Name: 原子間力顕微鏡を用いた剛性測定のためのマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶマウス網膜毛細血管と内皮下マトリックスの単離法。原子間力顕微鏡を用いた剛性測定で、糖尿病性網膜症における血管炎症と機械的応答の関係を解明し、新たな治療標的を探索する。

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この研究は、National Eye Institute/NIH grant R01EY028242 (K.G.へ)、Research to Prevent Blindness/International Retinal Research Foundation Catalyst Award for Innovative Research Approaches for AMD (K.G.へ)、W.M. Keck Foundation から The Stephen Ryan Initiative for Macular Research (RIMR) Special Grant (Doheny Eye Institute へ)、Ursula Mandel Fellowship and UCLA Graduate Council Diversity Fellowship (I.S.T. へ) の支援を受けました。この研究は、Research to Prevent Blindness, Inc.からUCLAの眼科への無制限の助成金によっても支援されました。この記事の内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

マウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの硬さの測定

<ol><li>Duh, E. J., Sun, J. K., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+current+understanding%2C+mechanisms%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: current understanding, mechanisms, and treatment strategies.</a> JCI Insight. 2 (14), e93751(2017).</li>
<li>Roy, S., Kern, T. S., Song, B., Stuebe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+pathological+changes+in+the+diabetic+retina%3A+Implications+for+targeting+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into pathological changes in the diabetic retina: Implications for targeting diabetic retinopathy.</a> Am J Pathol. 187 (1), 9-19 (2017).</li>
<li>Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+molecular+and+cellular+pathology+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy.</a> Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+retinal+vascular+inflammation+and+degeneration+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of retinal vascular inflammation and degeneration in diabetes.</a> Diabetes. 73 (2), 280-291 (2024).</li>
<li>Chandrakumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+matrix+stiffening+by+lysyl+oxidase+enhances+RAGE-mediated+retinal+endothelial+activation+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Subendothelial matrix stiffening by lysyl oxidase enhances RAGE-mediated retinal endothelial activation in diabetes.</a> Diabetes. 72 (7), 973-985 (2023).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+stiffening+promotes+retinal+endothelial+activation+associated+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Basement membrane stiffening promotes retinal endothelial activation associated with diabetes.</a> FASEB J. 30 (2), 601-611 (2016).</li>
<li>Wolfenson, H., Yang, B., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+Mechanotransduction+pathways+that+control+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steps in Mechanotransduction pathways that control cell morphology.</a> Annu Rev Physiol. 81, 585-605 (2019).</li>
<li>Pan, Z., Ghosh, K., Liu, Y., Clark, R. A., Rafailovich, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stresses+and+translational+distortion+of+the+nucleus+during+fibroblast+migration+on+a+physiologically+relevant+ECM+mimic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Traction stresses and translational distortion of the nucleus during fibroblast migration on a physiologically relevant ECM mimic.</a> Biophys J. 96 (10), 4286-4298 (2009).</li>
<li>Ghosh, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+control+of+cell+and+tissue+development%3A+implications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Micromechanical control of cell and tissue development: implications for tissue engineering.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59 (13), 1306-1318 (2007).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+cell+and+basement+membrane+architecture+contribute+to+sidestream+smoke-induced+choroidal+endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Aberrant cell and basement membrane architecture contribute to sidestream smoke-induced choroidal endothelial dysfunction.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (5), 3140-3147 (2014).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+increases+choroidal+endothelial+stiffness+and+susceptibility+to+complement+injury%3A+Implications+for+choriocapillaris+loss+in+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Senescence increases choroidal endothelial stiffness and susceptibility to complement injury: Implications for choriocapillaris loss in AMD.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (14), 5910-5918 (2016).</li>
<li>Cabrera, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell+stiffness+contributes+to+complement-mediated+injury+of+choroidal+endothelial+cells+in+a+monkey+model+of+early+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Increased cell stiffness contributes to complement-mediated injury of choroidal endothelial cells in a monkey model of early age-related macular degeneration.</a> J Pathol. 257 (3), 314-326 (2022).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Phys%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nat Rev Phys. 1, 41-57 (2019).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> J Vis Exp. (76), e50489(2013).</li>
<li>Beacham, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+extracellular+matrices+produced+by+cultured+and+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. , vol. Chapter 10 (2007): Unit 10.9 (2007).</li>
<li>Bae, Y. H., Liu, S. L., Byfield, F. J., Janmey, P. A., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+stiffness+of+ex+vivo+mouse+aortas+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring the stiffness of ex vivo mouse aortas using atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (116), e54630(2016).</li>
<li>Huynh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+intimal+stiffening+enhances+endothelial+permeability+and+leukocyte+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related intimal stiffening enhances endothelial permeability and leukocyte transmigration.</a> Sci Transl Med. 3 (112), 112(2011).</li>
<li>Sharma, A., Gupta, D. K., Bisen, S., Singh, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+trypsin+and+elastase+digestion+techniques+for+isolation+of+murine+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of trypsin and elastase digestion techniques for isolation of murine retinal vasculature.</a> Microvasc Res. 154, 104682(2024).</li>
<li>Chaqour, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-based+measurements+of+retinal+microvessel+stiffness+in+mice+with+endothelial-specific+deletion+of+CCN1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-based measurements of retinal microvessel stiffness in mice with endothelial-specific deletion of CCN1.</a> Methods Mol Biol. 2582, 323-334 (2023).</li>
<li>Ashraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+density+of+deep%2C+intermediate+and+superficial+vascular+plexuses+are+differentially+affected+by+diabetic+retinopathy+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular density of deep, intermediate and superficial vascular plexuses are differentially affected by diabetic retinopathy severity.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 61 (10), 53(2020).</li>
<li>Monickaraj, F., McGuire, P. G., Nitta, C. F., Ghosh, K., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+D%3A+an+Macrophage-derived+factor+mediating+increased+endothelial+cell+permeability+with+implications+for+alteration+of+the+blood-retinal+barrier+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cathepsin D: an Macrophage-derived factor mediating increased endothelial cell permeability with implications for alteration of the blood-retinal barrier in diabetic retinopathy.</a> FASEB J. 30 (4), 1670-1682 (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

AFMは、大動脈や動脈などの大きな血管の硬直の疾患関連の変化を測定するために広く使用されています16。これらの知見は、アテローム性動脈硬化症などの心血管合併症における内皮メカノバイオロジーの役割を確立するのに役立ちました17。これらの発見に基づいて、私たちは、早期のDRにおける網膜微小血管病変の発症における内皮メカノバイオロジーのこれまで認識されていなかった役割の調査を開始しました。近年の研究では、大きな血管と同様に、網膜毛細血管や網膜EC分泌下皮マトリックスの硬さも、AFM 4,5,6を用いて直接、正確、かつ確実に測定できることが明らかになっています。
このアプローチでは、トリプシン消化を使用して、軽度に固定された眼からマウスの網膜毛細血管を分離します。経験から、固定されていない眼から分離された毛細血管(hypotonic法を使用)は壊れやすく、断片化するため、AFM剛性測定には適さないため、この軽度の固定ステップが必要です4。逆に、より強い固定およびそれに続く広範なトリプシンの消化のための必要性は、他の網膜トリプシン消化のプロトコル18で報告され、また堅い接合部の破壊によって判断されるように毛細血管の構造完全性を損なうかもしれない。したがって、ここで採用されている穏やかな毛細管固定と穏やかなトリプシン消化は、過剰なホルマリン誘発架橋から生じる剛性アーチファクトを減らし、信頼性の高いAFM剛性測定のための毛細血管の構造的完全性を確保するのに役立ちます。
別のアプローチとして、最近の研究では、軽く固定された網膜フラットマウント19からの網膜毛細血管のAFM剛性測定が報告されました。このアプローチでは、無傷の網膜内の網膜毛細血管にAFMフォースインデントを行うことで、 in situ 剛性測定が可能になります。ただし、これらの毛細管剛性の測定には、内部制限膜の剛性が含まれている可能性があります。さらに、このアプローチは、網膜フラットマウントでアクセス可能な表在性毛細血管のみの測定に限定され、初期のDR20で特に影響を受けるより深い毛細血管神経叢は除外されます。これらの問題は、すべての網膜層から血管をきれいに(残存網膜組織がない)抽出するこのアプローチを使用して対処できます。現在、このプロトコルを最適化して、初期のAMDの動物モデルから脈絡膜血管を分離しています。とは言うものの、プロトコルで採用されている軽度のホルマリン固定は、AFM測定で架橋関連の硬化アーティファクトを引き起こす可能性があることを認識しています。したがって、このアプローチを使用して得られた血管剛性の値は、絶対的な剛性ではなく、(異なる実験グループ間の)剛性の相対的な変化の観点から解釈するのが賢明です。
軽度の固定が必要な網膜毛細血管とは対照的に、網膜EC培養物から得られる内皮下マトリックスは、何も変更せずに評価できます。これは主に、培養培地へのアスコルビン酸の添加(コラーゲン合成を促進する15)、脱細胞化中のマトリックスの剥離を防ぐガラスカバースリップの化学修飾、および培養期間の延長(10〜15日)など、いくつかの要因の組み合わせから生じる堆積マトリックスの堅牢性によるものです。重要なことに、in vitroでの高血糖による内皮下マトリックスの硬直の増加は、in vivoで見られる糖尿病による網膜毛細血管の硬直の増加と一致していることを示しました4。マトリックス剛性の増加は、その上にある網膜ECの剛性を増加させると予想され(機械的相反性による)、それが一緒になって、全体的な毛細血管の剛性を増加させることが予想されるため、これは驚くべきことではありません。実際、我々は最近、糖尿病条件下で成長すると網膜ECが硬くなることを示しました4、これはおそらくRho/ROCK依存性のアクチン細胞骨格張力の増加によるものです21。これらの知見は、初期のAMDのアカゲザルモデルに見られる脈絡膜ECの硬化が、脈絡膜内皮下マトリックスと無傷の血管12の硬直の増加を反映していることも示唆しており、この考えは現在進行中の研究で検証されている。全体として、固定されていない網膜内皮下マトリックスとECの硬さの変化が、軽度に固定された無傷の網膜血管に見られる傾向を反映しているという事実は、穏やかな固定アプローチの有効性を証明しています。
DRの動物モデルからの網膜毛細血管の直接剛性測定は、DR管理の新たな治療標的としての内皮メカノバイオロジーの確立に役立つだけでなく、将来、DR患者の網膜毛細血管の硬さを非侵襲的に評価するための新しい高感度イメージング技術を開発するための強力な理論的根拠を提供します。このような非侵襲的な技術は、糖尿病誘発性心血管疾患で一般的に検出される動脈脈波速度の変化と同様に、毛細血管硬化から生じると予想される血流の微妙な変化を検出できる可能性があります。糖尿病ドナーの死後ヒトの目から分離された網膜毛細血管のAFM剛性測定は、この点で重要な概念実証を提供します。網膜毛細血管の硬さが 1 型糖尿病4 の (ストレプトゾトシン) マウスモデルで早期に増加することを考えると、AFM を剛性測定イメージングモダリティの検証に成功裏に使用すると、網膜毛細血管の硬さが早期の DR 病因の臨床バイオマーカーとして特定される可能性があります。

網膜毛細血管は、網膜の恒常性と視覚機能を維持するために不可欠です。実際、初期の糖尿病における彼らの変性は、糖尿病患者の全個人のほぼ40%が罹患している微小血管疾患である糖尿病性網膜症(DR)の視力を脅かす合併症の発症に強く関与しています1。過去の研究では、糖尿病誘発性網膜血管炎症における異常な分子的および生化学的手がかりに重要な役割があることが実証されています2,3。しかし、最近の研究では、網膜毛細血管硬化が網膜血管の炎症と変性の決定要因でありながらこれまで認識されていなかった重要であると特定するDR病因の新しいパラダイムが導入されました4,5,6。
具体的には、糖尿病による網膜毛細血管硬化の増加は、網膜内皮細胞(EC)におけるコラーゲン架橋酵素リシルオキシダーゼ(LOX)のアップレギュレーションによって引き起こされ、それが内皮下マトリックス(基底膜)を硬化させます4,5,6。マトリックスの硬化は、次に、その上にある網膜ECを硬化させ(機械的相互性による)、したがって、網膜毛細血管の剛性4の全体的な増加をもたらす。重要なことは、この糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化だけで、網膜ECの活性化と炎症媒介性EC死を促進することができるということです。この網膜EC欠損の機械的調節は、内皮メカノトランスダクションの変化、すなわち機械的な手がかりが生化学的シグナルに変換されて生物学的応答を生じさせるプロセスに起因する可能性がある7,8,9。重要なことに、ECの機械的手がかりの変化と内皮下マトリックス構造の変化は、早期の加齢性黄斑変性症(AMD)に関連する脈絡膜血管変性にも関与しており10,11,12、これは、変性網膜疾患における血管メカノバイオロジーのより広範な意味を証明しています。
特に、網膜毛細血管硬化は糖尿病の早期に起こり、これは網膜炎症の発症と一致します。したがって、網膜毛細血管の硬直の増加は、DRの治療標的および早期診断マーカーの両方として機能する可能性があります。この目的のためには、網膜毛細血管と内皮下マトリックスの信頼性の高い直接的な剛性測定を得ることが重要です。これは、細胞、細胞外マトリックス、および組織の剛性を直接測定するための、ユニークで高感度、正確、かつ信頼性の高い技術を提供する原子間力顕微鏡(AFM)を使用することによって達成することができる13。AFMは、サンプルに微小(ナノニュートンレベル)のインデンテーション力を加え、その剛性によってインデントAFMカンチレバーの曲がり具合が決まります。サンプルが硬いほど、カンチレバーは曲がり、その逆も同様です。私たちは、培養内皮細胞、内皮下マトリックス、および単離されたマウス網膜毛細血管4,5,6,11,12の剛性を測定するために、AFMを広く使用してきました。これらのAFM剛性測定は、DRおよびAMDの病因の主要な決定要因として内皮メカノバイオロジーを特定するのに役立ちました。視覚研究におけるメカノバイオロジーの範囲を広げるために、ここでは、単離されたマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの剛性測定にAFMを使用するためのステップバイステップのガイドを提供します。

<table><tbody><tr><td>網膜毛細血管分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m PVDF シリンジフィルター</td><td>メルク ミリポア</td><td>SLGVM33RS</td><td>低タンパク質結合 デュラポア</td></tr><tr><td>10X ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 カルシウム % マグネシウム</td><td>コーニング</td><td>20-031-CV</td><td>最終濃度 1X、pH 7.4</td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>ファルコン コーニング</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430791</td><td>Rnase-Dnase-free, Nonpyrogenic</td></tr><tr><td>20 mLLuer-Lok TIPシリンジ</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4インチ使い捨てホウケイ酸ガラス/非滅菌パスツールピペット</td>フィ<td>ッシャーブランド</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm組織培養ディ</td><td>ッシュファルコンコーニング</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>ファルコンコーニング</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>アクアホールド2パップ-13mLペン</td><td>科学機器研究所</td><td>9804-02</td><td></td></tr><tr><td>ブレードホルダー</td><td>X-ACTO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>炭素鋼外科用ブレード #10</td><td>バードパーカー</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>歯科用ワックス</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Am-scope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%</td><td>ミリポア シグマ</td><td>HT501128-4L</td><td>最終濃度 5% (v/v)</td></tr><tr><td>Kimwipes - ワイパーティッシュ</td><td>Kimtech Science</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Lab Genius</td><td>SK-O180</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Economy #7 Stainless Steel 115mm&nbsp;ピンセット</td><td>テッド・ペラ</td><td>5667</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td>ニコン TS2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>清浄機 Logic+ クラス II, タイプ A2 バイオセーフティキャビネット</td><td>Labconco</td><td>302380001</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 微量遠心チューブ 2 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>AmScope</td><td>SM-3 シリーズ ズーム 三眼実体顕微鏡 3.5X-90X</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus顕微鏡スライド - ホワイトタブ - 洗浄済み - 25x75x1.0 mm</td><td>FisherBrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>トリスバッファー、0.1M溶液、pH 7.4 - バイオテクノロジーグレード</td><td>VWR</td><td>E553-500ML</td><td>pH 8 トリプシン溶液</td></tr><tr><td>トリプシン1:250粉末 組織培養グレード</td><td>VWR</td><td>VWRV0458-25G</td><td>10% (w/v) トリプシン溶液</td></tr><tr><td>水分子生物学グレード</td><td>コーニング</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Subendothelial Matrix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>コーニング</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS カルシウムとマグネシウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14040-117</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン IV抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-26549</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398136</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6140</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Invitrogen-Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ(12mm)</td><td>Fisher</td><td>12-541-000</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>ヒト網膜内皮細胞(HREC)</td><td>Cell Systems Corp</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>MCDB131培地</td><td>コーニング</td><td>15-100-CV</td><td></td></tr><tr><td>マウス網膜内皮細胞(mREC)</td><td>Cell Biologics</td><td>C57-6065</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>&nbsp;BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco-Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>AFM測定</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 & micro;m プローブ</td><td>Bruker</td><td>SAA-SPH-1UM</td><td>A 高さ 19 ミクロンの半球状プローブ、端径 1 ミクロン、スプリング定数 0.25N/m</td></tr><tr><td>70 nm LC プローブ</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-V2</td><td>高さ 19 ミクロンの半球形プローブ、端径 70nm、 &nbsp;ばね定数 0.1N/m</td></tr><tr><td>&nbsp;カメラ</td><td>XCAMファミリー</td><td>Toupcam</td><td>1080P HDMI</td></tr><tr><td>デスクトップ カメラを実行する</td><td>Asus</td><td>Asusデスクトップ</td><td>Intel i5-6600 CPU、8GB RAM</td></tr><tr><td>カバースリップ用ディッシュホルダー</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td>29mmガラスボトムディッシュ with &nbsp;14mmマイクロウェル</td></tr><tr><td>Nanowizard 4</td><td>ブルカー</td><td>Nanowizard 4</td><td>バイオサイエンス原子間力顕微鏡を光学顕微鏡に搭載し、軟質生体試料の機構構造特性(剛性とトポグラフィー)を高感度に測定</td></tr><tr><td>位相差マイクロスコープ</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td>10倍対物レンズ付き倒立顕微鏡</td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡を用いた剛性測定のためのマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

網膜毛細血管変性症は、糖尿病性網膜症 (DR) の初期段階の臨床的特徴です。私たちの最近の研究では、糖尿病誘発性網膜毛細血管硬化が、炎症媒介性網膜毛細血管の変性において、これまで認識されていなかった重要な因果関係を果たしていることが明らかになりました。網膜毛細血管の硬直の増加は、内皮下マトリックスを架橋して硬化させる酵素であるリシルオキシダーゼの過剰発現に起因します。DRを早期に解決することで、DRの進行やそれに伴う視力低下の予防や遅延が期待されるため、内皮下マトリックスや毛細血管の硬直は、早期のDR管理に適切で新しい治療標的となります。さらに、網膜毛細血管の硬さを直接測定することは、動物およびヒトの被験者における網膜毛細血管の硬直を非侵襲的に評価するための新しいイメージング技術を開発するための重要な前臨床検証ステップとして役立ちます。この見解を念頭に置いて、ここでは、原子間力顕微鏡を使用したマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離および剛性測定のための詳細なプロトコルを提供します。

マウス網膜毛細血管 孤立した網膜毛細血管のAFM剛性測定には、その機構的完全性を損なう可能性のあるサンプルの取り扱い手順が含まれます。これを防ぎ、AFM測定の実現可能性、信頼性、再現性を確保するために、除核眼を5%ホルマリンに4°Cで一晩固定してから、血管を分離します。ホルマリン濃度の低下、固定温度の低下、固定時間の制限、角膜穿刺の欠如を伴うこの穏やかな固定プロトコルは、化学的固定によって引き起こされる潜在的な架橋/硬化アーティファクトを最小限に抑えるために開発されました。図2B、Cに示すように、この比較的穏やかな固定により、孤立した網膜血管系が構造的に堅牢で、AFM測定に十分な耐久性を持つことができます。対照的に、固定されていない眼から分離された網膜血管(低張法を使用)4または短時間固定された眼(8時間)は断片化または崩壊するため、AFM測定には適しなくなります(図2B)。
網膜内皮下マトリックス 血管の硬さは、血管細胞と基底膜(内皮下マトリックス)の複合的な硬さを反映しています4。細胞は、自身の剛性に同様の変化を経験することによってマトリックス剛性に適応するため、機械的互恵性9、内皮下マトリックス剛性と呼ばれるプロセスが、全体的な血管剛性の重要な決定要因となる。マトリックス剛性の測定では、均一に密度の高い内皮下マトリックスを得ることが重要です。アスコルビン酸添加培地で増殖したヒト網膜ECの場合、これには通常10〜15日かかります(図3A)4,5,6。この培養期間の違いは、市販の初代レチナールECのロット間の違いから生じる可能性があります。さらに、一般に、C57BL/6マウスの市販の網膜ECは、初代ヒト網膜EC培養物と比較して、より密度の高いマトリックスを沈着させることがわかり、種特異的な違いが示されています。図3Aに示すように、位相コントラスト画像は、マクロスケールでのマトリックスの全体的なビューのみを提供します。しかし、より微細なナノスケールからマイクロスケールの線維性構造は、マトリックス構造タンパク質であるコラーゲンIVおよびフィブロネクチンに対する抗体で免疫標識されたマトリックスの高解像度共焦点蛍光画像で明らかになります(図3B)。これらのマトリックスタンパク質は、特定のインテグリン受容体9に結合することにより、内皮細胞に有益な手がかりを提供することにも注意すべきである。
AFM剛性測定 適切なカンチレバー剛性(スプリング定数、k)とプローブ寸法の選択は、信頼性と感度の高い測定に不可欠です。これらのパラメータは、生体サンプルの剛性と寸法に一致するように選択する必要があります。選択したカンチレバーをAFMに取り付けた後、赤外線レーザービームをカンチレバーの先端に集束し、反射レーザースポットを光検出器の中心に集束する必要があります。このレーザーアライメントにより、カンチレバーのたわみを正確かつ高感度に検出し、その結果、剛性測定を実現します。AFM剛性測定は、Zピエゾがカンチレバーをサンプルに向かって垂直に下降させることから始まります。このとき、カンチレバーのたわみはなく、アプローチ曲線の基線が平坦になります (図4A)。カンチレバープローブがサンプルに接触してインデントすると、カンチレバーが曲がり、光検出器にレーザーたわみが生じ、これはアプローチ曲線の垂直方向のたわみによって表されます。サンプルにあらかじめ設定された押し込み力(セットポイント力)を適用した後、カンチレバーはサンプルから離れた開始位置(Z目標高さ)まで後退します。次に、偏向した収縮曲線をヘルツ/スネドンモデルに当てはめて、サンプルのヤング率(剛性)を計算します。
図4に示す代表的なフォースインデント測定から、糖尿病マウスから単離された網膜毛細血管から得られたアプローチ曲線と収縮曲線(図4B)は、非糖尿病マウスから得られた曲線(図4A)よりも大幅に急勾配であることが明らかです。フォースインデント曲線の傾斜が急であることは、フォースインデントに対するサンプル抵抗が高いためにカンチレバーのたわみが大きいことを示しており、これはサンプル剛性が高いことを反映しています13。実際、その後の複数の力のインデンテーション曲線のデータ解析により、マウスの網膜毛細血管は糖尿病で著しく硬くなることが明らかになりました4。また、カンチレバープローブと生体サンプルとの接触は、しばしば非特異的な表面接着を引き起こし、ベースラインを超えて収縮曲線が伸びることからわかるように、収縮中のカンチレバーの変形が負になることにも注意する必要があります(図4B)。さらに、細胞、マトリックス、血管などの生体サンプルは本質的に粘弾性があるため、フォースインデント後に恒久的な変形や見かけの剛性の変化を受ける可能性があります。その場合、これはアプローチ曲線とリトラクト曲線のミスアライメント(ヒステリシス)に反映されます。実際、図4Aと図4Bを比較すると、非糖尿病マウスの柔らかい毛細血管の力のくぼみが、硬いマウスで見られるヒステリシスよりも大きなヒステリシスを引き起こすという予想される傾向が確認されます。以前に報告した5,6ように、網膜EC培養から得られた内皮下マトリックスの剛性(ヤング率)も前述の方法で計算されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig01.jpg"> 図1:網膜分離のためにマウスの眼に施された切開切開の概略図。 ピンセットを使用して視神経を保持し、メスを使用して輪部の後方に完全に切開し、マウスの網膜を水晶体と前房から分離します。紫色の破線は、垂直切開の位置を示しています。この概略図は、科学的な画像とイラストレーションのソフトウェアを使用して描かれました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig02.jpg"> 図2:AFM測定のための無傷のマウス網膜血管の単離のためのプロトコルの最適化 (A)ステレオスコープ画像は、毛細血管単離ステップの前に、軽度に固定されたマウスの眼から単離された無傷の網膜を示しています。スケールバー:2 mm. (B) 4倍倍率での代表的な位相コントラスト画像は、異なる分離法を使用して得られたマウス網膜血管を示しています。分離された血管の構造的完全性と耐久性を比較すると、除核眼からの網膜のトリプシン消化を5%ホルマリンで4°Cで24時間固定(赤枠)すると、AFM剛性測定に最も適した網膜血管系が得られることがわかりました。この方法を用いて単離された網膜血管は、ガラス表面に沿って均一に広がる明確な血管網を示した。スケールバー:500μm.(C)無傷の網膜毛細血管網の高倍率(20倍)ビューは、(B)に示されているものと同様に、穏やかに固定された眼から得られる毛細血管の高い構造的完全性を確認します。スケールバー:100μm。この数値は4から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig03.jpg"> 図3:ヒトおよびマウスの初代REC培養物から得られた脱細胞化マトリックス。 (A)ヒトまたはマウスRECsの10日間(10d)または15日(15d)培養の脱細胞化後のガラスカバーガラス上の内皮下マトリックス凝集体を示す20倍率の代表的な位相コントラスト画像 スケールバー:100μm.(B)15日間のヒトREC培養物から得られた脱細胞化マトリックスの代表的な高倍率(100倍)共焦点蛍光画像は、抗コラーゲンIVおよび抗フィブロネクチン抗体で標識した、密度の高いナノフィブリルコラーゲンIVを明らかにします。およびフィブロネクチンマトリックス。スケールバー:20μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66922/66922fig04.jpg"> 図4:マウス網膜毛細血管のAFM剛性測定による力距離曲線。 折れ線グラフは、(A)非糖尿病マウスまたは(B)糖尿病マウスから単離されたマウス網膜毛細血管の1つの位置での単一の力圧痕測定からの代表的なアプローチ(明るい色)と収縮(暗い色)曲線を示しています。SAA-SPH 半径 1 μm の半球カンチレバープローブを使用して得られた力曲線は、カンチレバーとサンプルの距離 (z-ピエゾで制御) とカンチレバーのたわみを引き起こす加えられた垂直方向の力との関係をプロットします。(A)黄色の矢印はZピエゾ駆動のカンチレバーによる試料へのアプローチ、白矢印はカンチレバープローブが試料に接触する接触点、緑の矢印は設定値(ピーク)までのカンチレバーのたわみ(※)を示します。(B)糖尿病マウスから分離された網膜毛細血管から得られたアプローチ曲線と収縮曲線は、非糖尿病マウスのもの(Aに示す)よりも著しく急な勾配を示し、糖尿病マウスの毛細血管剛性が高いことを示しています。矢印は、ベースラインより下の収縮曲線のくぼみを示しており、これは、インデンテーション中のプローブとサンプル間の接着によって引き起こされるカンチレバープローブの負のたわみを反映しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66922/66922fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

私たちは最近、糖尿病に関連する網膜機能障害の新しいパラダイムとして網膜毛細血管硬化を特定しました。このプロトコルでは、網膜内皮培養物からマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスを単離する手順を詳しく説明し、続いて原子間力顕微鏡を用いた剛性測定技術について説明します。

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原子間力顕微鏡を用いた剛性測定のためのマウス網膜毛細血管および内皮下マトリックスの単離

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