Name: 抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学ぶ 廃水から低分子量DNAを効率的に抽出する手法。ポリエチレングリコールと塩化ナトリウムを用いて環境中の抗菌薬耐性遺伝子を包括的に検出し、コスト効率の良いモニタリング技術の基盤を築く。

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私たちは、APSI Indiaチーム(Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/)の一部として、ロックフェラー財団(Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018)からの資金援助に感謝します。また、この研究を支援するためにAxis Bankと、アショカ大学のTrivedi School of Biosciencesが機器やその他の支援を提供してくれたことにも感謝しています。

1. 排水サンプリング
<ol><li>500 mLのポリプロピレンビーカーをオープンドレンまたは下水処理プラント(STP)の貯水池に浸し、~300 mLの廃水サンプルを採取します。</li>
	<li>~250 mLのサンプルを250 mLのオートクレーブ処理ポリプロピレンボトルに移します。</li>
	<li>ボトルのキャップをねじ込み、プラスチックフィルムで密封します。ボトルは閉じた袋に入れて直立させてください。</li>
	<li>サンプルを密閉容器に入れ、周囲温度で直立させて輸送します。</li>
	<li>サンプルを70°Cの熱風オーブンで4時間加熱不活性化してから、DNA抽出用に処理します。</li>
</ol>2. 廃水サンプルからのDNA抽出
<ol><li>廃水サンプルが冷却されたら、サンプルを最大速度でボルテックスし、破片/スラッジを沈殿させます。</li>
	<li>50mLの遠心分離チューブに廃水27.5mLをデカントし、13.5gのPEG-8000(最終濃度30%)と3gのNaCl(最終濃度1.2M)を加え、完全に溶解するまでよく混合します。</li>
	<li>サンプルを4°Cで一晩(~16-18時間)インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを15,500 x g 、4°Cで30分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を捨てます。 注:8000%のPEG-30は高粘度であり、上澄みを捨てるときにペレットが外れる可能性があります。上清は、ペレットが失われないように、ゆっくりと慎重にデカントする必要があります。ステップ2.6から2.23は、キットの指示に従って土壌DNA抽出キットを使用して実行し、いくつかの変更を加えます。</li>
	<li>ペレットをキットの溶解液800μLに溶解し、混合したジルコニウムビーズチューブに溶液を加えます。 注:大量のペレットを処理する場合は、必要な数のチューブからペレットをプールします。たとえば、160 mLのサンプルを処理する場合。PEG と NaCl を含む廃水を含む 50 mL チューブが 4 本あります。4つのチューブすべてを15,500 x g 、4°Cで30分間遠心分離した後、4つのチューブすべてから上清を捨てます。それぞれに200 μLのCD1溶液を加え、ペレットを再懸濁し、1本のビーズチューブにプールします。</li>
	<li>ビードチューブを渦の上に水平に固定します。チューブを最高速度で20〜30分間ボルテックスします。 注:長時間のボルテックスにより、サンプルの完全な溶解と均質化が保証され、DNA収量が向上します。</li>
	<li>チューブを8,000 x g で15秒間スピンダウンして、底部のビーズを沈殿させ、泡を取り除き、上清をチューブから1.5 mLの微量遠心チューブに完全に移します。一部のビーズは、このステップで転写されることもあります。</li>
	<li>上清を15,000 x g で1分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を清潔な2mLの微量遠心チューブに移します。上清にはまだいくつかの懸濁粒子が含まれている可能性があります。</li>
	<li>200 μLの沈殿液を加え、最高速度で5秒間ボルテックスします。4°Cで5分間インキュベートします。 注:4°Cでのインキュベーションにより、DNAが溶液中に残っている間、タンパク質と細胞破片の沈殿効率が向上します。このステップでプロトコールを最大2時間一時停止することが可能ですが、抽出されたDNAの収量と品質が大幅に低下することはありません。</li>
	<li>15,000 x g で室温(RT)で1分間遠心分離します。ペレットを避け、透明な上清を清潔な2 mLの微量遠心チューブに移します。</li>
	<li>上清700 μLあたり600 μLの結合バッファーを添加し、最大速度で5秒間ボルテックスします。</li>
	<li>700 μLのライセートをシリカスピンカラムにロードし、2分間インキュベートした後、15,000 x g で1分間遠心分離します。 注:シリカカラム上でライセートをインキュベートすると、DNAのカラムへの結合が促進され、DNA収量が向上します。</li>
	<li>フロースルーを破棄し、すべてのライセートがスピンカラムを通過するまでステップ2.14を繰り返します。</li>
	<li>スピンカラムを清潔な2 mLコレクションチューブに慎重に入れます。スピンカラムにフロースルーが飛散していないことを確認してください。</li>
	<li>スピンカラムに500 μLの洗浄バッファーを加え、スピンカラムを15,000 x g で1分間遠心分離します。</li>
	<li>フロースルーを捨て、スピンカラムを同じ2 mLコレクションチューブに戻します。</li>
	<li>500 μLのエタノール洗浄バッファーをスピンカラムに加えます。15,000 x g で1分間遠心分離します。</li>
	<li>フロースルーを捨て、スピンカラムを新しい2 mLコレクションチューブに入れます。</li>
	<li>16,000 x g で2分間遠心分離し、残留エタノールを除去します。スピンカラムを新しい1.5 mLチューブに入れます。</li>
	<li>100 μLの溶出バッファー(55°Cに予熱)を白色フィルターメンブレンの中心に添加し、5分間インキュベートします。 注:加熱された溶出バッファーは、メンブレン上でのインキュベーションとともに、DNA、特に高分子量DNAの溶出効率を高めます。</li>
	<li>15,000 x g で1分間遠心分離します。スピンカラムを破棄します。</li>
	<li>溶出したDNAに、3 M NaCl 10 μL (1/10 容量の DNA 溶出液) と 250 μL の冷却無水エタノール (2.5 容量の DNA 溶出液) を加えます。反転させてよく混ぜ合わせ、内容物を8,000 x g で15秒間スピンダウンします。</li>
	<li>DNA-エタノール混合物を-20°Cで少なくとも1時間インキュベートします。 注:DNA-エタノール混合物のインキュベーションは、抽出されたDNAの収量または品質を有意に低下させることなく、16時間まで増やすことができる。</li>
	<li>19,000 x g 、4°C、30分間遠心分離します。上清をデカンテーションで捨てます。</li>
	<li>500μLの冷やした70%エタノールをペレットに加えます。</li>
	<li>19,000 x g 、4°C、15分間遠心分離します。上清をデカンテーションで捨てます。</li>
	<li>チューブを裏返し、ティッシュペーパーで軽くたたいて、毛細管現象により残留エタノールを除去します。</li>
	<li>すべてのエタノールが蒸発するまで、37°Cで5〜10分間加熱ブロック上でチューブを開いたままにして、DNAペレットを完全に乾燥させます。</li>
	<li>DNAペレットを30〜50μLのオートクレーブ二重蒸留水(ddH2O)に再懸濁します。37°Cで5〜10分間インキュベートします。</li>
	<li>DNAを8,000 x g で15秒間スピンダウンします。</li>
	<li>Nanodrop分光光度計の Nucleic Acids 設定でdsDNAアプリケーションを選択します。<ol><li>台座は糸くずの出ないティッシュペーパーと水で拭いてください。ddH2Oを使用して装置をブランクにし、2 μLのDNAサンプルを台座にロードします。</li>
		<li>濃度比と吸光度比(A260/280およびA260/230)を測定して純度を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>DNAサンプルは-20°Cで保存します。</li>
</ol>3. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅直鎖状DNAの沈殿により、さまざまな分子量にわたるDNAの回収を確認
<ol><li>大腸菌MG155由来のゲノムDNAを用いて、PCRにより遺伝子断片を増幅し、fusA、lacZ、gapA、rpsD、16S rRNA、marRの遺伝子から線状断片のプールを生成します(プライマー配列とPCR条件については表2を参照)。</li>
	<li>PCR精製キットを使用してPCR産物を精製し、PCR産物を一緒にプールします。</li>
	<li>プールしたアンプリコンを等量の1.5 mL微量遠心チューブに分割し、1つのチューブに「インプットDNA」とラベルを付けます。</li>
	<li>「インプットDNA」とラベル付けされたチューブを除く各チューブに、所望の条件(9%、20%、30%PEG-8000、0.3 M、1.2 M NaCl)に従ってPEGおよびNaClを添加し、最終容量を1 mLにします。</li>
	<li>チューブを4°Cで一晩(~16-18時間)インキュベートします。 注:3.16までの残りの手順では、「インプットDNA」は変更されずに冷蔵庫に保管されます。</li>
	<li>卓上型微量遠心分離機で、所望の速度(15,000 x g または20,000 x g)に従ってチューブを4°Cで1時間回転させます。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して、ペレットの反対側から上清900μLを慎重に取り除きます。</li>
	<li>最初のエタノール洗浄:ペレットに冷やした70%エタノール900μLを加え、チューブを静かに反転させて混合します。</li>
	<li>ステップ3.6で使用したのと同じ速度(15,000 x g または20,000 x g)でチューブを4°Cで30分間回転させます。</li>
	<li>デカンテーションによって上清を取り除きます。</li>
	<li>2回目のエタノール洗浄:500μLの冷やした70%エタノールをペレットに加えます。</li>
	<li>ステップ3.6で使用したのと同じ速度(15,000 x g または20,000 x g)でチューブを4°Cで30分間回転させます。 上清をデカンテーションで捨てます。</li>
	<li>チューブを裏返し、ティッシュペーパーで軽くたたいて、毛細管現象により残留エタノールを除去します。</li>
	<li>すべてのエタノールが蒸発するまで、加熱ブロック上でチューブを37°Cで5〜10分間開いたままにして、DNAペレットを完全に乾燥させます。</li>
	<li>ペレットを20 μLのオートクレーブ済み二重蒸留水に再懸濁します。</li>
	<li>さまざまな条件で沈殿したDNAの濃度と「インプットDNA」を、Nanodrop分光光度計または蛍光光度計で測定します。</li>
	<li>沈殿させたDNAを1%アガロースゲルにロードして、DNAを可視化します。</li>
</ol>

低MW遺伝子の濃縮による環境AMR評価の効率的化技術

著者は、利益相反を宣言しません。

AMRは、WHOがリストアップした今日の健康上の脅威のトップ10の1つであり、AMRの環境監視は世界中で重要なツールとして認識されています。冒頭で述べたように、環境AMRの包括的な記録には、低分子量、断片化、および細胞外DNAが含まれます。ここで報告されている高濃度のPEGと塩(30%PEGおよび1.2 M NaCl)を組み合わせた前処理プロトコルは、高分子量画分(主にゲノムおよびプラスミドDNA)の抽出に影響を与えることなく、低分子量DNAの割合を濃縮することにより、この結果を達成します。これは、低PEGおよびダイレクトキットプロトコル(前処理なし)を使用した以前の濃縮方法とは対照的に、大量の処理が必要なために面倒でした。低分子量DNAの回収には、低PEG濃度での前処理は非効率的でした(ここでは「低」とは600 bp未満のDNAバンドを指します)。前処理でPEGを使用しない場合、DNA抽出は不十分で、PEGとNaClを使用した場合の70%に対して、インプットDNAの10%しか回収されません(図8)。PEGとNaClの添加に加えて、もう1つの重要なステップは、キットから残留エタノールポストDNA抽出を除去して、ダウンストリーム処理用の純粋なDNAを得ることです。溶出時に30〜50mLの容量で少なくとも~300ng〜5mgのDNAを得るために必要な水の初期量を決定することが重要です。通常、廃水27,41からのDNA抽出のために処理される1L以上の水とは対照的に、ここで提案されている前処理ステップでは、下流処理のための高品質のDNAを得るには、わずか27.5〜40mLで十分であることがわかった。廃水には微粒子や有機物も含まれており、吸着した細菌細胞や細胞外DNAが含まれている可能性があります。したがって、細胞溶解を伴う細胞とDNAの脱離は、DNA収量を増やすための重要なステップです。PEG濃度が高いと、サンプルが粘性になり、前述のようにDNA抽出の溶解および脱着ステップが妨げられる可能性があります。これを回避するために、フローチャート(図9)に概説されているように、DNA抽出の段階的な方法が提案されています。この方法は、細胞内の高分子量DNA(図7)と細胞外の低分子量断片化された環状DNAの両方を抽出するのに役立ちます。
費用の面でこのプロトコルの現在の制限の1つは、品質を向上させるためのキットを通じて濃縮された低分子量DNAの継続的な処理です。この制限は、フェノール-クロロホルム抽出などの他のDNAクリーンアップ方法を使用して回避できる可能性があります。別の実用的な制限は、溶液の粘度が高いためにペレットが失われる可能性があるため、高濃度のPEGを処理することです。現在、PEGおよびNaClを用いた前処理が行われ、続いて既存のキットプロトコルの修正版が実施されています、すなわち、キットは依然として最終的なDNA精製に使用されます。キットフリーのDNA精製は、DNA収量は高いが純度は低い(ここでは報告されていません)ため、抽出されたDNAの品質を向上させるために最適化されています。PEG溶液の粘性の性質により、全範囲のDNAサイズを生成でき、しかも快適に取り扱うことができる最適なPEG濃度を目指す必要があります。濃度を20%に下げると(図6B)、抽出効率が低(9%)と高(30%)PEGの中間の結果が得られました。これは、将来の研究でフォローアップする価値があるかもしれません。
PEGは、環境サンプルからのDNA抽出のさまざまなステップで日常的に使用されます。しかし、AMRサーベイランスの文脈におけるDNA抽出におけるPEGの使用は標準化されていません。廃水監視は、STP(流入および排水)および開放および閉鎖排水8,27を含む多くの異なるニッチにおける抗菌薬耐性の検出を伴う。流入水中のAMRに関する情報は、コミュニティで循環している耐性に関する重要な情報を提供しますが、排水中のAMR遺伝子の存在は、耐性の発生を測定し、潜在的に予測するためにも同様に重要です。ほとんどの細胞が処理プロセス中に死滅するため、廃液サンプルは通常、微生物負荷が低く、その結果、細胞DNAの収量が非常に少なくなります。しかし、廃液には、高分子ゲノムDNAと低分子プラスミド、ファージミド、および断片化されたDNAの両方からなる細胞外自由浮遊DNAが含まれています。低分子DNA(断片化およびプラスミド/ファージミドの両方)に存在するAMR遺伝子は、廃液中の残りの生細胞に移され、耐性の播種につながる可能性があります30,41,45。そのため、廃水中の低分子量の細胞外DNAを検出することが重要です。AMRを評価する際に廃水からDNAを抽出するために採用される他の方法は、通常、低分子DNAの初期濃縮を保証するものではありません。廃水からのDNA抽出のこのアプローチは、環境の包括的なレジストームに関する情報を提供するために使用できます。

SARS-CoV-2とその余波は、感染症の発生を監視および予測する上での環境監視の重要性を強調しました1,2。ウイルスのパンデミックは明らかですが、抗菌薬耐性(AMR)の台頭はしばしば陰湿なパンデミックと表現され、世界中で主要な公衆衛生上の懸念事項となっています3,4。そのため、AMRの進化と広がりを理解するための協調的な戦略が急務となっています。水域と廃水は、病原体とAMR5,6,7,8の両方の貯水池として機能することができます。したがって、共有水源は、特に低・中所得国(LMIC)では、衛生状態の悪さと人口過剰が密接に関連しているため、人間の間で病気を感染させる強力な原因となっています9,10,11。水源の検査は、コミュニティの健康を評価するために長い間採用されてきました12,13,14。最近、都市の下水処理場からの廃水は、診療所1,2,15,16,17,18におけるCOVID症例の良好な事前指標であることが証明されました。
特定の疾患のモニタリングと比較して、環境中のAMRの検出と追跡はより複雑な問題を引き起こします。多数の抗菌薬が使用されていること、多様な耐性遺伝子、異なる局所選択圧、および細菌間の遺伝子の水平導入により、真のAMR負荷を評価することは困難であり、一度評価されたとしても、それを臨床観察と相関させることは困難である19,20,21,22。その結果、臨床AMRの協調的なサーベイランスは世界中のいくつかの組織によって実施されています3,23,24、環境AMRモニタリングはまだ初期段階にあります(19,25,26)。
近年、環境AMRを追跡するためのさまざまな方法が報告されており、5,27、28,29でレビューされています。これらのほとんどの出発点は、不均一な環境サンプルから良質なDNAを抽出することであり、それ自体が課題です。さらに、環境DNAは通常、敵対的な環境にさらされるため断片化されます。断片化された細胞外DNAは、AMR遺伝子の重要な貯蔵庫として長い間認識されており(30,31,32でレビュー)、遺伝子の水平伝播を介して細菌に出入りする可能性が追加されています。したがって、環境中のAMR負荷を測定することを目的としたプロトコルでは、可能な限り直鎖状および低分子量のDNAをサンプリングすることが重要です。驚くべきことに、直鎖状および低分子量DNAの高収率抽出に特化した方法の開発にはほとんど焦点が当てられていませんでした。
DNAを沈殿させる一般的で簡単な方法は、ポリエチレングリコール(PEG)と塩化ナトリウム(NaCl)33などの塩を組み合わせることである。PEGは、DNA断片34,35のサイズ特異的沈殿を達成するために使用される高分子クラウディング剤である。PEG濃度が低いほど、効率的に沈殿できるDNAの分子量が高くなります。多くの研究では、DNAおよびRNAの環境抽出中にPEGが使用されました1,2(表1 17,33,36,37,38,39に要約)最終ステップ33,36,37またはSARS-CoV-2 15,40のようにウイルス粒子の抽出のために大きな水サンプルを濃縮するために。.現在の研究では、以前に環境DNA抽出に使用されていたPEG濃度(主にウイルス監視プロトコルによって決定される)は、低分子量の直鎖DNAを捕捉しないことがわかりました。そのため、短いDNA断片のサンプリングに失敗し、AMR含有量を正確に評価するのには適していません。この研究では、ポリエチレングリコールと塩化ナトリウムの特性を利用して、低分子量の直鎖状DNA断片を高収率で効果的に沈殿させ、将来的には費用対効果の高いDNA抽出法につながる可能性があります。この方法は、複雑な天然サンプルから断片化された低分子量DNAの割合を濃縮するために使用できるため、環境AMRのより正確な画像を取得できます。もう少し洗練すれば、この技術は、地方自治体やその他の政府機関が最小限の技術トレーニングで監視ツールとして使用するのに、簡単かつ低コストで適用するのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>24人用微量遠心機</td><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>EP5406000046</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag.Ph Eur エタノール絶対 分析用)</td> <td>Supelco</td><td>100983-0511</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ冷蔵遠心分離機</td><td>Eppendorf Centrifuge 5920 R EP5948000131</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>BioRad</td><td>12003153</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil Pro Kit</td><td>Qiagen</td><td>47014</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy PowerWaterPro Kit</td><td>Qiagen</td><td>14900-100-NF</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (dNTP Mix 10mM Each,0.2 mL, R0191)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA Polymerase, 5 U/&micro;L + 10x DreamTaq バッファー*</td><td>Thermofscientific</td><td>EP0702</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488091</td><td></td></tr><tr><td>Maxiamp PCR チューブ 0.2 mL</td><td>ターソン</td><td>510051</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレードの PCR 用水</td><td>HiMedia</td><td>ML065-1.5ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC 微量 UV-Vis 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>13400519</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ビーミス</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>SRL</td><td>54866</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR &ゲルクリーンアップキット</td><td>Qiagen</td><td>28506</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 蛍光光度計 (Wi-Fi 付き)</td><td>Thermofisher</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Thermofisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubitt reagent kit for ds DNA, broad range</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32853 (500 assays)塩化</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム</td><td>HiMedia</td><td>TC046M-500G</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal</td><td>Cycler BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Cycler (ProFlex 3 x 32-well PCR System)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量dnaの抽出の強化 

Enhanced Extraction of Low-Molecular Weight DNA from Wastewater for Comprehensive Assessment of Antimicrobial Resistance

環境監視は、パンデミック後の時代の公衆衛生を評価するための重要なツールとして認識されています。水、特に廃水は、環境中の病原体負荷をサンプリングするための選択源として浮上しています。開放排水路や地域の水処理施設からの廃水は、病原体と薬剤耐性(AMR)遺伝子の両方の貯蔵庫であり、頻繁に人間と接触します。水からAMRを追跡する方法はたくさんありますが、不均一なサンプルから高品質のDNAを高収率で単離することは依然として課題です。これを補うために、サンプル量を多くする必要があることが多く、現実的な制約が生じます。さらに、環境DNAは断片化されることが多く、AMR(プラスミド、ファージ、直鎖DNA)の供給源は低分子DNAで構成されています。しかし、直鎖状および低分子量のDNAを高収率で抽出する方法に焦点を当てた抽出プロセスはほとんどありません。ここでは、ポリエチレングリコール(PEG)の沈殿特性を利用して、少量の廃水から高収率の線形DNAを抽出する簡単な方法が報告されています。この研究は、メタゲノム解析のために収集された水サンプルから、直鎖状DNAの割合を濃縮することにより、全体的なDNA収量を増加させることを実証しています。また、低分子DNAの増強は、高分子DNAや細胞内DNAに着目した環境AMRのアンダーサンプリングという現在の問題を克服するものです。この方法は、処理プラントからの排水など、細胞外DNAが存在するが低濃度の場合に特に有用であると期待されています。また、遺伝子の水平伝播によって広がるAMR遺伝子断片の環境サンプリングも強化されるはずです。

廃水サンプルからのDNAの高収率抽出のためのプロトコルの確立 以前に確立されたプロトコルの修正版を、水サンプル17からの高品質のDNAおよびRNAの抽出に使用した。サンプルは、北インドのデリー首都圏にあるオープンドレーンと下水処理場から供給されました。PEGとNaCl(図1)を使用して前処理を行った後、サンプルをキットで処理し、土壌と水からDNAを抽出しました。いずれの場合も、細胞内細菌のDNAに対応すると思われる顕著な高分子量バンドと、環境サンプル37に典型的なバックグラウンドスメアが観察された(図2)。
下水処理場(STP)の排水からの効率的なDNA抽出の欠如 オープンドレインとSTP流入物からは妥当な収量の全DNAが得られましたが(表3)、最終処理された廃液からはDNAは得られませんでした。低収率の問題は、以前の研究でも説明されています41 (図3)。廃水の塩素処理、場合によってはUVおよび限外ろ過処理を含む後処理42では、微生物負荷は低いと予想され、残留DNA(細胞外および断片化されたDNAを含む)は希釈される。サンプル濃度と核酸沈殿に使用されるPEGの初期低濃度は、低分子DNAを除外する可能性があります。言い換えれば、断片化されたDNAは最初の濃縮ステップで失われる可能性があります。
PEGとNaClの濃度が増加すると、低分子量のDNAが沈殿します PEG濃度の増加が低分子量DNAの濃縮に役立つかどうかを調べるために、長さの異なるPCRフラグメントの実験室標準試料を作成し、さまざまな直鎖状DNAフラグメントを作成しました(図4)。標準試料は、9% PEG-8000 + 0.3 M NaCl(元の組み合わせ)、9% PEG-8000 + 1.2 M NaCl(上昇塩のみ)、30% PEG-8000 + 0.3 M NaCl(上昇PEGのみ)、30% PEG-8000 + 1.2 M NaCl(塩とPEGの両方を上昇させる)の4つの異なる沈殿条件にさらされました。条件は、SARS-CoV-2サーベイランスに使用されている標準プロトコル17 と、環境サンプル33からのDNA抽出のモジュール式方法の研究で報告された条件に基づいて選択された。2つの異なる遠心分離速度(15,000 x g および20,000 x g )が、DNAペレット化43に対する異なる速度の影響に基づいて使用された。PEG濃度とNaCl濃度をそれぞれ30%と1.2 Mに増やすと、DNAの総回収率は約70%増加し、150塩基対(bp)の小さなDNA断片が効果的に沈殿しました(図5)。速度の違いは収率にあまり影響せず(図6A)、遠心分離時間が長かったことが原因である可能性があります。元のPEG/NaClの組み合わせでは全DNA回収率が低かったため、低分子量のバンドは存在していても、可視化限界以下の濃度にある可能性がありました。これを試験するために、沈殿のためのインプットDNAの量を増やし、各処理に対応する過剰なDNAをアガロースゲルにロードして可視化しました。30%PEGによる処理のみが、最も低い分子量、すなわち150 bpバンドの良好な回復を示しました(図6B)。
環状DNA(細菌ゲノムおよびプラスミドDNA)の沈殿は、同じ傾向をたどらない 大腸菌 MG155ゲノムDNAとプラスミド(pRSV、~4 kb)を異なるPEGおよびNaCl濃度での沈殿に使用しました。直鎖状DNAとは異なり、PEGおよびNaClレベルの上昇による大きな影響はなく(図7)、環状および高分子量DNA(通常は細胞内DNA)の収量はPEGの上昇による影響を受けないことが示唆されています。これは、PEG濃度とともに溶解度が急激に低下したタンパク質沈殿44に関する以前の観察とは対照的である。PEGがクラウディング剤として作用することを考えると、相互作用に利用可能な高分子の表面積が、沈殿剤としての有効性に重要な役割を果たすと仮定されます。線状DNAでは、サイズが大きくなると、相互作用に利用できる面積も増加すると仮定するのが合理的です。環状DNAでは、低濃度のPEGがすでに分子を飽和させるのに十分である可能性があり、さらに濃度を上げても相互作用の有効表面積が増加しない可能性があります。
PEGおよびNaClによる前処理沈殿を省略すると、廃水からのDNAの収量が不十分になります DNA抽出に前処理廃水が重要であるかどうかを調べるため、20 mLの熱不活化廃水(70°C、4時間)に10 mgの直鎖状標準試料を添加し、(a)PEG + NaClなし、(b)9% PEG + 0.3 M NaCl(オリジナルの組み合わせ)、および(c)20% PEG + 1.2 M NaCl(PEGおよび塩の増加)を加えて、4°Cで一晩インキュベートしました。次に、サンプルは、プロトコルで説明されているように、DNA抽出のために土壌キットを介して処理されました。抽出されたDNAの収量は、前処理ステップなしと比較して、9%PEG + 0.3 M NaClで前処理された廃水サンプルで60 %増加することがわかりました(図8)ことから、廃水サンプルから高収量DNAを得るためには、前処理PEGおよびNaCl沈殿が不可欠であることが示されています。また、高分子ゲノムDNA(gDNA)を含む全体のDNA収量は、高PEGと塩を沈殿に用いると低下する一方で、低分子DNAの割合が濃縮されることも注目に値します(図8)。PEGと塩を上昇させることによる全体的な収量の減少は、PEGの高粘度の性質に起因する可能性があり、上清を除去する際にDNAペレットが失われる可能性があります。これにより、提案された段階的DNA抽出法(図9)のケースが強化され、最初に低PEGおよびNaCl沈殿を使用して高分子量DNAを抽出し、得られた上清をPEGおよびNaClを増加させて別のラウンドの前処理を行うことで、最初の沈殿ラウンドを逃れた低分子量DNAを効率的に抽出できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig01.jpg"> 図1:廃水サンプルの前処理。 サンプル収集からDNA抽出までのワークフローを示す概略図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig02.jpg"> 図2:廃水サンプルから抽出したDNAの典型的なゲルプロファイル。 異なるサイトからサンプリングされた50〜100mLの廃水(図を参照)を、70°Cで4時間インキュベートすることにより熱不活性化しました。その後、9% PEGおよび0.3 M NaClとともに4°Cで一晩インキュベートし、その後、土壌またはウォーターキットを使用してDNAを抽出するために処理しました。抽出した全DNA約150 ngを1%アガロースゲルにロードし、マーカーとして1 kbの1キロ塩基対(kb)ラダーを添加し、電気泳動(90 V、30分)しました。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。右の表は、各レーンのサンプル収集源、処理された廃水の量、およびDNA抽出に使用されたキットの詳細を示しています。(STP:下水処理場;UVR:紫外線) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig03.jpg"> 図3:STP廃液サンプルは、総DNA収量が不十分であることを示しています。 STPの流入物および廃液からサンプリングした40mLの廃水を、70°Cで4時間インキュベーションすることにより熱不活性化しました。その後、9% PEGおよび0.3 M NaClと4°Cで一晩インキュベートし、土壌または水キット、または細菌ゲノムDNA抽出キットを使用してDNAを抽出するために処理しました。抽出した全DNA約150 ngを1%アガロースゲルにロードし、マーカーとして1 kbのラダーを添加し、電気泳動(90 V、30分)しました。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。廃液サンプルから抽出されたDNAの濃度は、廃水の1 ng / mL未満であったため、視覚化できませんでした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig04.jpg"> 図4:低分子量DNA沈殿の有効性をテストするための線形DNAサイズ標準試料の作成。表2に記載の通り、大腸菌(MG1655)ゲノムDNAを鋳型とプライマーおよび条件として用いたPCR増幅により、5つの異なるサイズのDNA断片を作製した。PCR 精製キットで精製した DNA(~1 μg)を 1% アガロースゲルにロードし、マーカーとして 1 kb ラダーを添加し、電気泳動(90 V、40 分)しました。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。レーンは、フラグメントが増幅された遺伝子名と予想されるアンプリコンサイズによってラベル付けされています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig05.jpg"> 図5:低分子量DNAは、最高濃度(30%)のPEGでのみ効率的に回収されます。 以前に生成したサイズ標準からのインプットDNA(3.34 μg)を、図に示すようにPEGとNaClのさまざまな組み合わせで処理し、プロトコルに詳述されているように抽出しました。使用した遠心分離速度は15,000 x gでした。インプット(レーン3)および1.2 M NaCl + 30% PEG(レーン7)の場合、0.8 μgのDNAをゲルにロードしました。残りの部分については、総収量が低かったため、16 μL で抽出した DNA の総量をロードし、1 kb ラダーをサイズマーカーとして 1% アガロースゲルにロードし、電気泳動 (80 V、45 分) を行いました。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。白いボックスは、150 bpの最低バンドを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig06.jpg"> 図6:低分子量DNAの回収率は、高塩濃度ではなく高PEGによって決定されます。 (A)サイズ標準からのインプットDNA(14μg)を、図に示すようにPEGとNaClの異なる組み合わせで処理し、プロトコルに詳述されているようにエタノール沈殿を使用して抽出しました。使用した遠心分離速度は、図に示すように15,000 x g と20,000 x g でした。インプットDNAと抽出したDNAの全量を、1 kbのラダーとともに1%アガロースゲルにロードし、電気泳動(90 V、30分)しました。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。(B)以前に生成したサイズ標準からのインプットDNA(15.67μg)を、図に示すようにPEGとNaClの異なる組み合わせで処理し、プロトコルに詳述されているように抽出しました。使用した遠心分離速度は15,000 x gでした。抽出したDNA(1.5 μg)を各レーンにロードし、1 kbのラダーをサイズマーカーとして1%アガロースゲルにロードし、電気泳動(80 V、45分)しました。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。白いボックスは、150 bpの最低バンドを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig07.jpg"> 図7:ゲノムDNAとプラスミドDNAの回収は、PEGおよびNaCl濃度の増加によって大きな影響を受けません。 インプットDNA(9 μg、4.5 μgプラスミドおよび4.5 μgゲノムDNA)を、図に示されているようにPEGとNaClの異なる組み合わせで処理し、プロトコルに詳述されているように抽出しました。使用した遠心分離速度は15,000 x gでした。 インプットDNAおよび抽出したDNAの全量を、1 kbのラダーとともに1%アガロースゲルにロードし、電気泳動(90 V、45分)に供しました。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。白いボックスはゲノムDNAとプラスミドDNAを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig08.jpg"> 図8:PEGとNaClによる前処理沈殿は、廃水からのDNAの高収率抽出に不可欠です。 熱不活化(70°C、4時間)廃水(20 mL)に、あらかじめ調製した線状標準物質10 mgを添加し、図に示すようにPEGおよびNaClを含まないか、またはPEGおよびNaCl濃度を変化させずに4°Cで一晩インキュベートしました。その後、土壌キットを用いてDNAを抽出するために処理しました。スパイキングに使用したインプットDNA(4 μg)(レーン1)と、9% PEG + 0.3 M NaCl(レーン3)の前処理ステップで抽出したDNA(4 μg)を1%アガロースゲルにロードしました。残りの条件では、収率が低かったため、抽出したDNAの全量をゲルにロードしました。サイズマーカーとして1kbのラダーも装填しました。ゲルを電気泳動(70V、2時間)した。DNAは、色素SYBR SAFEを用いて紫外線(UV)光下で可視化しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66899/66899fig09.jpg"> 図9:高分子DNAと低分子DNAの両方を濃縮するための廃水からのDNA抽出の提案された段階的な方法。 低濃度のPEGおよびNaCl濃度を使用した最初の前処理ステップで、廃水からDNAを抽出する2段階の方法を示すフローチャート。最初のステップの上清は、PEGとNaClを増加させた前処理沈殿の別のラウンドにかけられ、廃水から高分子量と低分子量の両方のDNAを効果的に抽出します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/66899fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
テーブル 1.環境サンプルからのDNA抽出の研究におけるPEGおよびNaClの以前の使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/Table%201-66899R1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
テーブル2.標準生成のためのプライマー配列とPCR条件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/Table%202-66899R1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
テーブル3。2023年に2ヶ月間にわたって廃水サンプルから得られたDNAの収量と品質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66899/Table%203-66899R1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、低分子量の細胞外DNAの割合を高めることにより、環境中の抗菌薬耐性(AMR)を評価する簡単な手法を紹介します。20%-30%のPEGと1.2 M NaClによる前処理により、ゲノムおよび水平伝播のAMR遺伝子の両方を検出できます。このプロトコルは、キット不要のプロセスに適しており、さらに最適化されています。

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