。 注:完全な培養培地は、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン、およびストレプトマイシンを添加したDMEM培養培地で構成されています。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞生存率評価<ol><li>対数増殖期のMCF-7細胞のうち、細胞の状態が良好なものを実験用に選択してください。対数成長期では、細胞は通常、分裂サイクルが短く、細胞分裂の頻度が高くなります。<ol><li>電子顕微鏡を用いてMCF細胞の形態と増殖速度を観察します。細胞が均一で密集した単層形態を示し、細胞増殖が明らかな場合、細胞は本質的に対数成長段階にあると判断できます。</li>
		</ol></li>
		<li>細胞洗浄:ピペットを使用して培養皿から培地を取り出し、1 mLのPBSバッファーを加えて細胞を洗浄し、PBSを廃棄します。</li>
		<li>細胞剥離:1mLのトリプシンを加えて細胞を洗浄し、トリプシンが培養皿から細胞を完全に剥離するまで約1分間待ちます。培養皿をそっと叩きます。細胞の動きの観察 シートでは、細胞の徹底的な剥離を示しています。</li>
		<li>細胞剥離および細胞計数の終了:8 mLの完全培地を添加して剥離を終了し、細胞を静かにピペットで移動し、細胞計数装置を使用して細胞懸濁液濃度を測定します。 注:カウントする前に、ピペッティングで静かに上下させて、細胞懸濁液が均一であることを確認してください。</li>
		<li>細胞播種:希釈した細胞懸濁液を100μLあたり5,000細胞の細胞密度を達成するために調整します。ピペットガンを使用して細胞懸濁液を96ウェルプレートの21ウェルに接種し、各ウェルに100μLを分注します。播種したウェルの周囲のウェルに100 μLのPBSバッファーを添加して、培地の過度の蒸発を防ぎます。</li>
		<li>H2O2含有培地の調製:12ウェル細胞培養プレート上の9つのウェルを選択し、H2O2 濃度の勾配(0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0 mM)に基づいて標識を割り当てます。2.0 mMおよび1.5 mMとラベル付けされたウェルに720 μLの完全培地を加え、残りのウェルに360 μLの完全培地を加えます。<ol><li>ピペットを使用して、1.63 μL と 1.22 μL の 3% H2O2 試薬を、それぞれ 2.0 mM と 1.5 mM とラベル付けされたウェルに分注します。溶液をよく混ぜます。ピペットを使用して、360μLの2.0mMH2O2を1.0mMで標識したウェルに移し、混合します。次いで、360μLの1.0mM H2O2を0.5mMとマークされたウェルに移し、混合する;最後に、360μLの0.5mMH2O2を0.25mMとマークされたウェルに移します。1.5 mM H2O2 の 360 μL を 0.75 mM で標識したウェルにピペットで移し、希釈して所望の濃度を達成します。(図1)。 注:ピペット内のH2O2 ストック溶液がウェルに完全に移され、残留溶液が発生しないようにしてください。希釈を進める前に、溶液を完全に混合してください。</li>
		</ol></li>
		<li>インキュベーション:細胞播種の約24時間後、細胞が表面に付着したら、ピペットを使用して96ウェルプレートから培地を取り出します。濃度勾配に従って、それぞれのH2O2含有培地を各ウェルに加えます。プレートをインキュベーターに12時間戻します。</li>
		<li>CCK-8試薬の添加:指定された12時間の処理期間の後、ピペットを使用して96ウェルプレートから培地を取り出し、各ウェルに100μLの完全培地と10μLのCCK-8試薬を加え、3つのブランクコントロールウェルを含めます。プレートを37°Cで2時間インキュベートします。 注:サンプルを追加するプロセス中は、OD値の読み取りとの干渉を防ぐために、気泡の形成を避けてください。</li>
		<li>吸光度測定:インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、マイクロプレートリーダーを使用して波長450nmの吸光度を測定し、結果を記録します。</li>
		<li>IC50の計算式によれば、 阻害率(%)=(薬物実験群のOD-薬物コントロールホールの平均OD)/(細胞コントロールホールの平均OD-薬物コントロールホールの平均OD)×100% 結果をコントロール培養物の吸光度の割合として計算します。</li>
		<li>処理された実験データを統計解析ソフトウェアにインポートし、分析タイプ「 非線形回帰」を選択し、4パラメータロジスティックモデルを構築し、カーブフィッティングの 「カーブの適合 」ボタンをクリックします。フィッティングプロセスに続いて、ソフトウェアは自動的にIC50 の値を計算します。</li>
	</ol></li>
	<li>H2O2誘導MCF-7細胞酸化実験<ol><li>対数成長期のMCF-7細胞を良好な細胞状態で取得し、実験に役立てます。</li>
		<li>洗浄、細胞剥離、剥離の終了、細胞のカウントを行います(具体的な方法については、ステップ1.2を参照してください)。</li>
		<li>細胞播種:細胞懸濁液の密度を皿あたり1 x 106 細胞に調整し、直径6cmの皿あたり4mLの懸濁液を使用します。</li>
		<li>2本の5 mLマイクロ遠心チューブを0.25 mMおよび0.75 mM 3% H2O2と標識します。各チューブに4 mLの完全培地を加え、次に1.13 μLと3.40 μLの3% H2O2をそれぞれ加えます。チューブを静かに振って、完全に混合します。3つの皿の培地を、0、0.25、および0.75mMのH2O2 濃度を含む完全な培地と交換します。</li>
		<li>培養物をインキュベートする:皿をインキュベーターに12時間戻します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 細胞サンプルの調製とELISA試薬の調製
<ol><li>細胞抽出物サンプルの収集<ol><li>サンプル採取:MCF-7細胞培養上清を廃棄し、すすぎ、細胞剥離を行い、剥離を終了し、細胞を採取します。細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに移します。</li>
		<li>遠心分離:800 x g で5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収します。200 μLのPBSを添加して各細胞サンプルを再懸濁し、凍結融解サイクルを繰り返して細胞を破壊します。細胞溶解液を1,500 x g で10分間遠心分離し、ピペットを使用して分析用の上清を回収します。 注:細胞量が少ない場合は、再懸濁に使用するPBSの量を減らしてください。サンプルは、即時分析が不可能な場合は、4°Cで最大1週間保存できます。長期保存の場合は、サンプルを単回使用量に基づいて分注し、凍結融解サイクルを繰り返さないように-80°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>ELISA試薬の調製<ol><li>試薬の解凍:シールフィルム、プレコートプレート、標準液、サンプル希釈剤、検出抗体-HRP、発色剤基質、停止溶液、濃縮洗浄バッファー(20x)、および試験サンプルを含むELISA試薬を室温(18-25°C)に20分間到達させてから、アッセイを開始します。ELISAリーダーは、使用の15分前に事前に開いてください。</li>
		<li>洗浄バッファーの調製:希釈した洗浄バッファーの必要量を計算し、次に20倍濃縮洗浄バッファーを蒸留水または脱イオン水で1倍の作業溶液に希釈します。未使用の濃縮洗浄バッファーは4°C冷蔵庫に戻します。 注:洗浄バッファーは、使用前に新鮮に調製する必要があります。冷蔵庫に保管されている濃縮洗浄バッファーに結晶が存在する場合は、室温まで放置し、結晶が完全に溶解するまで静かに振とうしてから使用してください。</li>
		<li>標準の準備<ol><li>標準サンプルの標準試料の作業溶液を調製し、それぞれ濃度が 1.25、2.5、5、10、20、40 ng/mL です。実験結果の精度を確保するために、溶解プロセス中の気泡の形成を避けるために、使用前に標準サンプルを慎重に上下に混合してください。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>3. ELISA実験
<ol><li>プレートコーティング:標準、サンプル、ブランク/コントロールのウェルの総数を事前に設計し、必要なプレートストリップを取り出します。50 μLの標準標準作動溶液と、濃度の異なる検出サンプルを反応ウェルに加えます。標準を三重に行い、ブランク/コントロールウェル25にサンプルを追加することは控えてください。 注:ELISAアッセイの実験ステップを 図2に概略的に示します。サンプル濃度が検出範囲を超える場合は、サンプリング前にサンプルをサンプル希釈剤で希釈する必要があります。サンプルを追加するときは、ウェルの壁に触れないようにプレートの底に追加し、穏やかに振って混合し、気泡の形成を避けます。実験の精度を確保するために、各サンプルの添加は10分以内に完了する必要があります。</li>
	<li>インキュベーション:ブランクウェルを除き、各反応ウェルに100 μLの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識検出抗体を添加し、プレートシールでウェルを密封し、恒温インキュベーターで37°Cで60分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄:液体を捨て、プレートウェル内の液体を振り落とし、吸収紙で軽くたたいて乾かし、各反応ウェルに350μLの洗浄バッファーを加え、1〜2分間放置してから、洗浄バッファーを廃棄します。洗浄プロセスを5回繰り返します。 注:徹底的な洗浄は、実験結果の精度に直接影響するため、非常に重要です。各洗浄後に洗浄バッファーが完全に振り落とされていることを確認してください。洗濯後は、吸光度測定に影響を与えないように、プレートの底に付着した残留物を慎重に拭き取ってください。</li>
	<li>カラー反応:各反応ウェルに50 μLの基質Aと50 μLの基質Bを添加し、プレートを密封し、暗所で37°Cで15分間インキュベートします。 注:カラー試薬を添加した後は、速やかに反応ウェルの色の変化を観察してください。色が暗すぎる場合は、ストップソリューションを追加して反応を早期に終了させます。</li>
	<li>反応を終了させて吸光度を測定する:各反応ウェルに50μLの停止溶液を加え、すぐにELISAリーダーで波長450nmのOD値を測定します(15分以内)。</li>
	<li>データ分析:処理された実験データを統計分析ソフトウェアにインポートし、分析タイプ として線形回帰を選択します。X 軸上の標準試料の濃度を Y 軸上の光学濃度(OD)値に対してプロットすることにより、検量線を作成します。確立された検量線を利用して、サンプル中に存在する8-oxo-dGの濃度を確認します。ロジスティック数学的モデルを作成し、カーブフィッティングの [カーブのフィット ]ボタンをクリックします。フィッティングプロセスに続いて、ソフトウェアは自動的に標準曲線とP値を計算します。 注:標準曲線は再利用できないため、実験ごとに新たに決定する必要があります。</li>
</ol>

MCF-7細胞におけるDNA酸化的損傷の程度の決定

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著者には、開示すべき利益相反はありません。

ELISA法の開発は、既存のDNA損傷検出法と新しいDNA損傷検出法の両方にとって非常に重要です。従来のHPLCおよび質量分析技術と比較して、このアプローチはユーザーフレンドリーであるだけでなく、高感度を示し、ハイスループットスクリーニングの要求を満たします30。これにより、大規模な疾患スクリーニング研究における8-oxo-dGのモニタリングが可能になり、このバイオマーカーとさまざまな疾患との相関関係をより深く理解することができます。
実験手順では、結果の信頼性と再現性を確保するために、いくつかの重要なステップが不可欠です。最初に、実験では、12時間で0.7655mMのIC50値を使用して、MCF-7細胞のH2O2に対するMCF-7細胞の感度を巧みに評価しました。この結果は、MCF-7細胞の抗酸化防御メカニズムと酸化ストレス下での生存を理解するために非常に科学的に重要であり、抗酸化薬または関連する治療メカニズムの将来のスクリーニングのための重要な参照指標を提供するとともに、31。さらに、8-oxo-dG抗体の選択とペアリングはELISA検出に不可欠であり、ELISA検出システムの特異性と感度に直接影響します。さらに、信号増幅戦略とサンプル処理ステップの最適化は、検出の精度に影響を与える重要な要素です。その結果、安定した基質反応系を用いることで、バックグラウンドエラーが減少し、検出感度範囲が拡大することがわかりました。
実験過程では、不安定な抗体、シグナルの変動、反応物の交差反応性などの技術的な問題が発生する可能性があります。これらの課題に対して、抗体の安定性を向上させるための安定抗体溶媒の使用や、実験条件の最適化・調整など、より安定した実験プロトコールを採用しました。さらに、信号の変動によって生じる誤差に対処するために、結果の一貫性を確保するために、標準的な8-oxo-dGサンプルを使用して実験を標準化しました。
実験方法の限界に関しては、ELISAはハイスループットアプローチを提供するが、特異的抗体のカバレッジと避けられない基質交差反応性32によって依然として制限される可能性がある。そのため、複雑なサンプルの場合は、追加のサンプル精製または前処理ステップが必要になる場合があります。さらに、低濃度のサンプルを検出するには、研究要件を満たすために抗体活性をさらに最適化する必要がある場合があります。
結論として、8-oxo-dGのELISA検出法は、特定の研究分野にとって重要な意味を持っています。これは、環境モニタリング、疾患リスク評価、および早期診断への潜在的な応用価値があり、農業、食品安全、および薬物スクリーニングにおける8-oxo-dGの新しい検出アプローチを提供します33。例えば、環境バイオモニタリングでは、生物内の環境毒素によって引き起こされるDNA酸化的損傷ストレスの検出は、潜在的なリスクをタイムリーに特定するのに役立つ34。今後、検出技術のさらなる最適化と多分野への応用により、この手法はライフサイエンス研究においてより重要な役割を果たすことが期待されます。

DNAの酸化的損傷は、活性酸素種(ROS)の生成と細胞の抗酸化防御システム1との間の不均衡の結果です。これは主にDNAプリン塩基とピリミジン塩基の酸化を伴います2,3。このDNA塩基の酸化的修飾は、ゲノムの完全性を損なうだけでなく、がん、神経変性疾患、心血管疾患など、幅広い病理学的問題を包含しています4,5。DNA中のグアニン塩基は、還元電位が最も低く、酸化に対して最も影響を受けやすい6。したがって、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン(8-オキソ-dG)は、DNA酸化的損傷の程度を評価するための主要なマーカーとして機能します7,8。8-oxo-dGの正確な定量は、疾患の発生、進行、および多因子酸化負荷の評価のさまざまな側面に対処する上で重要な問題となっています9。
電気化学検出付き高速液体クロマトグラフィー(HPLC-ECD)、質量分析、および関連するハイフン技術など、8-oxo-dGを検出するための従来の方法は、高い感度と特異性を示します10,11,12。しかし、これらの手法は複雑な運用要件と高コストを伴うことが多く、ハイスループットサンプル分析における広範な適用性と実用性が妨げられています。科学技術の絶え間ない進歩に伴い、さまざまな新しい効率的で正確な方法が登場しています。これらの新技術の適用により、8-oxo-dGのレベルをより正確に定量化できるようになり、酸化ストレスと疾患との関連を詳細に研究するためのより強力なツールが提供されます。例えば、研究者はナノポア技術を適用してDNA13を定量的に検出し、配列決定を行い、シングルクリックコードシーケンシング戦略14を使用してDNA損傷タイプを特定し、ハイスループットシーケンシング法を開発し、ビオチンストレプトアビジンとELISAを統合して8-oxoGベースのバイオセンサーを作成しました15。その中でも、特異性、ハイスループットスクリーニング、およびコストの点で認められている利点を持つELISAは、8-oxo-dG検出の理想的なソリューションの1つです。したがって、ハイスループット、高感度、便利、かつ迅速な8-oxo-dG検出法を開発することが重要です。
1971年に開発された酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)16技術は、過去50年間で急速に進歩し、現在では生物学および医学の分野で最も一般的に使用される検出方法の1つになっています17,18,19。ELISA技術は、高い感度と特異性を示し、反応時間が短く、使いやすいため、大規模なサンプルテストやハイスループット分析の選択肢として広く認識されています20。その結果、ELISAは、細胞内の化合物、タンパク質、抗体、または分子の定量的または半定量的分析に広く使用されています21,22,23。例えば、それは、種々の疾患、薬物残留物、および生体分子24に関連するバイオマーカーの検出に利用されてきた。ELISAは、実験デザインと原則に基づいて、主に4つのタイプに分類できます25。これらの方法には、直接 ELISA、間接 ELISA、サンドイッチ ELISA、および競合 ELISA 26,27 が含まれます。その中でも、標的分子を捕捉するための抗体と検出用の抗体の2つの特異的抗体を利用したサンドイッチELISAが、この論文の研究に選ばれました。サンドイッチELISAの実験原理は次のとおりです:まず、特定の抗体をマイクロプレートのウェルに固定化して、目的の分析物を捕捉します。標準試料またはサンプルを添加した後、標的分析物は固定化抗体に結合します。続いて、抗原上の異なるエピトープを認識する標識抗体を添加し、サンドイッチ構造を形成する。非結合抗体を除去した後、基質を添加します。二次抗体の触媒作用下で色反応が起こり、色の強度はサンプル中の標的分析物の濃度と正の相関があります。最後に、光学密度(OD)を測定して、サンプルの濃度を決定しました。Sandwich ELISAには、ターゲットサンプルの感度と特異性が向上するという利点があり、低濃度のターゲット分析物や複雑なサンプルの検出に適しています28。さらに、得られた結果を定量化して、さらなる分析を行うことができます。これらの要因により、サンドイッチELISAは科学研究と臨床検査室の両方で一般的に使用される検出方法となっています29。
本研究は、MCF-7細胞中の8-oxo-dGを定量的に検出し、細胞内のDNA酸化的損傷の程度を決定することを目的としています。本研究は、MCF-7細胞DNA酸化的損傷モデルの構築と、ELISAを用いた8-oxo-dGの検出という2つの主要な部分から構成されています。まず、MCF-7細胞をin vitroで培養し、異なる濃度のH2O2で異なる期間処理した。CCK-8アッセイを用いて細胞生存率を評価し、MCF-7細胞におけるH2O2の半値阻害濃度(IC50)を決定しました。IC50の値に基づいて、適切なH2O2処理時間と誘導濃度を選択しました。酸化によって損傷を受けたMCF-7細胞のサンプルを抽出するために、細胞サンプルと上清を採取し、8-oxo-dG抗体でコーティングした酵素結合ウェルに添加しました。サンプル中に存在する8-oxo-dGは、固相キャリアに結合した抗体に結合します。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された8-oxo-dG抗体を添加しました。反応混合物を一定温度でインキュベートして、サンプルと抗体が完全に結合するようにしました。未結合の酵素を洗浄して除去し、次に比色基質を添加すると、青色が生じました。酸の作用下で、溶液は黄色に変わった。最後に、反応井試料のOD値を450nmで測定し、試料中の8-oxo-dGの濃度はOD値に比例した。標準曲線を作成することにより、サンプル中の8-oxo-dGの濃度を計算できます。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA(1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>同人堂</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンティングプレート</td><td>QiuJing</td><td>XB-K-25</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo</td><td>51032872</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic(1X)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td>ST30-3302</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism X9</td><td>GraphPadソフトウェア</td><td></td><td>統計解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>Thermo</td><td>&nbsp;9AQ2861</td><td></td></tr><tr><td>ヒト 8-oxo-dG ELISA キット</td><td>Zcibio</td><td>ZC-55410</td><td></td></tr><tr><td>L-1000XLS+ ピペット</td><td>レイニン</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>L-20XLS+ ピペット</td><td>レイニン</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素タンク</td><td>Mvecryoge</td><td>YDS-175-216</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 CELL</td><td>BNCC</td><td>BNCC100137</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC マイクロプレート光度計</td><td>サーモ</td><td>1410101</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ソーラーバイオ</td><td>P1020</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100X</td><td>Beyotime</td><td>C0222</td><td></td></tr><tr><td>三眼生細胞顕微鏡</td><td>Motic</td><td>1.1001E+12</td><td></td></tr><tr><td>超低温冷凍庫</td><td>ヘアV118574</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

elisaアッセイを用いた8-oxo-dgレベルの定量化によるmcf-7細胞の酸化的dna損傷の評価

Quantifying the Level of 8-oxo-dG Using ELISA Assay to Evaluate Oxidative DNA Damage in MCF-7 Cells

8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2'-デオキシグアノシン(8-オキソ-dG)塩基は、一般的に観察されるDNA酸化的損傷の主な形態です。DNA障害は遺伝子発現に深く影響し、神経変性疾患、がん、老化を刺激する極めて重要な因子として機能します。したがって、8-oxoGの正確な定量は、DNA損傷検出法の研究において臨床的に重要です。しかし、現在のところ、8-oxoG検出の既存のアプローチは、利便性、便宜性、手頃な価格、および感度の向上の点で課題を提起しています。私たちは、非常に効率的で迅速な比色法であるサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)技術を使用して、さまざまな濃度の過酸化水素(H2O2)で刺激されたMCF-7細胞サンプルの8-oxo-dG含有量の変動を検出しました。我々は、MCF-7細胞におけるH 2 O 2の酸化的損傷を誘発するH2O2 のIC50 値を検出することにより、MCF-7細胞の濃度を決定した。続いて、MCF-7細胞を0、0.25、および0.75 mM H2O2 で12時間処理し、細胞から8-oxo-dGを抽出しました。最後に、サンプルをELISAにかけました。プレートの拡散、洗浄、インキュベーション、発色、反応の終了、データ収集などの一連のステップを経て、H2O2によって誘導されたMCF-7細胞の8-oxo-dG含量の変化を検出することに成功しました。このような取り組みを通じて、細胞試料中のDNA酸化損傷の程度を評価する方法を確立し、より簡便でDNA損傷検出の手法の開発を進めることを目指します。この取り組みは、DNA酸化損傷と疾患に関する臨床研究や有害物質の検出など、さまざまな領域との間の関連解析の探求に有意義な貢献をする準備ができています。

図3に示すように、X軸はMCF-7細胞に適用されるH2O2の濃度を示し、Y軸は細胞の生存率を示します。0.75 mMで12時間処理すると、MCF-7細胞の生存率は67%に低下しました。濃度の増加に伴って、MCF-7細胞の生存率、特に1.5 mMの濃度では生存率が有意に低下し、生存率は3%未満に低下しました(表1)。実験結果は、MCF-7細胞のIC50が0.7655mMであることを示しました。
この一連の実験では、8-oxo-dGレベルの定量化に強化されたELISA技術を採用しました。データ分析を通じて、標準曲線の回帰方程式は次のようになります。
Y = 23.66 × X + 0.07038 です。
図 4A に示すように、検量線は高い直線性(R²=0.978)を示し、図 4B は、サンプル中の 8-oxo-dG の測定濃度とそれに対応する添加量との関係が強く相関しており、良好な精度(変動係数が 5% 未満)であることを示しました。さらに、得られた結果の複数の反復にわたる一貫性は、実験法の信頼性と再現性を示しています。
要約すると、実験データは、最適化されたELISA法が、十分に制御された条件下で8-oxo-dGレベルの変動を成功裏に検出できることを示しています。このことは、酸化ストレスによって引き起こされるDNA損傷をモニタリングするために、この手法を幅広いサンプルタイプに将来適用する上で大きな意味を持ちます。一定の制限はあるものの、実験条件の最適化により、この分析法の適用見通しは有望に見えます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig01.jpg"> 図1:H2O2 希釈液の調製。 概略図は、過酸化水素(H2O2)希釈液の調製方法を示しており、溶液の細心の注意を払った組み合わせと、さまざまなH2O2 濃度をそれぞれ1.0 mM、0.5 mM、および0.25 mMとラベル付けされたチューブに正確に転写します。目標濃度は、1.5 mM H2O2 を0.75 mMとして指定されたチューブに移すことによって達成されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig02.jpg"> 図2:抗原検出用の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)。 この概略図は、抗原検出のための酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)のシーケンシャルステップを示しています。HRP標識抗原インキュベーション;洗浄とプレートの準備;基質の添加とインキュベーション。反応終了と光学密度(OD)測定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig03.jpg"> 図3:H2O2 はMCF-7細胞の増殖を阻害した。 細胞生存率は、さまざまな濃度のH2O2 (0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、または2.0 mM)で処理したCCK-8アッセイによって12時間評価し、示された条件についてIC50 を計算しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66888/66888fig04.jpg"> 図4:H2O2 処理後のMCF-7細胞における8-oxo-dGの定量分析。 (A)8-oxo-dGのELISA標準曲線。8-oxo-dG(1.25、2.5、5、10、20、40 ng/mL)の既知の濃度とそれぞれの吸光度値との関係を示しています。標準曲線の回帰式は、Y = 23.66 × X + 0.07038です。(n=3、R2=0.978)。(B)H2O2処理MCF-7細胞中の8-オキソ-dG濃度。このグラフは、異なる濃度のH2O2 (0、0.25、および0.75 mM)にさらされたMCF-7細胞の8-oxo-dGのレベルを示しています。各データポイントは、3つの独立した実験(n = 3)からの平均± SE(標準誤差)を表し、DNA損傷に対する酸化ストレスの影響を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66888/66888fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>パラメーター</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>H2O2 濃度、mM</td>
			<td>0</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.75</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>MCF-7細胞生存率、%</td>
			<td>100</td>
			<td>82.8</td>
			<td>81.37</td>
			<td>61.07</td>
			<td>13.4</td>
			<td>2.77</td>
		</tr></tbody></table>表1:H2O2で処理したMCF-7細胞の細胞生存率。

このプロトコールは、ELISA技術によってMCF-7細胞のDNA酸化的損傷を定量的に検出するための効率的な方法を説明しています。

ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価

8-Oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dG) base is the predominant form of commonly observed DNA oxidative damage. DNA impairment profoundly ...

本研究は、ELISAを用いてMCF-7細胞の8-oxo-dGを定量的に測定し、過酸化水素がDNAの酸化的損傷に及ぼす影響を評価することを目的としています。具体的には、このビデオでは、効率を上げるためにELISAのステップについて詳しく説明しています。電気化学検出、質量分析、およびその他の高度な方法論を備えた高速液体クロマトグラフィーを含む、8-oxo-dGを検出する技術は、有効性を実証しています。ただし、これらの方法には多くの場合、多くの面倒な手順が含まれ、非常にコストがかかる可能性があります。このプロトコールは、酸化的DNA損傷、特に細胞サンプル中の8-oxo-dGの効率的かつ高感度な検出における研究のギャップに対処します。これは、疾患、老化、および環境ストレスへの応答への影響を理解するために重要です。私の研究室では、DNA損傷イベント検出のためのメソッドの革新に焦点を当てています。これにより、DNA損傷マーカーに関する詳細な実験室科学研究を行うことができます。

quantifying-level-8-oxo-dg-using-elisa-assay-to-evaluate-oxidative

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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