Name: ラット子宮内膜上皮幹細胞からのラット子宮オルガノイドの作製と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 学ぶラット子宮内膜上皮幹細胞の分離培養法と子宮オルガノイド作製技術。コラゲナーゼとマトリゲルを用いた再現性の高いプロトコルで、女性生殖系疾患の創薬・遺伝子編集研究に貢献します。

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<ol><li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
<li>Garcia-Alonso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+temporal+and+spatial+dynamics+of+the+human+endometrium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro.</a> Nat Genet. 53 (12), 1698-1711 (2021).</li>
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<li>Esfandiari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometriosis+organoids%3A+prospects+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Endometriosis organoids: prospects and challenges.</a> Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>抗CD15 (SSEA-1)</td><td>Abcam</td><td>ab135377</td> ウ<td>サギ、1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>抗エストロゲン受容体アルファ</td><td>Abcam</td><td>ab32063</td><td>ウサギ、1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>抗パンサイトケラチン</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>マウス、1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>抗プロゲステロン受容体</td><td>Abcam</td><td>ab101688</td><td>ウサギ、1:200 (IHC)</td></tr><tr><td>抗 Ki67</td><td>Abcam ab279653</td><td></td><td>マウス、1:250 (IHC)</td></tr><tr><td>A8301</td><td>TargetMol</td><td>909910-43-6</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-エストラジオール</td><td>メルク</td><td>E8875</td><td></td></tr><tr><td>細胞計数キット-8</td><td>Beyotime</td><td>C0038</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>BioLegend</td><td>109819</td><td>1:20 (FC)、パシフィック</td></tr><tr><td>ブルー CD24</td><td>BioLegend</td><td>101806</td><td>1:20 (FC)、FITC</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>303120</td><td>1:20 (FC)、APC</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>301703</td><td>1:20 (FC)、PE</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>TargetMol</td><td>CT99021</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex オルガノイド採取溶液</td><td>R&D Systems</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 TSA 蛍光システム キット</td><td>APExBIO</td><td>K1051</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 TSA 蛍光システム キット</td><td>APExBIO</td><td>K1052</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542</td><td>1 &g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>BioLegend</td><td>369803</td><td>1:20 (FC)、PerCP</td></tr><tr><td>フルオレセイン TSA 蛍光システムキット</td><td>APExBIO</td><td>K1050</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG、Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG、Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-21422</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG/HRP 抗体</td><td>APExBIO</td><td>bs-0295G-HRP</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT マスター ミックス</td><td>Takara</td><td>RR063A</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>メルク</td><td>57-83-0</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley ラット&nbsp;</td><td>Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>BioLegend</td><td>323047</td><td>1:20 (FC), APC</td></tr><tr><td>TB Green Fast qPCR Mix</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>TriZOL</td><td>Invitrogen</td><td>15596026CN</td><td>RNA extraction</td></tr><tr><td>u-Slide 8-well plates</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TargetMol</td><td>146986-50-7</td><td></td></tr><tr><td><標的遺伝子の>strongqPCRプライマー&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genes</td><td>Company<</td><td>strong>Sequences</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACATGCCGCCTGGAGAAAC</td><td></td></tr><tr><td>rat GAPDH R</td><td>Sangon biotech</td><td>AGCCCAGGATGCCCTTTAGT</td><td></td></tr><tr><td>rat Nanog F</td><td>Sangon biotech</td><td>GACTAGCAACGGCCTGACTCA</td><td></td></tr><tr><td>ラットナノグR&nbsp;</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>CTGCAATGGATGCTGGGATA</td><td></td></tr><tr><td>ラット Sox2 F</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>ATTACCCGCAGCAAAATGAC</td><td></td></tr><tr><td>ラット Sox2 R</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>ラット Oct4 F</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>CCCAGCGCCGTGAAGTTGGGA</td><td></td></tr><tr><td>ラット Oct4 R</td><td>サンゴンバイオテック</td><td>ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA GG</td><td></td></tr></tbody></table>

ラット子宮内膜上皮幹細胞からのラット子宮オルガノイドの作製と特性評価

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

reESCとラット子宮オルガノイドは、 図1に概説したプロトコルに従って、体重200 gから250 gの6匹の雌Sprague-Dawleyラットから確立されました。ヒト子宮内膜上皮幹細胞の長期培養の成功を受けて、REEM製剤は主にY27632、A8301、およびCHIR99021で構成されていました。 in vitroでreESCを安定化するために、最初に酵素的および機械的手法を使用してラット子宮内膜から子宮内膜細胞を単離しました。 図2A のフローサイトメトリー解析により、初代子宮内膜細胞は、CD9を発現する上皮細胞の約50%(49.8%)で構成され、EpCAM細胞(4.49%)およびCD24(2.64%)のレベルが低いことが明らかになりました。reESCのSSEA-1マーカーは6.58%に存在し、内皮マーカーCD31(30.9%)とCD45(70.3%)は比較的高かった。
しかし、REEMで培養すると、P1 reESCは均一な渦巻き状または多面体の形態を示し、コンパクトなクローン構造を形成しました(図2D)。REEMから個々の要因を徐々に取り除くと、reESCの増殖能力がそれに応じて減少しました。クローン形成アッセイは、reESCの安定培養におけるY27632の重要な役割を強調しました(図2B、C)。3回目の継代までに、reESCはSSEA-1とCytokeratinの一貫した発現を示し、培養中の一次reESCの増殖が成功したことを示しています(図2F)。さらに、reESCは後期通過時でも堅牢で安定した増殖能力を維持し(図2E)、現在のREEMシステムでの分離と拡張に成功していることを示しています。
オルガノイド培養は、以前に報告されたヒト子宮内膜幹細胞8に由来するシステムに従って確立されました。3日以内に、reESCは中心が空洞を持つオルガノイド様構造に急速に自己組織化し、その後、サイズと厚さが増加しました( 図3Aを参照)。reESCによるオルガノイドの形成を示す典型的なHE染色結果を 図3Bに示します。これらのオルガノイド培養は、直接継代サイクルと凍結融解サイクルの両方に続くKi67染色によって示される高い細胞生存率によって証明されるように、継代を通じて維持することができます。さらに、第10世代のオルガノイドに対してHE染色を行ったところ、オルガノイドの構造をそのまま維持できることが示されました( 図3E参照)。さらに、qPCRの結果は、Nanog、Sox2、およびOct4がP1世代と同等のレベルで発現していることを示しました(図3F)。この知見は、現在のシステム内でオルガノイドを長期培養できる可能性を示唆しています。
私たちの研究では、ラットの子宮様構造のE2 およびP4に対する応答について予備調査を行いました。 図4A の免疫蛍光染色により、エストロゲン受容体とプロゲステロン受容体の存在が明らかになりました。E2 の補給後、これらのオルガノイドは、中空の球形からより密集した内部成長パターンに移行しました(図4C)。その後のP4 への曝露は、緻密な構造の透過性の低下につながり、最終的にはそれらの崩壊をもたらしました(図4B)。これらの知見は、E2 がラットの子宮様構造のさらなる分化を促進する可能性があるのに対し、P4 はアポトーシス経路を誘発する可能性があることを示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig01v2.jpg"> 
図1:ラット子宮内膜上皮幹細胞およびラット子宮オルガノイドの樹立に用いた手順。 略語:SD = Sprague-Dawley。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig02v2.jpg"> 
図2:ラット子宮内膜上皮幹細胞の in vitroでの作製と長期培養 (A)ラット子宮内膜の陽性細胞の割合を示すフローサイトメトリー解析。(B)A8301、Y27632、またはCHIR99021の有無にかかわらず、REEM中のクローンの結晶紫色染色。スケールバー = 1 cm. (C) 因子の有無にかかわらず、REEMのクローン番号。エラーバーは標準偏差を表します。n = 3 人のドナー (***, p&lt;0.001)。(D)結晶紫色染色の有無にかかわらず、P1ラット子宮内膜上皮幹細胞の光学顕微鏡画像。(E)継代1、継代7、および継代14でのラット子宮内膜上皮幹細胞のCCK-8分析。エラーバーは標準偏差、n = 3を表します。(F)サイトケラチンとSSEA-1の発現を示す免疫蛍光分析。略語:REEM = reESCの拡張媒体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig03v2.jpg"> 
図3:ラット子宮内膜オルガノイドのin vitroでの作製と長期培養 。 (A)P1ラット子宮内膜オルガノイドの光学顕微鏡画像。(B)ラット子宮内膜上皮幹細胞由来のP1オルガノイドのH&amp;E染色。(C)サイトケラチンとSSEA-1の発現を示す免疫蛍光分析。(D)Ki67およびSSEA-1の発現を示す免疫蛍光分析。(E)P 10ラットオルガノイドのH&amp;E染色。(F)P1およびP10ラット子宮内膜オルガノイドにおけるNanog、Sox2、およびOct-4の発現に関するqPCR解析。GAPDH に正規化された式 (n = 3、両側の対応のない t 検定、n.s. = 有意ではない)。略語:H&amp;E =ヘマトキシリンとエオシン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66928/66928fig04.jpg"> 
図4:E2 およびP4によるオルガノイドの逐次培養 (A)エストロゲン受容体、プロゲストーゲン受容体、およびSSEA-1の発現を示す免疫蛍光分析。(B)E2 およびP4で培養したラットオルガノイドの光学顕微鏡画像の概要。(C)光学顕微鏡画像は、E2で7日間培養した後、オルガノイドの内部空洞内で中空の球体が緻密に変化することを示しています。略語:ER =エストロゲン受容体;PR = プロゲストゲン受容体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66928/66928fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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