Name: In vitroでの間葉系幹細胞と網膜色素上皮との間のトンネルナノチューブを介したミトコンドリア転写 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学ぶトンネルナノチューブを介した間葉系幹細胞と網膜色素上皮細胞間の双方向ミトコンドリア転写のin vitro手法。細胞生存と網膜損傷治療への応用可能性を明らかにする。

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<meta charset="utf8"></head><body>MSCおよびARPE19共培養におけるミトコンドリア移動の調査

<ol><li>Caprara, C., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+oxygen+to+erythropoietin%3A+Relevance+of+hypoxia+for+retinal+development%2C+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).</li>
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<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>NEST</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>ARPE19 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace violet</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>カバースライド</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>VivaCell</td><td>C04002-500</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 試薬</td><td>ミリポア</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>MSCs</td><td>Nuwacell</td><td>RC02003</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>ncMission</td><td>RP02010</td><td></td>ペン<td>で示されている</td></tr><tr><td>連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pCT-Mito-GFP</td><td>SBI</td><td>CYTO102-PA-1</td><td>プラスミド;から&nbsp;https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>MCE</td><td>HY-B1743A</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン</td><td>インビトロゲン</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>ソーラーバイオ</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3470</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitroでの間葉系幹細胞と網膜色素上皮との間のトンネルナノチューブを介したミトコンドリア転写

Mitochondrial Transfer Via Tunneling Nanotubes Between Mesenchymal Stem Cells and Retinal Pigment Epithelium In Vitro

間葉系幹細胞(MSC)とARPE19細胞の直接共培養を示す概略図を 図1に示します。mito-GFPを発現するように改変されたMSCをドナー細胞として、紫色標識細胞質膜をレシピエント細胞としてARPE19-mito-RFP細胞を共培養しました。24時間の共培養期間の後、細胞をファロイジンについて染色し、共焦点顕微鏡を用いて調べた。得られた細胞集団には、MSC-mito-GFP細胞、ARPE19-mito-RFP細胞、arpe19-mito-RFP細胞、およびmito-RFPを含むMSC-mito-GFP細胞が含まれていました。特に、ARPE19細胞におけるmito-GFPの存在およびMSCにおけるmito-RFPの存在は、ミトコンドリアの双方向移動を示唆した。
TNT形成の具体的な詳細を図2に示します。これらの構造は、同じタイプの細胞間(図2A-C)だけでなく、異なるタイプの細胞間(図2D)も細胞間接続を確立できます。トンネルナノチューブ(TNT)は、隣接する細胞をつなぐ導管として機能し、細胞質の連続性とミトコンドリアの輸送を促進する開放端を持つ独特のF-アクチンリッチ膜構造を示します。Z軸イメージングを利用すると、TNTは細胞外マトリックスにしっかりと固定されているのではなく、培養液内に浮遊していることが明らかになり、従来の細胞突起と区別されます。ミトコンドリアの移動は図3で明らかであり、バイオレット陽性のARPE19細胞は、MSCに由来するミトコンドリアを示す分散した緑色の点線の蛍光を示します(図3A)。赤色の点線蛍光を含む紫色の陰性MSCは、ARPE19細胞からのミトコンドリア移動を表しています(図3B)。図4は、超解像イメージングによるTNT形成とミトコンドリア移動を示しており、TNTを介したミトコンドリア移動の詳細を見ることができます。ビデオ1は、TNTを介したミトコンドリア輸送のダイナミクスを示しています。
ミトコンドリアの移行の前提条件は、ミトコンドリアの分泌と取り込みではなく、TNTなどの物理的接触であることをさらに実証するために、以前に報告された共培養法を使用しました10。 図5Aに示すように、MSCおよびARPE19細胞は、それぞれトランズウェルプレートの上部および下部のチャンバーに播種した。それらは0.4μmの細孔を有するフィルターによって分離され、MSCとARPE19細胞との間の直接接触を遮断し、ミトコンドリアの通過を可能にした。共培養の24時間後、下部チャンバーのARPE19細胞をアッセイし、上部チャンバーのMSCからmito-GFPはほとんど観察されませんでした(図5B)。これらの結果は、ミトコンドリアの移動にはMSCとARPE19細胞との直接的な接触が必要であることを示唆しています。
最終的に、TNT形成とミトコンドリア移動の定量化が行われ、対応する結果を 図6に示します。MSCは、ARPE19細胞よりもミトコンドリアを提供する能力が有意に高かった(p = 0.0286)。これらの知見は、MSCがミトコンドリアを網膜色素上皮細胞に転移する能力を持っていることを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig01.jpg"> 図1:MSCとARPE19細胞の共培養の概略図。CellTrace Violetで標識したmito-GFP細胞およびARPE19-mito-RFP細胞を発現するMSCを、1:1の比率で24時間共培養します。mito-GFP in violet+ cellsは、MSCsからARPE19細胞へのミトコンドリアの移動を示し、mito-RFP in violet-cellsは、ARPE19細胞からMSCsへのミトコンドリアの移動を示します。略語:GFP = 緑色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;MSCs = 間葉系幹細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig02.jpg"> 図2:MSCとARPE19細胞間のTNT形成。 白い矢印はTNT形成、緑の矢印はmito-GFPを持つミトコンドリア、赤い矢印はmito-RFPを持つミトコンドリアを示します。(A,B)ARPE19細胞間のTNT形成。(C)MSC間のTNT形成 (D)MSCとARPE19細胞間のTNT形成。培地に懸濁したTNTを示すZ軸イメージング。スケールバー = 25 μm。略語:MSCs =間葉系幹細胞;TNT=トンネルナノチューブ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig03.jpg"> 図3:MSCからARPE19細胞へのミトコンドリア転写 (A)白色の破線はMSCからARPE19細胞へのミトコンドリア(mito-GFP)転写、(B)黄色の破線はARPE19細胞からMSCへのミトコンドリア(mito-RFP)転写を示す スケールバー=20μm。略語:GFP =緑色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;MSCs = 間葉系幹細胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig04.jpg"> 図4:超解像顕微鏡によるMSCとARPE19細胞間のTNT形成とミトコンドリア移動 (AおよびB)MSCからARPE19細胞へのミトコンドリア輸送。(C)超解像イメージング下のTNTの詳細。(D)超解像イメージング下のARPE19細胞に存在するMSC由来の緑色ミトコンドリア。スケールバー = 5 μm。略語:MSCs =間葉系幹細胞;TNT=トンネルナノチューブ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig05.jpg"> 図5:MSCsおよびARPE19細胞のトランスウェル系における間接共培養におけるほとんど検出不能なミトコンドリア転移 (A)トランズウェル系におけるMSCsおよびARPE19細胞の共培養の模式図。(B)トランスウェルプレートの底部におけるMSCと24時間間接共培養後のARPE19細胞の代表 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig05large.jpg" target="_blank">画像。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig06.jpg"> 図6:TNT形成とミトコンドリア移動の定量化。 (A)TNT形成、(B)ミトコンドリア移動。略語:M = MSCs =間葉系幹細胞;A = ARPE19細胞;TNTs = トンネルナノチューブ;M-A = MSCとARPE19細胞間のTNT形成;M-M = MSC間のTNT形成;A-A = ARPE19細胞間のTNT形成。n = 4、平均±SD、マンホイット ニーU検定、* p &lt; 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:プラスミドpCT-Mito-copGFPのマッピング。 Mito-GFP(CYTO102-PA-1)を購入しました。ミトコンドリアサイトトレーサーであるpCT-Mito-GFP(CMV)は、Cox8タグを介してcopGFPと融合し、ミトコンドリアにcopGFPを標識します。このcopGFP融合はCMVプロモーターによって駆動され、HeLa、HEK293、HT1080などの細胞株での強力な発現を可能にします。Mito-RFPは、GFPをRFPに置き換えることにより、mito-GFPから変更されました。ピューロマイシン耐性遺伝子を持っています。このプラスミドのレンチウイルス包装は、専門企業によって行われます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_Supplementary%20figure.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ1:TNTを介したMSCとARPE19細胞間のミトコンドリア輸送。 TNTは、MSC細胞とARPE19細胞の双方向移動によって生成され、MSC細胞からARPE19細胞へのミトコンドリアの移動を促進します。略語:MSCs =間葉系幹細胞;TNT=トンネルナノチューブ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_TNT_Video.zip" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

In vitroでの間葉系幹細胞と網膜色素上皮との間のトンネルナノチューブを介したミトコンドリア転写

Mitochondrial transfer is a normal physiological phenomenon that occurs widely among various types of cells. In the study to date, the most important ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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