Name: マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶマウス海馬歯状回の顆粒細胞におけるin vivoカルシウムイメージング手法。ウイルス注入とGRINレンズ埋め込みを単一手術で統合し、神経活動と認知機能の神経コードを高精度に解析する革新的なプロトコルです。

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この研究は、復旦大学21TQ1400100(22TQ019)、上海市科学技術メジャープロジェクト、臨港研究所(助成金番号。LG-QS-202203-09)および中国国家自然科学基金会(32371036)。

マウスの歯状回細胞におけるニューロン活動のリアルタイムイメージング 

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</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

ここでは、マウスのDGにおける in vivo カルシウムイメージングの手順について説明しました。このプロトコルは、さまざまな認知プロセスにおけるDG機能の研究を目指す研究者、特に遺伝的に同定された亜集団が関心のある場合に有用であると考えています。ここでは、手術におけるいくつかの重要なポイントを強調しながら、私たちのプロトコルの利点を説明し、この方法の限界について説明します。
私たちは、入手可能な文献からDGイメージングのさまざまな手順をテストし、このプロトコルで詳述されているように実験手順を最適化しました。私たちの意見では、次の3つの主要な変更により、プロトコルの成功率が大幅に向上しました。まず、すべての外科的処置を一度に組み合わせましたが、皮質下領域に対する多くのカルシウムイメージング研究では、ウイルス注射とレンズ埋め込みを2つの別々の手術で行いました。私たちのアプローチの主な利点は、ウイルスの発現と脳組織の回復が同時に行われるようになり、通常21か月かかるマウス調製の待ち時間が半分に短縮されたことです。さらに、別々の手術では、100μmの範囲のミスマッチを伴うわずかな傾きが手術の失敗につながるため、マウスの正確な再配置が必要です。レンズの位置を間違えないように、一部のグループは、ミニスコープをレンズに取り付け、埋め込み手術中にセンサーのニューロンの発現を見る方法を開発しました。この回避策は、一般的に使用される定位固定装置の自明なエンジニアリングを必要とし、麻酔中のニューロン活動の抑制のために使用するのは複雑です。私たちの方法はマウスの位置を変える必要がないため、手順に関連する時間とストレスを大幅に軽減します。
私たちのアプローチの2つ目のポイントは、ターゲットエリア22に少量のウイルスを繰り返し注入することです。これにより、より多くの細胞が感染します。重要なことに、このアプローチは、単一の注射部位でウイルス負荷を増加させる場合と比較して、感染した細胞の位置が視野全体に均一に広がるという点で優れた結果をもたらしました。また、ウイルスの力価を希釈すると、カルシウムイメージングの品質が向上することも関連するポイントです。私たちの経験では、過剰な量のウイルスが波状の活動群の出現と関連しており、これは以前の報告23と一致しています。当初、組織吸引が注射部位でのウイルスの早期除去と不十分な発現につながるのではないかと疑っていましたが、そのような現象は観察されず、私たちのプロトコルは一般的に標的領域の強力な感染をもたらしました。GCaMPを発現するトランスジェニックマウスと比較すると、ウイルスのアプローチは必然的に一貫性が低くなりますが、複雑な育種を必要としないため、より柔軟な使用が可能です。しかし、GCaMPの発現は隣接する脳構造に流出したり、標的の脳領域に不均一に分布したりする可能性があるため、固定組織からのウイルスと水晶体の解剖学的位置を注意深く調べることは、結果の解釈にとって重要です。領域特異的または細胞型特異的なCreラインとCre依存性GCaMP発現を組み合わせることで、イメージングシグナルの特異性が向上する可能性があります。
私たちのプロトコルの3番目の重要なポイントは、レンズの埋め込み中に、レンズの挿入とすすぎを数回繰り返して、埋め込み領域に血液が残っていないことを確認したことです。これは、組織の回復を促進し、手順の成功率を向上させるための重要な操作です。正確なメカニズムはわかっていませんが、レンズの挿入は必然的に組織に何らかの損傷を引き起こし、すすぎステップでこの損傷に関連する出血が解消されると推測しています。そうしないと、挿入に伴う出血が脳がクリアになるまでに長い時間がかかる可能性があり、局所的な炎症やマクロファージの浸潤の可能性が高まり、どちらも光学品質を低下させます。さらに、このプロトコルで提供した座標では、レンズを矢状縫合糸に少し近づけると、通常、見える細胞の数が増えることがわかりましたが、第3脳室への穿孔を避けることが重要です。また、この手順のトラブルシューティングを改善するために、一般的な問題のリストも用意しています(表1)。
マウスは、頭への追加の重量の影響を最小限に抑えるために、行動実験の前にダミーのミニスコープを着用するように訓練する必要があります。通常、このトレーニングは~3日間行われ、各セッションは20分間続きます。行動実験中は、マウスの体調を定期的に監視する必要があります。マウスの行動パフォーマンスは、その健康状態によって大きく影響を受けます。
このプロトコルには、いくつかの制限があります。まず、カルシウムイメージングは神経活動の代用であり、センサーの発現によって影響を受ける可能性があることに注意する必要があります。ミニスコープを用いた一光子イメージング法では、隣接する細胞からのシグナルが重なり合うことがあり、その後の解析からデミキシングする必要があります。さらに、私たちのプロトコルには侵襲的な手術が含まれます。GRINレンズの移植ステップでは、通常、CA1領域の一部、後脾臓皮質、および連想視覚野を含む脳組織の塊が除去されます。これは、単一光子照明によって提供されるイメージング深度の制限のために必要です。私たちの観察では、外科的処置後のマウスには、一般的な無制限の行動においても、線形追跡課題の学習においても、明らかな行動障害は見られませんでした(補足図S1)。あるいは、脳組織吸引のための自動手術器具の使用は、手動操作に関連するエラーを減らすことができ、それにより外科的処置24の精度を高めることができる。さらに、私たちのカルシウムイメージングデータは、一般的に正常なカルシウム動態をもたらしました。より複雑な認知機能への影響については、さらに特徴づける必要がある。組織吸引を伴わないレンズ挿入の代替方法は、25以前に説明されています。これは、意図した挿入路に沿って脳組織に切り込みを入れ、レンズを開口部に直接挿入することによって達成されます。私たちの経験では、このアプローチは挿入管に沿った脳組織の折り畳みやその他の変形につながりますが、それでも侵襲的である可能性があります。変形の変動性が高いため、このアプローチは、説明したプロトコルよりも信頼性が低くなります。このプロトコルのもう1つの潜在的な注意点は、マウスの動作性能が、ミニスコープとミニスコープデータ収集(DAQ)ボックスを接続する同軸ケーブルによってわずかに影響を受けることです。これは、何度も巻くとワイヤーが巻き付くだけでなく、タスク中にワイヤーがマウスの気を散らす可能性があるためです。ワイヤレスミニスコープ26 を使用すると、この問題を効果的に解決できます。 
既存の制限にもかかわらず、この方法論は、海馬歯状回内のニューロン活動パターンを研究するためにin vivoカルシウムイメージングを使用することに関心のある研究者にとって非常に有益であると考えています。例えば、このin vivoカルシウムイメージングアプローチは、歯状回領域内の場所細胞を特異的に調査するために適用できます。これにより、場所細胞がさまざまな脳領域10,27にわたって情報をどのようにコード化するかの調査が可能になります。私たちの検証は、このプロトコルが合理的に再現可能であり、成功率が高く、さまざまな脳領域に適用できることを示しています。

これまでの研究では、海馬は記憶の処理や想起に不可欠な脳の構造であることがわかっています1,2。1950年代以降、げっ歯類の海馬の神経回路は、記憶の形成、保存、および検索の研究において焦点となってきました3。海馬内の解剖学的構造には、歯状回(DG)、CA1、CA2、CA3、CA4、およびsubiculum4の亜領域が含まれます。これらのサブリージョン間には複雑な双方向の接続が存在し、そのうちDG、CA1、およびCA3は、顆粒細胞と錐体細胞5からなる顕著な三シナプス回路を形成しています。この回路は、嗅内皮質(EC)から主要な入力を受け取り、シナプスの可塑性を研究するための古典的なモデルとなっています。海馬機能に関する以前のin vivo研究は、そのアクセスの容易さから、主にCA1 6,7に集中していました。CA1ニューロンは、記憶の形成、固定、および検索において重要な役割を果たしますが、特に空間記憶のための細胞では、海馬の他のサブ領域も重要です8,9。特に、最近の研究では、記憶形成におけるDGの機能が注目されています。DGの場所細胞はCA110の場所細胞よりも安定していることが報告されており、その活動は状況特異的な情報を反映している11。さらに、DG顆粒細胞の活性依存的な標識は、記憶関連の行動を誘導するために再活性化することができる12。したがって、DGの情報コーディングをより深く理解するためには、動物が記憶依存的なタスクを実行している間のDG亜領域の活動を調査することが重要です。
DG活性に関する先行研究では、主に in vivo 電気生理学13が用いられてきた。しかし、この手法にはいくつかの欠点があります:まず、電気記録では、シグナルを生成しているさまざまな種類の細胞を直接特定することが難しい場合があります。記録されたシグナルは、抑制性細胞と興奮性細胞の両方からのものです。したがって、これら2つの細胞タイプを分離するためには、さらなるデータ処理方法が必要となる。さらに、プロジェクション特異的なサブグループや活性依存的な標識など、他の細胞型情報を電気記録と組み合わせることは困難です。さらに、DGの解剖学的形態により、記録電極は直交方向に埋め込まれることが多く、記録できるニューロンの数が大幅に制限されます。したがって、電気記録が同一動物14のDG構造から数百の個々のニューロンをモニタリングすることは困難である。
DGにおけるニューロン活動を記録する補完的な技術は、 in vivo カルシウムイメージング15を使用することである。カルシウムイオンは、生物の細胞シグナル伝達プロセスの基本であり、特に哺乳類の神経系における多くの生理学的機能において重要な役割を果たしています。ニューロンが活動しているとき、細胞内のカルシウム濃度は急速に増加し、これはニューロンの活動とシグナル伝達の動的な性質を反映しています。したがって、ニューロンの細胞内カルシウムレベルのリアルタイムな変化を記録することは、神経コードメカニズムに関する重要な洞察を提供します。
カルシウムイメージング技術は、特殊な蛍光色素または遺伝子組み換えカルシウムインジケーター(GECI)を利用して、蛍光強度の変化を検出することによりニューロン内のカルシウムイオン濃度をモニターし、それを顕微鏡イメージング16で捉えることができる。一般に、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン、およびM13ポリペプチド配列を含むカルシウム指標遺伝子のGCaMPファミリーが採用されます。GCaMPは、カルシウムイオン17に結合すると緑色蛍光を発することができ、緑色蛍光の変動をイメージング18を通じて記録することができる。さらに、標的の脳領域の鮮明な画像を得るために、通常、グラディエントインデックスレンズ(GRINレンズ)を関心領域の上に埋め込む。GRINレンズは、表面から直接アクセスできない脳深部領域のイメージングを可能にします。
この手法は、他の遺伝ツールと組み合わせて、さまざまな細胞タイプを標識するのに比較的簡単です。さらに、イメージング面はDGの細胞の向きと平行であるため、手術が成功するたびに数百のニューロンがイメージングに利用できます。この研究では、マウスの歯状回における in vivo カルシウムイメージングのための完全で詳細な手術プロトコルを紹介します(図1)。この手順には、2つの主要な操作が含まれます。1つ目は、AAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスをDGに注入することです。2つ目の手術は、ウイルス注入部位の上にGRINレンズを埋め込むことです。これら2つの手順は、同じ座り方で行われます。これらの手術から回復した後、次のステップは、小型顕微鏡(ミニスコープ)でイメージング品質を確認することです。イメージングフィールドに数百の活性細胞がある場合、その後の手順は、歯科用セメントを使用してミニスコープベースプレートをマウスの頭蓋骨に取り付けることです。その後、マウスをイメージング実験に使用できます。また、収集されたカルシウムデータの解析を効率化するためのMATLABベースの前処理パイプラインについても紹介します。

<table><tbody><tr><td>200 &mu;L ユニバーサルピペットチップ</td><td>Transcat ピペット</td><td>1030-260-000-9</td><td>血液と生理食塩水を除去するため</td></tr><tr><td>25 G ルアーロック 鈍い針 (プリベントディスペンシングチップ)</td> <td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>脳組織を除去するため</td></tr><tr><td>3D プリント保護キャップ</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>GRIN レンズを保護するには</td></tr><tr><td>75% エタノール</td><td>Shanghai Hushi Laboratory Equipment Co.,Ltd</td><td>bwsj-230219105303</td><td>GRINレンズ表面の消毒・洗浄用</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&α;-GCaMP6f ウイルス</td><td>ブレインケース</td><td>BC-0083</td><td>ウイルス注射用</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 version 22.1</td><td>図を描くため</td></tr><tr><td>麻酔エアポンプ</td><td>RWDライフサイエンス株式会社</td><td>R510-30</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>カメラ制御ソフト</td><td>Daheng Imaging</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>行動データの記録用</td></tr><tr><td>カニューレ/セラミックフェルールホルダー(GRINレンズホルダー)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68214</td><td>GRINレンズを保持するため</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>マウスの術後の痛みを軽減するため&nbsp;</td></tr><tr><td>同軸ケーブル</td><td>オープンエフィス</td><td>CW8251</td><td>ミニスコープとミニスコープDAQボックスを接続するには共</td></tr><tr><td>焦点顕微鏡</td><td>オリンパスライフサイエンス&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>脳のスライスを観察するため</td></tr><tr><td>綿棒</td><td>南昌Xiangyi医療機器有限公司</td><td>20202140438</td><td>消毒用</td></tr><tr><td>カスタマイズされたヘッドプレート</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>ランニングホイールにマウスを保持するため</td></tr><tr><td>カスタマイズされたヘッドプレートホルダー</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>マウスのヘッドプレートを保持するため</td></tr><tr><td>義歯ベースマティエラルス(自己硬化型)</td><td>ニューセントリーデンタル</td><td>430205</td><td>ミニスコープ</td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet</td><td>ASIN の取り付け用 : B001DUUPQ0</td><td>マウスの毛を取り除くため</td></tr><tr><td>デスクトップ デジタル定位固定装置 strument, SGL M</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>68803</td><td>ウイルス注射およびGRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N/A</td><td>マウスの術後炎症予防</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>RWDライフサイエンス株式会社</td><td>MZ62-WX</td><td>手術中の状態観察用</td></tr><tr><td>ガスフィルターキャニスター 大型</td><td>6 RWDライフサイエンス株式会社</td><td>R510-31-6</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>GRINレンズ</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>GRINレンズ埋め込み用 GRIN</td></tr><tr><td>レンズ</td><td>InFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>GRINレンズ移植用</td></tr><tr><td>誘導室マウス(15 cm x 10 cm x 10 cm)</td><td>RWD Life Science Co.,Ltd</td><td>V100</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>産業用カメラ</td><td>Daheng Imaging</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>行動データ取得用</td></tr><tr><td>Iodophor 消毒剤</td><td>青島海ヌオイノビ消毒技術有限公司</td><td>8861F6DFC92A</td><td>消毒用</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>RWD ライフサイエンス株式会社</td><td>R510-22-10</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>液体サンプル採取管 (ガラス毛細血管 ナノジェクトIII用マイクロピペット)</td><td>ドラモンドサイエンティフィックカンパニー</td><td>3-000-203-G/X</td><td>ウイルス注射用</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>データ解析用</td></tr><tr><td>マイクロドリル</td><td>RWD ライフサイエンス株式会社</td><td>78001</td><td>開頭術用</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>液体サンプル採取チューブの引っ張り用</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>ウイルス注射用</td></tr><tr><td>Miniscope DAQソフトウェア</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>カルシウムイメージングデータの記録用</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition(DAQ)ボックス (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>カルシウムイメージングデータを取得するには</td></tr><tr><td>ミニスコープV4</td><td>オープンエフィス</td><td>V4</td><td>in vivoカルシウムイメージング用</td></tr><tr><td>ミニスコープV4ベースプレート(バリアント2)</td><td>オープンエフィス</td><td>バリアント2</td><td>ミニスコープ</td></tr><tr><td>ナノジェクトIIIプログラマブルナノリットルインジェクター</td>を保持するため <td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>カンパニー3-000-207</td><td>ウイルス注射</td></tr><tr><td>用眼科軟膏</td><td>Cisen Pharmaceutical Co.,株式 会社。</td><td>H37022025</td><td>目を潤すために</td></tr><tr><td>PCRチューブ</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>ウイルスを希釈するために</td></tr><tr><td>パソコン(ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>カルシウムの画像データと行動データを記録するために</td></tr><tr><td>ランニングホイール</td><td>上海江代ペットプロダクツ株式会社</td><td>NA-H115</td><td>ベースプレート固定時にマウスを保持するため</td></tr><tr><td>ドライバー(M1.6ネジ)</td><td>緑(煙台緑具株式会社)</td><td>60902</td><td>M1.6ネジを緩めるには</td></tr><tr><td>ドライバー(止めネジ)</td><td>緑(煙台緑具株式会社)</td><td>S2</td><td>止めネジを緩めるため</td></tr><tr><td>止めネジ</td><td>TBD</td><td>2-56コーンポイント止めネジ</td><td>ミニスコープをベースプレートに固定するため</td></tr><tr><td>小動物麻酔器</td><td>RWDライフサイエンス株式会社</td><td>R500</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>滅菌注射器</td><td>江蘇省万里の長城医療機器Co.、株式会社</td><td>20163140236</td><td>血液をすすぐため</td></tr><tr><td>外科用はさみ</td><td>RWDの生命科学Co.、株式会社</td><td>S14016-13</td><td>髪の毛および頭皮を切るため</td></tr><tr><td>ThermoStarの温度調節器、69025パッド含んでいる。</td><td>RWDライフサイエンス株式会社</td><td>69027</td><td>動物の体温を維持するために</td></tr><tr><td>超微細鉗子</td><td>RWDライフサイエンス株式会社</td><td>F11020-11</td><td>骨の破片と硬膜</td></tr><tr><td>のUSB3.0ケーブル</td>の取り外し用 <td>オープンエフィス</td><td>N/A</td><td>ミニスコープのDAQボックスとコンピューターの接続には</td></tr><tr><td>紫外線</td><td>ジンシダ</td><td>66105854002</td><td>GRINレンズを頭蓋骨</td></tr><tr><td>に固定するにはUVレジン(光硬化型接着剤)</td><td>ロックタイト</td><td>32268</td><td>GRINレンズを頭蓋骨に固定するため</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>血液、生理食塩水、脳組織を除去するため</td></tr></tbody></table>

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

学習と記憶の研究には通常、リアルタイムのアプローチが必要であり、 in vivo カルシウムイメージングは、行動課題中の覚醒動物のニューロン活動を調査する可能性を提供します。海馬はエピソード記憶や空間記憶と密接に関連しているため、この分野の研究において重要な脳領域となっています。近年の研究では、海馬CA1領域の神経活動を小型顕微鏡を用いて記録し、マウスを用いてオープンフィールドやリニアトラックなどの行動課題を行いながら、エングラム細胞や場所細胞を研究しています。歯状回は海馬のもう一つの重要な領域ですが、その深さが深く、イメージングが難しいため、 in vivo イメージングで研究されることはほとんどありませんでした。このプロトコルでは、ウイルスの注入方法、GRIN(Gradient-index)レンズの埋め込み方法、海馬の歯状回をイメージングするためのベースプレートの取り付け方法など、カルシウムイメージングプロセスを詳細に提示します。さらに、MATLAB を使用してカルシウムイメージング データを前処理する方法についても説明します。さらに、イメージングが必要な他の脳深部領域の研究も、この方法の恩恵を受ける可能性があります。

図1 は、ウイルス注入、GRINレンズ埋め込み、ベースプレート固定、ミニスコープによる in vivo カルシウムイメージング、データ処理などの実験手順の概略図を示しています。通常、全体の手続きには1か月かかります。 図2 は、頭蓋骨に開けられた穴の位置やGRINレンズ移植前の脳組織の状態など、ウイルス注入の手順の例を示しています。
図3 は、この手術の成功に不可欠な脳組織を切除するプロセスを示しています。より多くの組織を吸引すると、さまざまな組織層が見えてきます。この吸引ステップは、灰色の反射層が観察されると停止できます。
図4 は、GRINレンズの挿入、頭蓋骨へのヘッドプレートの接着、GRINレンズをカスタマイズされたキャップで覆うなど、GRINインプラントの手順を示しています。 in vivo カルシウムイメージングのイメージング品質は、ウイルス注入とGRINレンズ移植の成功に依存します。
図5に、in vivoカルシウムイメージングによる4種類の結果を示します。 図 5A は失敗した結果です。イメージング視野に活性細胞は観察されませんでした。図5B-Dは成功した結果です。図5Bには10個未満の活性細胞がありますが、明らかな血管はありません。Figure 5Cには、50を超える活性細胞と目に見える血管があります。図5Dでは、イメージング視野に数百の活性細胞があります。同時に、血管がすっきりと観察されました。高品質のin vivoカルシウムイメージングには、通常、数百個の活性化細胞が含まれています。イメージング結果に最適ではないと考えられている活性化細胞は12個未満です。通常、細胞の数はGRINレンズの直径や脳の領域の一部と相関しています。GRINレンズの直径が大きく、脳領域が背側に近いほど、より活発な細胞を観察する確率が高くなります。また、GRINレンズの直径が大きいほど、マウスの脳に与えるダメージが大きくなることに注意することも重要です。したがって、適切なサイズを選択することが重要です。直径1mmのGRINレンズを埋め込んでも、動物の直線的なトラック行動を獲得する能力には影響しません(補足図S1)。
行動データとカルシウムイメージングデータは通常、別々に処理されます。マウスの行動データは、手動でラベル付けすることも、オープンソースの分析ソフトウェアを使用して処理することもできます。カルシウムイメージングデータは、MATLAB の Non-Rigid Motion Correction (NoRMCorre) と EXTRACT を使用して処理されます。 図6 は、抽出された個々の細胞を視野に重ね合わせ、 成功したin vivo カルシウムイメージング記録からの5つの代表的なカルシウム痕跡を示しています。生データの代表的なビデオについては、 補足ビデオ S1 を参照してください。
GRINレンズの埋め込みとウイルス注入が目的の脳領域で行われることを確認することは最後のステップであり、データの解釈にとっても非常に重要です。 図7 は、GCaMP6fの発現位置(緑色蛍光領域)とGRINレンズの軌跡を示すマウスの脳スライスです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> 図1:ウイルス注入とGRINレンズ移植の手順の図(A)AAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスを歯状回に注入します。(B)歯状回の上にGRINレンズを埋め込みます。(C)手術後の画像品質を確認してください。(D)確認後、ミニスコープベースプレートを固定します。(E) プロトコル全体のタイムラインとプロセス。略語:GRIN =グラデーションインデックス。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> 図2:ウイルス注入中の代表的な手術図(A)マウスを定位固定装置の上に置きます。(B)GRINレンズの埋め込み領域(黒い領域)をマークします。(C)対象領域の開頭術。(D)歯状回に240nLのウイルスを注入します。(E)注射後、マイクロピペットを取り外してください。(F)皮質とCA1脳組織の一部を切除します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> 図3:脳組織吸引中の代表的な手術図(A)黒色のマーカーで囲まれた領域をマイクロドリルで研磨し、(B)部分的に露出した皮質組織を残します。左側は露出した皮質を示し、右側は硬膜と頭蓋骨組織で覆われています。(C)皮質脳組織の吸引中の代表的な画像。組織は淡いピンク色のままです。(D)白質は、白い矢印で示されているように、視野内に見えます。(E)さらに吸引すると、白質の下に暗い灰赤色の反射面が明らかになりました。領域(黒い矢印)はCA1表面と考えられており、吸引が深く入らないようにする必要があります。(F)生理食塩水で数回すすいだ後、その領域からの出血は見られません。すべてのパネルで、アスタリスクは手術器具を示しています:生理食塩水用の30Gの鈍い針と脳組織の吸引用の25Gの鈍針。スケールバー = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> 図4:GRINレンズの埋め込みとベースプレートの取り付け手順の例(A)GRINレンズホルダーを使用して、GRINレンズを脳組織に埋め込みます。(B)GRINレンズをUV樹脂で適切な位置に接着します。反射部はUVレジンを表しています。(C)マウスの頭蓋骨にヘッドプレートをUVレジンで取り付けます。(D)GRINレンズを3Dプリントされた保護キャップで覆います。(E)手術の質を確認してください。ミニスコープはホルダーで固定されていました。(F)ベースプレートの周りに義歯の基材を塗布します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> 図5:イメージングの成功結果と失敗結果 (A) in vivo カルシウムイメージングの失敗結果。 A には活性細胞は存在せず、黒矢印で示すように複数の領域に黒色の血痕があります。(B-D) in vivo カルシウムイメージングの成功結果。(B)イメージングフィールドには10個未満の活性細胞が観察されますが、大きな血管はありません。(C)50種類以上の活性細胞と有意な血管が観察できる。(D)数百の活性細胞とより重要な血管が観察できる。破線の円はイメージングの視野を表しています。緑色の矢印はGCaMP6fを発現する細胞を表しています。赤い矢印は血管を表しています。スケールバー = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> 図6:リニアトラック上を走っているマウスからの代表的な in vivo カルシウムイメージングデータ。 (A)ミニスコープによる視野記録の撮像視野は、総細胞数=227。(B)代表的なカルシウム微量。セルの位置は 、A で同じ色で表示されます。(C)行動課題:両端に水の報酬がある線形トラック。(D)マウスの活動の行動分析の代表的な結果。合計時間 = 100 秒。青い縦線は、舐め動作の時点を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> 図7:手術後のマウスの脳組織切片 (A,B) マウスの脳組織の2つの例。破線の長方形の領域は、GRINレンズの埋め込み経路を示しています。曲線は海馬の歯状回を表しています。スケールバー = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>問題</td>
			<td>考えられる原因</td>
			<td>解決</td>
		</tr><tr><td>イメージングフィールドが暗くまたは黒く見えます。</td>
			<td>GRINレンズの下側にはかなりの量の残留血液があります。</td>
			<td>GRINレンズを埋め込む前に、生理食塩水を使用して、観察可能な出血がなくなるまで手術部位の表面を連続的に洗い流します。</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">イメージングフィールドにははっきりと見える血管が存在しますが、識別可能なニューロンの活動はありません。</td>
			<td>1. ウイルスの発現が最適でないか、不良であった。</td>
			<td>1. 以下を確認することをお勧めします。</td>
		</tr><tr><td>2.観察されたウイルス発現の位置が、GRINレンズが埋め込まれた位置と一致しません(一般的に、GRINレンズの埋め込み位置は、所望の位置に比べて浅すぎます)。</td>
			<td>ある。ウイルスの保管条件が適切であることを確認してください。</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b.ウイルスの注入位置が正しいことを確認します。</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>c. ウイルス濃度が適切であることを確認します。</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2.次の外科的処置では、GRINレンズ移植の深さを適切に増やすことができ、実験が行われるたびに正確な深さを注意深く記録する必要があります。</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">イメージングフィールドでは、ニューロン活動のいくつかの局所パターンが示されていますが、個々の細胞レベルでは明確に見える活動はありません。</td>
			<td>1.注入されたウイルスの量が多すぎた。</td>
			<td>1.ウイルスを希釈するか、ウイルス注射の量を減らします。</td>
		</tr><tr><td>2. ウイルス発現の位置がGRINレンズの位置と一致していない(通常、GRINレンズはウイルス発現に最適な位置よりも浅い深さに埋め込まれる)。</td>
			<td>2.次の外科的処置では、GRINレンズ移植の深さを適切に増やすことができ、実験が行われるたびに正確な深さを注意深く記録する必要があります。</td>
		</tr><tr><td>イメージングフィールド内には、常に常に明るい蛍光シグナルを維持している特定の細胞があり、この蛍光の強度に変化はありません。</td>
			<td>ウイルスは単一の細胞内で過剰発現しています。</td>
			<td>ウイルスを希釈するか、ウイルス注射の量を減らします。</td>
		</tr></tbody></table>表 1: トラブルシューティング チャート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:手術を受けたマウスによる空間記憶課題の正常な獲得。 グラフは、毎日 20 分間のセッションで完了した試行の数を定量化したものです。データは平均±SEMで表されます。N = 手術あり群で3匹、手術なし群で4匹。統計的比較には二元配置ANOVAを使用しました。略語: ns = 重要ではありません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足動画S1:DGにおけるカルシウムイメージングの代表的な生データ。 このビデオでは、5分間にわたるカルシウムの活性を示しています。ビデオは元の速度の 10 倍速で再生されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:ヘッドプレートのデザイン。 このファイルは、ヘッドプレートデザインの2D図面の概要を示しています。ヘッドプレートの製造には、図面に従ってステンレス鋼を切断することが含まれます。サイドバーの2つの小さな穴は、M1.6スレッドでタップする必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:3Dプリントされた保護キャップのデザイン。 このファイルは、3Dプリンターで使用できる保護キャップスライスのgcodeを提供します。このプロトコルでは、印刷の原料としてポリ乳酸プラスチックを使用しました。側面の小さな穴は、取り付け用のヘッドプレートのタップ穴の位置と一致しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:ミニスコープホルダーのデザイン。 このファイルは、3Dプリンターで使用できるミニスコープホルダースライスのgcodeを提供します。円筒形の穴は、M4ネジで脳定位固定装置ホルダーに取り付けるために使用されます。側面の穴は締め付け用のネジを追加するためのものですが、ホルダーはこの機能がなくても使用できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル4:生のカルシウムイメージングビデオの前処理のためのArduino制御コードとスクリプト。 このファイルには、Arduinoを制御するためのスクリプトと、カルシウムイメージングデータの前処理のためのコードが含まれています。Arduinoコードは、マウスが線形トラックの交互の端で水の報酬を得るために舐めることを学習する動作設定を制御します。課題を学習すると、マウスはトラック上を繰り返し往復します。カルシウムイメージング前処理コードは、ミニスコープによって収集されたデータから、ファイル形式変換、モーション補正、空間ダウンサンプル、および細胞信号抽出を実行します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo カルシウムイメージングのための一連の堅牢で効率的な手順を説明しています。

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

新皮質のマイクロ回路のネットワークのダイナミクスを理解するために、それは同時に、神経細胞の多数のアクティビティを記録することが不可欠です。のin...

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

出典:Shannonhouse, J., et al.In vivo 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロン集団のカルシウムイメージング。J. Vis. Exp. （2023年).このビデオは、トランスジェニックマウスの後根神経節(DRG)のニューロン活動を監視するためのin...

マウスの無傷の背根神経節におけるニューロン群のin vivoカルシウムイメージング

出典:カルボ・ロドリゲス、他.老化した海馬ニューロンにおける細胞内Ca2+の蛍光および生物発光イメージング。 J. Vis. Exp. (2015).

短期および長期ラット海馬培養におけるin vitroカルシウムイメージング

出典:Lee, H. et.al., ヘッドマウント小型顕微鏡による、自由に行動するマウスの扁桃体における生体内カルシウムイメージングに成功しました。J. Vis. Exp. (2020)このビデオは、勾配屈折率またはGRINレンズと小型顕微鏡を使用したマウスのin...

自由に動くマウスにおけるリアルタイム微小内視鏡的カルシウムイメージング

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マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

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インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

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インビボ体細胞および内臓刺激に対する背根神経節ニューロンの応答のカルシウムイメージング

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生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

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インビボ 無傷の三叉神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

学ぶマウス海馬歯状回の顆粒細胞におけるin vivoカルシウムイメージング手法。ウイルス注入とGRINレンズ埋め込みを単一手術で統合し、神経活動と認知機能の神経コードを高精度に解析する革新的なプロトコルです。

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング

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