Name: 946;-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼのジ ウラフィス・ノキサ 病侵入に対するコムギ細胞壁防御機構の物理化学的性質の解明 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶコムギの細胞壁酵素β-1,3-グルカナーゼとペルオキシダーゼの機能。Diuraphis noxia侵入時の防御応答と育種への応用可能性を探索する。

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M.マファはNRF-Thuthuka(参照番号:TTK2204102938)から資金提供を受けました。S.N. Zondoは、修士号を取得するために国立研究財団大学院奨学金を受け取りました。著者らは、この研究で使用された種子を提供してくれた農業研究評議会-小粒穀物(ARC-SG)研究所に感謝しています。この資料で表明された意見、調査結果、および推奨事項は著者のものであり、したがって、資金提供者はそれに関していかなる責任も負いません。

RWAに感染したコムギ品種における細胞壁関連酵素の特性評価

<ol><li>Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylic+acid+is+involved+in+resistance+responses+in+the+Russian+wheat+aphid-wheat+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction.</a> J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).</li>
<li>Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+from+Russian+wheat+aphid-infested+wheat+induce+defense+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch+C+J+Biosci%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses.</a> Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).</li>
<li>Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactive+oxygen+species+are+involved+in+resistance+responses+of+wheat+to+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid.</a> J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+defense-related+genes+in+wheat+and+maize+against+Bipolaris+sorokiniana%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).</li>
<li>Botha, C. E., Matsiliza, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+transport+in+wheat+%28Triticum+aestivum%29+is+caused+by+sustained+phloem+feeding+by+the+Russian+wheat+aphid+%28Diuraphis+noxia%29%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia).</a> S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).</li>
<li>Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-wall+structural+carbohydrates+reinforcements+are+part+of+the+defense+mechanisms+of+wheat+against+Russian+wheat+aphid+%28Diuraphis+noxia%29+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation.</a> Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).</li>
<li>Walker, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sieve+element+occlusion%3A+Interaction+with+phloem+sap-feeding+insects+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review.</a> J Plant Physiol. 269, 153582(2022).</li>
<li>Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+developing+Russian+wheat+aphid+biotypes+remains+an+unsolved+enigma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma.</a> Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).</li>
<li>Saheed, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stronger+induction+of+callose+deposition+in+barley+by+Russian+wheat+aphid+than+bird+cherry-oat+aphid+is+not+associated+with+differences+in+callose+synthase+or+%CE%B2-1%2C3-glucanase+transcript+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance.</a> Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).</li>
<li>Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+cell+wall-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+and+peroxidase+induced+during+wheat-Diuraphis+noxia+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions.</a> Research Square. , (2024).</li>
<li>Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+damage+in+the+vascular+tissues+of+resistant+and+non-resistant+barley+%28Hordeum+Vulgare+L.%29+by+two+South+African+biotypes+of+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22NISEB+J%22%5BJournal%5D)">Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid.</a> NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).</li>
<li>Mohase, L., Taiwe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+fractions+from+South+African+Russian+wheat+aphid+biotypes+induce+differential+defense+responses+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afri+J+Plant+Soil%22%5BJournal%5D)">Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat.</a> S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).</li>
<li>Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-1%2C3-glucanases+in+wheat+and+resistance+to+the+Russian+wheat+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid.</a> Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dinitrosalicylic+acid+reagent+for+determination+of+reducing+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.</a> Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).</li>
<li>Zieslin, N., Ben-Zaken, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidases%2C+phenylalanine+ammonia-lyase+and+lignification+in+peduncles+of+rose+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers.</a> Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).</li>
<li>Damager, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+principles+insight+into+the+%CE%B1-glucan+structures+of+starch%3A+Their+synthesis%2C+conformation%2C+and+hydration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Rev%22%5BJournal%5D)">First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration.</a> Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).</li>
<li>Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insight+into+the+mechanism+and+biosynthesis%3A+proteases+may+regulate+callose+biosynthesis+upon+wounding%5BTitle%5D)+AND+%22Cellulose%22%5BJournal%5D)">New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding.</a> Cellulose. 10, 269-289 (2003).</li>
<li>Cierlik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+callose+and+%CE%B2-1%2C3-glucanases+during+aphid+infestation+on+barley+cv.+Clipper%5BTitle%5D)+AND+%22Master+thesis+in+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper.</a> Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).</li>
<li>Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterization%2C+and+biological+properties+of+%CE%B2-glucans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Adv+Pharm+Technol+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans.</a> J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).</li>
<li>Mafa, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+complex+oligosaccharides+and+CAZymes+activity+under+acid+conditions+constitute+the+Thatcher+%2B+Lr9+defense+responses+to+Puccinia+triticina%5BTitle%5D)+AND+%22Biologia%22%5BJournal%5D)">Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina.</a> Biologia. 78, 1929-1941 (2023).</li>
<li>Megazyme. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GOPOD+reagent+enzymes%3A+Assay+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Megazyme%22%5BJournal%5D)">GOPOD reagent enzymes: Assay procedure.</a> Megazyme. , 1-4 (2019).</li>
<li>Hlahla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photosynthetic+efficiency+and+carbohydrates+responses+of+six+edamame+%28Glycine+max.+L.+Merrill%29+cultivars+under+draught+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress.</a> Plants. 11 (3), 394(2022).</li>
<li>Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereal+host+interactions+with+Russian+wheat+aphid%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Interact%22%5BJournal%5D)">Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review.</a> J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).</li>
<li>Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphid+infestation+induces+PR-proteins+differently+in+barley+susceptible+or+resistant+to+the+birdcherry-oat+aphid+%28Rhopalosiphum+padi%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Plant%22%5BJournal%5D)">Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi).</a> Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).</li>
<li>Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+secondary+cell+wall+in+plant+resistance+to+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens.</a> Front Plant Sci. 5, 358(2014).</li>
<li>Rajninec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+%CE%B2-1%2C3-glucanse+from+Drosera+binate+exhibits+antifungal+potential+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants.</a> Plants. 10 (8), 1747(2021).</li>
<li>Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+immunocytochemical+localization+of+wheat+%CE%B2-1%2C3-glucanase+induced+by+Russian+wheat+aphid+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afri+J+Sci%22%5BJournal%5D)">Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation.</a> S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).</li>
<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loosening+of+plant+cell+walls+by+expansins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Loosening of plant cell walls by expansins.</a> Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).</li>
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著者は、この作品に関与する利益相反を宣言しません。

小麦と大麦は、ロシアのコムギアブラムシ(Diuraphis noxia)7,24を含むアブラムシ種が頻繁に蔓延する穀物作物です。抵抗性コムギ植物は、カロースとリグニンの蓄積を調節することにより、細胞壁を修飾するために、蔓延期間を通じて防御応答としてPODおよびβ-1,3-グルカナーゼ活性のアップレギュレーションを誘導します6,25,26,27。ほとんどの研究では、アポプラスト3,12,28からPODおよびβ-1,3-グルカナーゼ酵素が抽出されており、それらの細胞壁機能は非常に推測的であることに注意することが重要です。本研究では、細胞壁に結合したβ-1,3-グルカナーゼ、MLG特異的なβ-グルカナーゼ、および全タンパク質の一部としてPODを抽出する方法を開発しました。これらの酵素は、対照群と比較して抵抗性コムギ品種で非常に活性が高かったが、感受性品種では活性が遅れていた。実験でコントロールを使用することで、壁に結合した酵素の活性レベルに対する蔓延の影響を理解するのに役立ちました。3番目と2番目の葉組織をサンプリングして、感染したサンプルまたは対照サンプルにすることは、一貫性をもたらすため重要です。また、POD、β-1,3-グルカナーゼ、およびMLG特異的なβ-グルカナーゼ活性が小麦の苗の成長を増加させるため、感染した個体と対照を同じ期間でサンプリングします。
この研究で使用されたカードラン基質は、小麦-RWA相互作用7,24の間に細胞壁領域に堆積したポリマーであるカロースと同様の化学構造を持っています。オオムギMLG基質は、ほとんどの単子葉植物においてキシランと比較して低い割合で存在する細胞壁ヘミセルロースの一部を表しています。基質をクエン酸ナトリウムpH5緩衝液に溶解して、植物細胞壁領域29の酸性状態を模倣した。β-1,3-グルカナーゼとMLG特異的β-グルカナーゼをIWFで除去した場合、残りの葉組織から抽出された全タンパク質は、MLGおよびカードラン基質上で活性を持たなくなります。また、タンパク質抽出物が細胞質領域から供給された場合、それらは中性pH範囲で活性を示します。興味深いことに、両方の酵素が全タンパク質抽出物に存在していたのは、MLGおよびカードラン基質の加水分解に成功していたためです。それぞれの酵素によるMLGとカードランの加水分解により還元糖が生成され、Mafaらによる改変された方法に従ってDNS試薬によって検出されました6。サンプルの総還元糖濃度が高い場合、還元糖濃度が低いと、DNS試薬の色が黄色から暗褐色に変わるか、黄色から淡褐色に色が変わります(濃いオレンジ色に見えます)。
Guaiacol基質は、POD活性の測定に使用されました。PODは触媒効率が高いため、分光光度計の運動モードを使用してその活性を測定しました。PODは、基質(Guaiacol)の存在下での低濃度のH2O2によって活性化されます。この酵素の活性により、グアイアコールが変換され、茶色 - オレンジ色の化合物であるテトラグアイアコールが形成されます。テトラ・グアイアコールの製造により、PODがフェノール化合物を架橋してオリゴマーを生成するか、フェノール化合物をリグニンに組み込むことが確認されています。PODは、RWASA2に感染した耐性Tugela-Dn5でより高い活性レベルを示し、続いて中等度の耐性Tugela-Dn1が対照と比較して示されました。しかし、PODの活動レベルは、感染した感受性ツゲラでは時間の経過とともに大幅に減少しました。この研究の結果は、RWASA2に感染した耐性コムギ品種がPODを使用してリグニンまたはリグニン-ヘミセルロース結合を架橋することにより細胞壁を強化するという主張によって支持されました6。PODが機能するためにはH2O2が必要であり、これは、細胞壁領域のH 2O2のレベルを調節することにより、細胞壁構造炭水化物の酸化または漂白を減少させたことを示しています。
さまざまなpHおよび温度条件を使用して、これらの細胞壁結合酵素の生化学的最適条件を決定しました。最適条件は、酵素が酸性pH範囲(pH 5)で最適な活性を持つことを示し、これは酵素が細胞壁領域と関連していることを示唆しています。β-1,3-グルカナーゼの最適温度は、β-1,3-1,4-グルカン基質およびβ-1,3-グルカン基質をそれぞれ加水分解するときに、25°Cおよび40°Cで得られました。この観察により、β-1,3-グルカナーゼとMLG特異的β-グルカナーゼは、RWASA2の蔓延中に抵抗性コムギ品種の細胞壁領域に誘導された2つの異なる酵素であることが確認されました。生化学的特性評価は、類似した基質を持つさまざまな酵素を発見または同定するための有望な方法ですが、ウェスタンブロッティングやザイモグラムアッセイなど、他の面倒で正確な方法を使用することをお勧めします。最後に、MLG特異的なβ-グルカナーゼの酵素活性の様式は、MLGオリゴ糖が不足しているため定量化できませんでした。しかし、RWASA2に感染したTugela-Dn5およびTugela-Dn1から抽出されたβ-1,3-グルカナーゼは、LAM5、LAM4、およびLAM3に対して高い活性を示し、感受性Tugelaから抽出されたグルカナーゼは、LAM5およびLAM4に対して高い活性を示しました。このことから、酵素活性の様式を研究することで、RWAに感染した耐性品種と感受性品種に誘導されるβ-1,3-グルカナーゼの微妙な違いも検出できることが確認されています。
現在の研究では、コムギの葉組織から細胞壁に結合した酵素を抽出するための詳細な手順が示されています。抽出後、細胞壁に結合した酵素、すなわちβ-1,3-グルカナーゼ、MLG特異的β-グルカナーゼ、PODの3つを同定しました。これらの酵素の活性レベルは、RWASA2に感染した中等度の耐性Tugela-Dn1および耐性Tugela-Dn5品種で、対照群よりも有意に高かった。これらのことから、細胞壁に結合した酵素が耐性品種の防御応答に寄与していることが確認されました。この特性評価の結果は、細胞壁PODとβ-1,3-グルカナーゼが同じ条件下で機能することが示唆されており、コムギとRWASA2の相互作用中に細胞壁を相乗的に強化することが示唆されています。
現在説明されているプロトコルに干渉するいくつかの制限が特定されています。コムギの不足により、酵素サンプルの抽出に利用できる葉の材料が制限される可能性があります。細胞壁酵素を抽出する前に、アポプラスト由来のIWFが葉サンプルからうまく抽出されない場合、アポプラスト酵素と細胞壁酵素の両方が組み合わされる可能性があります。IWFと細胞壁領域酵素の組み合わせにより、細胞壁に結合した細胞壁結合酵素の研究が困難になります。現在のプロトコルでは、他の制限は確認されていません。

ロシア産コムギアブラムシ(RWA)は、小麦や大麦に蔓延し、大幅な収量減少や穀物品質の低下を引き起こします。コムギは、耐性品種のβ-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼ活性レベルを増加させるなど、いくつかの防御応答を誘発することにより蔓延に応答しますが、感受性品種は、初期の蔓延期間1,2,3,4でこれらの酵素の活性を低下させます。コムギ植物におけるβ-1,3-グルカナーゼとPODの主な機能には、抵抗性品種におけるカロース蓄積の調節と、RWAの蔓延中に細胞壁とアポプラスト領域で消光する活性酸素種(ROS)が含まれていました1,3,5,6,7。Mafaら6は、RWASA2の蔓延時に、耐性コムギ品種のPOD活性の増加とリグニン含有量の増加との間に強い相関関係があることを示しました。さらに、リグニン含有量の増加は、感染した抵抗性コムギ品種の細胞壁が強化され、RWAの摂食が減少したことを示しました。
ほとんどの研究者グループは、小麦/大麦-RWA相互作用中のアポプラストβ-1,3-グルカナーゼとPODを抽出して研究しました。さらに、これらの研究のほとんどは、これらの酵素が細胞壁領域での酵素の存在を測定することなく、RWAが蔓延した小麦植物の細胞壁に影響を与えると主張していました。顕微鏡技術を使用して、β-1,3-グルカナーゼ活性レベルがカロース調節に関連していることを示したり、耐性6,10のPOD活性と細胞壁修飾との相関関係を実証するために主要な細胞壁成分を抽出したりした研究はごくわずかです。β-1,3-グルカナーゼとPODの細胞壁との会合を調査できていないことは、研究者が細胞壁に結合した酵素を直接測定できる方法を開発する必要があることを示しています。
現在の方法では、細胞壁結合酵素を抽出する前に、葉組織からアポプラスティ液を除去することが必要であると提案されています。アポプラスチック液の抽出手順は、細胞壁結合酵素の抽出に使用される葉組織から2回実行する必要があります。このプロセスにより、アポプラスト酵素と細胞壁領域に見られる酵素との汚染と混同が減少します。そこで、本研究では、細胞壁に結合したPOD、β-1,3-グルカナーゼ、およびMLG特異的なβ-グルカナーゼを抽出し、それらの生化学的特性評価を行った。

<table><tbody><tr><td>10 kDa遠心分離機濃縮膜装置</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1NB84206</td><td>研究専用です。診断手順には使用できません。生物学的溶液の濃縮と精製に。</td></tr><tr><td>2 g Laminaribiose</td><td>Megazyme (Wicklow, Ireland)</td><td>O-LAM2</td><td>研究、生化学酵素アッセイ、体外診断分析で使用する高純度ラミナリビオース。</td></tr><tr><td>3 g Laminaritriose</td><td>Megazyme (Wicklow, Ireland)</td><td>O-LAM3</td><td>研究、生化学酵素アッセイ、体外診断分析で使用するための高純度ラミナリトリオース。</td></tr><tr><td>3,5 ジニトロ サリチル酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0550</td><td>還元糖の比色測定に使用</td></tr><tr><td>4 g Laminaritetraose&nbsp;</td><td>Megazyme (ウィックロー、アイルランド)</td><td>O-LAM4</td><td>研究、生化学酵素アッセイ、体外診断分析で使用するための高純度ラミナリテトラオース。</td></tr><tr><td>5 g Laminaripentaose</td><td>Megazyme (Wicklow, Ireland)</td><td>O-LAM5</td><td>研究、生化学的酵素アッセイ、体外診断分析で使用するための高純度ラミナリペンタオース。</td></tr><tr><td>95% 無水エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107017</td><td>分析用エタノール絶対</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B00063</td><td>Acetc 酸 氷河 100% 分析用(酢酸含有)</td></tr><tr><td>Azo-CM-Cellulose</td><td>Megazyme (アイルランド・ウィックロー)</td><td>S-ACMC</td><td>多糖類は、糖残基20個につき約1分子の程度まで、レマゾルブリリアントブルーRで染色されています。</td></tr><tr><td>ベータグルカン(大麦)&nbsp;</td><td>Megazyme (Wicklow, Ireland)</td><td>G6513</td><td>水に溶けにくい粉末状の基質。&beta;-1,3-グルカナーゼ活性の測定に使用されます。</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Dye</td><td>Bio-Rad Laboratories, South Africa</td><td>500-0006</td><td>比色アッセイ色素、濃縮液、Bio-Rad Protein Assay キット I および II 用 &nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td> <td>Gibco Europe</td><td>810-1018</td><td>ラボ用のみ</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td>ライフサイエンス研究用のみ。診断手順には使用できません。</td></tr><tr><td>CMカードラン&nbsp;</td><td>Megazyme (Wicklow, Ireland)</td><td>P-CMCUR</td><td>&beta;-1,3-グルカナーゼ活性を測定するための粉末基質。水に不溶です。</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>ライフサイエンス研究専用です。診断手順には使用できません。</td></tr><tr><td>Guaiacol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td>酸化インジケーター。ペルオキシダーゼ活性の測定に使用されます。</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>BDHラボ用品、イギリス</td><td>10366</td>強力な<td>酸化剤。</td></tr><tr><td>Mikskaar Professional Substarte</td><td>Mikskaar (エストニア)</td><td>NI</td><td>泥炭苔ベースの苗基質。</td></tr><tr><td>マルチフィード肥料 (5.2.4 (43))</td><td>マルチフィードクラシック</td><td>B1908248</td><td>最適な根の発達を確保するための高リン(P)要件を持つ若い発育中の植物や苗木用の水溶性肥料です。</td></tr><tr><td>ナフトール</td><td>メルク、ドイツ</td><td>N2780</td>触媒<td>の存在下で水素化を受けます。</td></tr><tr><td>フェノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33517</td><td>感光性。R&の場合Dのみ使用します。薬物、家庭、またはその他の用途には使用しないでください。SDS利用可能な</td></tr><tr><td>酒石酸カリウムナトリウム四水和物(ロシェル塩)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2377</td>は、<td>還元糖の測定に使用される3,5-ジニトロサリチル酸溶液の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>シリカプレート(TLCシリカゲル60 F254)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60778-25EA</td><td>シリカゲルマトリックス、蛍光インジケーター付き 254 nm</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>R&Dのみ使用します。薬物、家庭、またはその他の用途には使用しないでください。</td></tr><tr><td>メタ重亜硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31448</td><td>3,5-ジニトロサリチル酸溶液の調製中に酸化防止剤として添加されます。</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>pHを一定に保つための生物学的研究の緩衝液として使用されます。</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td>水に溶ける無機化合物。ケイ酸塩ベースのグラウトの開発における試薬として使用されます。</td></tr><tr><td>統計分析ソフトウェア</td><td>TIBCO Statistica</td><td>バージョン 13.1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>メルク、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>30743</td><td>硫酸 95-97% Hg、ACS 試薬の分析用。</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10812846001</td><td>インキュベーション混合物中の緩衝剤&nbsp;また、溶解およびTE(Tris-EDTA)バッファーの成分としても使用されています。ライフサイエンス研究専用です。診断手順には使用できません。</td></tr><tr><td>UV&ndash;可視分光光度計</td><td>GENESYS 120&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;NI = 特定されていません。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

#946;-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼのジ ウラフィス・ノキサ 病侵入に対するコムギ細胞壁防御機構の物理化学的性質の解明

Elucidating &#946;-1,3-Glucanase and Peroxidase Physicochemical Properties of Wheat Cell Wall Defense Mechanism Against Diuraphis noxia Infestation

ロシア産コムギアブラムシ(RWA)に感染したコムギ植物は、過敏反応(HR)やβ-1,3-グルカナーゼやペルオキシダーゼ(POD)などの病原性関連(PR)タンパク質の誘導など、一連の防御応答を誘発します。この研究は、細胞壁関連PODとβ-1,3-グルカナーゼの物理化学的特性を特徴付け、RWASA2-小麦相互作用中の細胞壁修飾に対するそれらの相乗性を決定することを目的としています。感受性Tugela、中等度抵抗性のTugela-Dn1、および抵抗性Tugela-Dn5品種は、温室条件下で事前に発芽および植え付け、植え付け後14日で施肥し、3日ごとに灌漑しました。植物には、3葉の段階で同じRWASA2クローンの単為生殖個体20人が感染し、葉は寄生後1〜14日で収穫されました。細胞間洗浄液(IWF)を真空ろ過を用いて抽出し、-20°Cで保存した。 葉の残渣を粉砕して粉末にし、細胞壁成分に利用しました。PODの活性と特性評価は、5 mMのグアイアコール基質とH2O2を使用して決定され、470 nmでの吸光度の変化をモニタリングしました。β-1,3-グルカンおよびβ β-1,3-グルカン基質および-1,3-1,4-グルカン基質を用いたDNS試薬による加水分解物中の総還元糖の測定、540nmでの吸光度の測定、グルコース標準曲線を用いて、-1,3-グルカナーゼ活性、pH、および温度の最適条件を実証した。最適pHはpH 4〜9、最適温度は25〜50°C、熱安定性は30°C〜70°Cの間で決定されました。β-1,3-グルカナーゼ基質の特異性は、カードランおよび大麦β-1,3-1,4-グルカン基質を使用して、25°Cおよび40°Cで決定されました。さらに、β-1,3-グルカナーゼの作用機序は、ラミナリビオースからラミナリペンタオースまでを用いて決定されました。オリゴ糖加水分解生成物のパターンを薄層クロマトグラフィー(TLC)で定性的に分析し、HPLCで定量的に分析しました。この研究で提示された方法は、RWAを小麦に寄生させ、細胞壁領域からペルオキシダーゼとβ-1,3-グルカナーゼを抽出し、それらの包括的な生化学的特性評価を行うための堅牢なアプローチを示しています。

コムギ品種の4つの生物学的複製物(Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5)は、3葉の成長段階でRWASA2に感染しました。蔓延後、葉は1、2、3、7、および14dpiで収穫されました。対照処理にはRWASA2が寄生していなかったため、実験結果はストレスにさらされていない小麦植物と同等になりました。実験は四重極で行われ、結果は平均値として提示されました。
RWASA2 に感染した抽出物と対照抽出物の両方のタンパク質濃度は、BSA をタンパク質標準として使用して定量しました。これは、β-1,3-グルカナーゼとPODの酵素活性を決定し、すべての反応で使用されるタンパク質濃度がすべてのサンプルで既知であることを確認するのに役立ちました。その差はごくわずかでした。データは、グラフ形式または表形式で表示できます。最初のグラフ形式は、酵素活性と特性評価アッセイ結果の両方について、侵入後日数(x軸)に対してプロットされた酵素特異的活性(y軸)を表すために使用されました。RWASA2に感染した耐性Tugela-Dn5 サンプルにおけるβ-1,3-グルカナーゼ、MLG特異的β-グルカナーゼ、およびPODの比活性の増加は、酵素が防御応答に関与していることを示しました(図1 および 図2)。さらに、両方の酵素は、RWASA2が感染した感受性ツゲラで時間の経過とともに活性を有意に失いました。
細胞壁に関連するβ-1,3-グルカナーゼとPODの生化学的特性は、活性を相対活性または特異的酵素活性のパーセンテージで表すことによって決定され、それぞれ折れ線グラフと棒グラフで表されます(図3)。その結果、β-1,3-グルカナーゼとPODは、酸性細胞壁条件に対応するpH類似の最適条件(pH 5)を持つことが示されました(図3)。MLG特異的なβ-グルカナーゼもpH 5で特異的な活性を示したことに注意することが重要です。しかし、同じ条件で最大80%の相対活性を失ったβ-1,3-グルカナーゼよりも塩基性条件で安定していました。その結果、MLGとβ-1,3-グルカン基質を触媒する2つの酵素が、最適なpHに基づいて細胞壁領域から正常に抽出されたことが確認されました。この主張は、β-1,3-グルカナーゼが50°Cまでの温度にのみ耐え、70°Cで80%以上の相対活性を失うことが確認された熱安定性アッセイの結果(図4)によって検証されました(PODは同じプロファイルを持っていました)。対照的に、MLG特異的なβ-グルカナーゼ酵素は、25°Cで最も高い活性を示し、その後徐々に活性が低下しましたが、この酵素は50°Cおよび70°Cで50%以上の相対活性を保持しました。 その結果、MLG特異的なβ-グルカナーゼは、Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5から抽出されたβ-1,3-グルカナーゼおよびPODと比較して、独特の生化学的特性を示すことが確認されました。
β-1,3-グルカナーゼの作用機序は、DPが5〜2のラミナリンオリゴ糖(LAM5〜LAM2と呼ばれる)で実証されました。TLCの結果は、寄生したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5がβ-1,3-グルカナーゼ酵素を持っており、短いオリゴ糖(LAM3)と比較して、主に長いオリゴ糖(LAM5およびLAM4)を加水分解することを示しました。TLCプレート上に視覚化された青紫色の斑点の強度は、LAM5とLAM4のバンドの強度が低く、耐性と中程度の耐性の品種でLAM3がそれに続くことを示しました(図5)。感受性の高いツゲラ品種は、β-1,3-グルカナーゼが他のオリゴ糖(LAM4-LAM2)よりもLAM5を加水分解し、より強いバンドを示したことを示しました。作用機序は、加水分解物の濃度としても表され、より短いオリゴ糖(LAM3およびLAM2)の加水分解中に、より高いDPと中程度の活性を持つラミナリンオリゴ糖の効率的な加水分解を示すヒートマップの表に示されています(表1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig01.jpg"> 図1:RWASA2に感染したTugela(A)、Tugela-Dn1(B)、およびTugela-Dn5(C)から抽出されたペルオキシダーゼの比活性(感染後14日)。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmolテトラ-グアヤコール/分を表し、<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig02.jpg"> 図2:RWASA2に感染したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5の品種で測定されたβ-1,3-グルカナーゼ特異的活性。酵素活性は、化学的に異なる2つのグルカン基質、すなわち混合結合β-1,3-1,4-グルカン(A-C)とカードラン(D-F)を用いて行った。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmol/hを表します<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig02large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig03.jpg"> 図3:RWASA2から抽出したβ-1,3-グルカナーゼ酵素のpH最適アッセイでは、感染後3日目にTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5が感染しました。実験は、混合結合-β-1,3-1,4-グルカン(A-C)およびカードラン(D-F)基質を用いて行った。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmol/hを表します<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig03large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig04.jpg"> 図4:耐熱性アッセイ。RWASA2に感染したTugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5に由来するβ-1,3-グルカナーゼの熱安定性アッセイは、寄生の3日後に、β-1,3-1,4-グルカン(A-C)およびβ-1,3-グルカン(D-F)で調査されました。実験は四重で行われました。値とエラーバーは、それぞれSD±平均を表します。U/mgタンパク質中のUはμmol/hを表します<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig04large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66903/66903fig05.jpg"> 図5:ラミナリンオリゴ糖に対するβ-1,3-グルカナーゼの作用機序の解析。 ラミナリンオリゴ糖はL5、L4、L3、L2で表され、それぞれラミナリペンタオース(LAM5)、ラミナリテトラオース(LAM4)、ラミナリトリオース(LAM3)、ラミナリビオース(LAM2)と同等であった。赤い矢印はグルコース(GLU)を示し、青い矢印はオリゴ糖を含まない酵素のプロファイルを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/66903fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:RWASA2が3日間寄生したコムギ品種から抽出された濃縮β-1,3-グルカナーゼで製造されたラミナリン-オリゴ糖。 加水分解物中のオリゴ糖の濃度は、LC-MSで測定しました。LAM5、LAM4、LAM3、LAM2、およびGLUは、それぞれラミナリペンタオース、ラミナリテトラオース、ラミナリトリオース、ラミナリビオース、グルコースを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66903/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコルは、コムギ植物における細胞壁関連酵素、主にβ-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼを研究し、特徴付けるために使用される手順を説明しています。それらの活性レベルは、コムギとRWAの相互作用中に増加し、アブラムシの摂食を阻止する細胞壁強化を通じて植物の防御応答に関与しています。

Wheat plants infested by Russian wheat aphids (RWA) induce a cascade of defense responses, including the hypersensitive responses (HR) and induction of ...

elucidating-13-glucanase-peroxidase-physicochemical-properties-wheat

Research

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学ぶコムギの細胞壁酵素β-1,3-グルカナーゼとペルオキシダーゼの機能。Diuraphis noxia侵入時の防御応答と育種への応用可能性を探索する。

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