Name: 成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 学ぶ側方尾静脈注射による成体マウスへのAAV一貫送達法。加温による血管拡張と適切な保定を用いた最適化プロトコルで、遺伝子治療研究における転導効率評価の再現性を向上させます。

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著者は、NINDS動物ケア施設のスタッフの支援に感謝します。この研究は、NINDSのNIHの学内研究部門(年次報告書番号1ZIANS003129)の支援を受けました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

前臨床マウスモデルにおける静脈内注射によるAAVベースの治療

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著者は、この記事で公開された研究に関連する開示を持っていません。

AAVベースの治療法は、遺伝子治療ベクターとしてのAAVの汎用性により、単一遺伝子障害に対して大きな可能性を秘めており、これにより、さまざまな障害の様々な送達ニーズに合わせてAAVをカスタマイズすることが可能になる4,5,7,9。AAVは、一般的に前臨床マウスモデルでIV注射を介して投与され、潜在的な治療法の安全性と有効性をテストします16。異なる注入されたAAV用量は、実験結果に顕著な違いをもたらす可能性があるので、生成されたin vivoデータ28の有効性および頑健性を確保するために、実験者が意図したAAV用量を一貫して注入できることが重要である。IV注射は広く使用されていますが、技術的には困難であり、注射を一貫して成功させるスキルレベルを開発および維持するために広範なトレーニングと継続的な練習が必要です16,17,18,19。AAVを正しく注入することに加えて、通常、注入されたAAVの生体内分布および標的組織または細胞への送達効率を評価するためにアッセイを使用することが望まれる29,30。
このプロトコルは、7〜9週齢の非鎮静マウスにAAVを投与するための最適化されたIV注射プロトコルの詳細を徹底的に説明することにより、実験者が簡単にIV注射を成功裏かつ一貫して行うのを支援することを目的としています。ここで使用される年齢範囲の野生型マウスよりも著しく小さいまたは大きいマウスは、静脈の視認性が低下したり、この方法で使用される拘束具と互換性がなくなったりするため、より大きな課題を提示する可能性があることに注意することが重要です。テールIV注射は、血管サイズが31と小さいため、生後6週未満のマウスに試薬を静脈内投与するのに適切ではないことが以前に報告されています。可能であっても、体重が22.0g未満のマウスに一貫して注射するのは難しいかもしれません。非定型サイズのマウスを使用する研究者は、手順に適応する必要があるかもしれません。このプロトコルでは、AAVの生体内分布と形質導入効率を評価するために使用できるいくつかのアッセイについても概説しています。
このプロトコルに従う際には、いくつかの重要な点に留意する必要があります。注射中、針が静脈内にない場合、29 Gの針はより大きな抵抗を提供します。これにより、失敗した注入試行中に誤って溶液の血管周囲注射によって失われる体積が減少します。インスリン注射器は、通常の注射器よりもデッドボリュームが小さくなっています。ここに記載されているものとは異なるシリンジおよび/または針を使用する場合、より大きなデッドスペース容量を考慮して、プロトコルステップ1.1.3.3で追加の注入液量を準備する必要がある場合があります(例:15μLではなく、意図した用量に30μLを追加します)。
AAV用量をシリンジに吸引する際に、シリンジ側に微細な吸引による気泡が形成された場合は、注射液をゆっくりとシリンジのさらに上に引っ張ってください。.これにより、ほとんどの小さな気泡が除去されます。注入する予定の容量に少なくとも10〜15μLのAAVを追加でロードします。この追加ボリュームは、気泡の排出中または潜在的な注入試行の失敗中に失われる可能性のあるボリュームを説明するためのものです。(例:注入する目標容量が150 μLの場合、165 μLをシリンジにロードします(シリンジスケールの160 μLと170 μLの中間)。針が静脈内に正しく配置され、注射が成功する直前にシリンジ内の容量が165 μLの場合、シリンジに15 μLが残るまで試薬を送達します(10 μLと20 μLの中間)ため、150 μL(165 μL - 150 μL = 15 μL))が送達されます。ベベルルーメン(ベベルが上を向いている)をシリンジスケールに合わせると、注入中に送達された量を追跡できます。
実験者によっては、マウスを横向きにして、足にマウスを乗せた場合に比べて、静脈の1つがまっすぐでアクセスしやすいようにすることを好むかもしれません。ただし、マウスの横向きの尾は、マウスのサイズに応じて異なる角度で傾斜するため、異なるサイズのマウスを注入する場合は注入角度の調整が必要です。これは、手順の成功の一貫性に悪影響を与える可能性があります。最初の練習試行では、実験者は両方のマウス抑制方向を試して、好みのアプローチを決定できます。マウスを足に置くと、両方の外側尾静脈にすばやく簡単にアクセスできます。これにより、複数回の注射失敗の場合に両方の静脈へのアクセスが必要な場合の拘束時間が短縮されます。
尾根付近(マウス本体に近い)に側静脈を注入する場合(特に体重>30g)のマウスの場合、尾根の静脈は遠位よりも少し深いため、静脈と平行な静脈から注入角度を静脈に対して5°〜10°に調整してください。
ここに挙げたRNase消化およびRNAコンタミネーションチェックのプロトコールは、20 μL中に合計175-700 ngの核酸を含む新鮮凍結肝臓組織から単離されたDNAサンプルで検証されました。RNase消化プロトコルは、RNase消化後のベクターゲノムとマウスゲノムの存在を確認するために、新鮮凍結肝臓組織およびFACS選別細胞から単離されたDNAサンプルでも試験されました。結果は、標的アンプリコンのエンドポイントPCR増幅のアガロースゲル電気泳動を使用して視覚化されました。
記載されている方法論に従うことで、IV注射を習得するために必要なトレーニングと練習時間を短縮し、注射成功率を高めることができ、試薬を節約できます。このプロトコルは、シンプルで一般的に使用されるツールを利用しており、すぐには利用できない可能性のある高度な機器やセットアップは必要ありません。さらに、ここに挙げたIV注入ステップは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)など、静脈内投与が必要な幅広い注入剤に適用することができ、注入液に応じて注射剤調製ステップに適切な変更を加えることができます。

単一遺伝子性疾患は希少疾患の80%を占め、世界中で3億人が罹患しています1,2。現在、これらの非常に衰弱させる希少疾患の大部分に対して承認された治癒療法はありません1,2,3。しかし、単一遺伝子疾患は、機能不全の遺伝子を置換、補完、修正、または沈黙させることができる遺伝子治療の理想的な候補です4,5。現在、複数のベクターが開発され、特定の細胞タイプに遺伝子治療を送達するために使用されています4,6。そのベクターの1つがアデノ随伴ウイルス(AAV)です。AAVは非病原性パルボウイルスであり、遺伝子治療ベクターとしてますます使用されています7。他のウイルスベクターと比較して、AAVは免疫原性が低く、宿主ゲノムに組み込まれる可能性が低く、さまざまな組織で分裂細胞と非分裂細胞を効率的に形質導入する能力を持っています7,8。さらに、特異的な組織指向性や免疫原性をさらに低下させるなどの望ましい特性を持つAAVを設計および同定するための複数のアプローチが開発されており、これにより、さまざまな適応症のウイルスベクターとしてのAAVの汎用性が大幅に向上しています9。これらの要因により、AAVは広く研究されている遺伝子治療ベクターとなり、FDAが承認した複数のAAVベースの遺伝子治療の開発につながっています10。
マウスモデルは、in vivoで遺伝子治療の可能性を試験し、単一遺伝子疾患の病態メカニズムをよりよく理解するために一般的に使用されます。これは、マウスモデルがさまざまな条件の病状を再現していること、そのゲノムがヒトゲノムと類似していること、マウスの取り扱い、維持、および世代が比較的容易であることによるものです11,12,13。in vivo試験は、筋ジストロフィーなど、体の複数のシステムや領域に影響を与える疾患を研究する場合に特に重要です。これらの疾患については、in vitro試験では、全身投与後にさまざまな身体領域に到達することを意図した治療薬の安全性、有効性、薬物動態、および薬力学を包括的に評価するには不十分である可能性がある14。
薬物の送達には、さまざまな全身投与経路を使用することができます。各ルートには、その利点、欠点、および調査対象の動物モデルおよび薬物との適合性の程度があります15。静脈内(IV)側方尾静脈注射は、マウス16におけるAAVの全身送達に一般的に使用される経路である。側方尾静脈注射は、マウスの血流への注射液の迅速かつ直接的な投与を可能にし、体循環における高い薬物バイオアベイラビリティを確保する17。また、比較的単純で一般的に利用可能なツールを実行する必要があります。しかし、主に尾静脈の直径が小さく、静脈の位置を特定するのが難しいため、側方尾静脈注射は技術的に困難であり、注射の試みの失敗や不完全な用量送達を避けるために、高度なスキルと絶え間ない練習が必要です16,17,18,19。これらは、高価な試薬の損失や不正確な結果につながる可能性があります。特に、注入中に不完全な注入が認識されない場合です。ここに要約された私たちの経験は、私たちが使用に適応した十分に文書化された記事で報告されたプロトコルに基づいており、側尾静脈注射手順のさまざまなステップを最適化して、一貫して成功した注射を保証します20,21,22,23,24,25,26,27。
ここでは、シンプルで一般的に利用可能なツールを使用して、鎮静剤を投与していない7〜9週齢のマウスにAAVを送達するための、この詳細に最適化された側尾静脈注射プロトコルについて説明します。さらに、AAVの送達と生体内分布の評価に使用される方法のプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、注射後の組織収集、組織固定、DNA抽出、および二倍体ゲノム(vg/dg)定量化あたりのデジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベクターゲノムをカバーしています。ここで提供されるIV注射プロトコルと指針は、側方尾静脈注射を成功裏に行うことの容易さを高めることを目的としています。これにより、注射技術の習得に必要な時間を短縮すると同時に、注射の精度と一貫性を向上させることができる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mシリンジフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGVM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0.3 mLインスリンシリンジ、29Gニードル付き</td><td>BD Biosciences</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL微量遠心分離機&nbsp; チューブ</td><td>Crystalgen</td><td>23-2051</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>The Warner Graham Company</td><td>201096</td><td></td></tr><tr><td>10x phosphate-buffered生理食塩水(PBS)</td><td>コーニング</td><td>46-013-CM</td><td>組織固定用の1x PBSの調製に使用</td></tr><tr><td>15mLコニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>15mLコニカルチューブホルダー</td><td>複数のソース</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>190プルーフ エチルアルコール</td><td>ワーナー・グラハム・カンパニー</td><td>6810-01-113-7320</td><td>70%エタノールの調製に使用</td></tr><tr><td>1x 滅菌PBS</td><td>ギブコ</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>2 mL微量遠心組織保存チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>022363344</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>アデノ随伴ウイルス (AAV)</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>一本鎖 DNA (ssDNA) AAV は、CMV プロモーター アルコール綿棒 BD Biosciences によって駆動される導入遺伝子として Cre リコンビナーゼを送達するためにパッケージ化されました</td></tr><tr><td></td><td></td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>ビーズ溶解チューブ</td><td>Next Advance</td><td>GREENE5</td><td></td></tr><tr><td>BsuRI(HaeIII)制限酵素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ER0151&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>弾丸ブレンダー</td><td>ネクストアドバンス</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>JAX 007914系統由来Ai14由来マウス(遺伝的背景:C57BL/6J)</td><td>該当なし</td> 該当<td>なし/A</td><td>Ai14 Cre-reporter対立遺伝子含有マウスをJAXから購入(カタログ番号:007914)</td></tr><tr><td>ディスポーザブル吸収パッド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>1420662</td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子</td><td>ファインサイエンスツールズ(F.S.T)</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>Fine Science Tools (F.S.T)</td><td>14085-08</td><td></td></tr><tr><td>DNA degradation reagent (DNAZap)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extraction RNase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>For RNA digestion during nucleic acid</td></tr><tr><td>extraction DNase-free RNase for DNA cleanup</td><td>&nbsp;F. Hoffmann-La Roche</td><td>11119915001</td><td>For RNAdigestion after nucleic acid抽出</td></tr><tr><td>dPCRプローブPCRキット</td><td>Qiagen</td><td>250102</td><td></td></tr><tr><td>dPCRソフトウェア&nbsp;</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>QIAcuityソフトウェアスイート&nbsp;</td></tr><tr><td>高架プラットフォーム</td><td>複数のソース</td><td>N/A</td><td>空のピペットチップボックスを使用して、テールウォーミングアップ中にマウスの拘束具を持ち上げました</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>複数のソース</td><td>N/A</td><td>ここで使用したモデル: Nikon Eclipse Ti</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡ソフトウェア&nbsp;</td><td>複数のソース&nbsp;</td><td>N/A&nbsp;</td><td>ここで使用しているソフトウェア: NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>Covidien</td><td>9022</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>エッペンドルフ</td><td>サーモミキサー5350</td><td></td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>22620689</td><td></td></tr><tr><td>金属容器</td><td>Vollrath</td><td>80125</td><td></td></tr><tr><td>メチルブタン</td><td>J.T.ベイカー</td><td>Q223-08</td><td></td></tr><tr><td>分子グレードの水</td><td>質 生物学的</td><td>351-029-131</td><td></td></tr><tr><td>マウスチューブ拘束具</td><td>Braintree Scientific</td><td>TV-RED-150-STD</td><td></td></tr><tr><td>Myfuge ミニ遠心分離機</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>ポリメラーゼ連鎖反応サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1851148</td><td>モデル: C1000 タッチ</td></tr><tr><td>精密ワイプ</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity dPCR ナノプレート 26k 24 ウェル</td><td>Qiagen</td><td>250001</td><td></td></tr><tr><td>QIAcuity One dPCR システム</td><td>Qiagen</td><td>911020</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood &ティッシュキット</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>組織からのDNA抽出に使用</td></tr><tr><td>Qiagen QIAamp DNA マイクロキット</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>ゲノムDNAのクリーンアップに使用され、少量の血液からDNAを分離 prtocotolは、FACS選別細胞からのDNA抽出に使用されました</td></tr><tr><td>げっ歯類拘束コーン</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>オーハウス</td><td>72212663</td><td></td></tr><tr><td>発泡スチロールボックス</td><td>複数のソース</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1kg</td><td></td></tr><tr><td>表面クリーナーおよび消毒剤</td><td>Peroxigard</td><td>29101&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td>複数のソース</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トランスファー鉗子</td><td>ファインサイエンスツール (F.S.T)</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>ダイガー &会社</td><td>22220A</td><td>モデル:Daigger Vortex Genie 2</td></tr></tbody></table>

成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達

Consistent Delivery of Adeno-Associated Virus via Lateral Tail-Vein Injection in Adult Mice

多くの疾患は複数の臓器に影響を及ぼしたり、体のさまざまな領域に関与したりするため、さまざまな部位にある患部細胞を標的とする治療薬を全身的に送達することが重要です。静脈内注射は、全身への投与を目的とした治療を評価する前臨床試験で広く使用されている全身送達ルートです。成体マウスでは、マウスの外側尾静脈に治療薬を静脈内投与します。使いこなせば、尾静脈注射は安全で迅速であり、シンプルで一般的に入手可能なツールのみが必要です。しかし、尾静脈注射は技術的に困難であり、意図した用量を正確に送達するためには、広範なトレーニングと継続的な練習が必要です。
ここでは、私たちの経験と以前に他のグループから報告された推奨事項に基づいて開発した、詳細で最適化された側方尾静脈注射プロトコルについて説明します。マウスの拘束具とインスリン注射器以外に、このプロトコルでは、ほとんどのラボですぐに利用できる試薬と機器のみが必要です。このプロトコルに従うと、鎮静剤を投与していない7〜9週齢のマウスの尾静脈へのアデノ随伴ウイルス(AAV)の静脈内送達が一貫して成功することがわかりました。さらに、蛍光レポータータンパク質の組織学的検出と、AAV形質導入と生体内分布の評価に使用される二倍体ゲノム(vg/dg)定量化によるベクターゲノムの組織学的検出に最適化されたプロトコルについても説明します。このプロトコルの目標は、実験者が尾静脈注射を成功裏かつ一貫して簡単に行えるように支援することであり、これにより、技術を習得するために必要な練習時間を短縮できます。

7〜9週齢の雄マウスに、1.5 ×1012 vg/マウスで側尾静脈注射を介してAAVを150〜200μLの注入液量で注入しました。ここで使用したssDNA AAVは、CMVプロモーターによって駆動されるCreリコンビナーゼ導入遺伝子を送達しました。注射されたマウスは、CreレポーターAi14対立遺伝子に対してホモ接合体でした。Creリコンビナーゼに曝露されると、Ai14対立遺伝子含有細胞は蛍光tdTomatoタンパク質を発現します。tdTomatoの発現はCreによるゲノム組換えによるものであるため、tdTomato発現細胞は、AAVによって直接形質導入された細胞、または形質導入された細胞の子孫細胞である細胞を示します。ここに示すデータは、160μL(5.8-5.9 ×10 13 vg/kg)で1.5 ×10 12 vg/マウスでAAV9-CMV-Creを注入したマウスのデータです。マウスは注射後28日で屠殺し、上記のように組織を採取した。いくつかの骨格筋と肝葉を消化し、それらの細胞をFACSを使用して収集しました。いくつかの肝葉は、核酸抽出のために予め冷却されたメチルブタンを使用してすぐに凍結されました。いくつかの骨格筋と肝葉は、蛍光tdTomatoの組織学的イメージングのために固定凍結されました。tdTomatoは、肝臓(図2A)と大腿四頭筋(図2C)全体にびまん性に発現しており、AAV9が両組織の異なる領域に広く到達し、形質導入したことを示しました。
新鮮凍結肝臓およびFACS選別細胞から抽出したDNAを用いて、dPCRを用いてvg/dgを定量した。Vg/dg定量は、分析されたサンプル中のAAVの注入の一貫性と形質導入効率を評価するために使用できます。新鮮凍結肝臓組織サンプルとFACSで選別された細胞からの1D液滴散布図を使用して、アッセイの有効性を確認しました(図3A、C)。散布図では、正と負のパーティションの存在、検出閾値を正確に決定できる正のパーティションとネガティブなパーティション間の明確な分離、および正のパーティションと負のパーティションの間に液滴が存在しないか少ないことが示されました。これにより、dPCRアッセイの精度が低下する可能性があります。これらすべての基準を満たすことは、dPCRアッセイの結果が有効であることを示しました。各サンプル中の Polr2a 遺伝子コピー数を定量化してマウス二倍体ゲノムの数を決定し( 2 Polr2a 遺伝子コピー/マウス二倍体ゲノム)、Creリコンビナーゼ導入遺伝子配列に対するプライマー/プローブを使用してウイルスゲノムを定量しました(1 Transitionine copy/viral genome、 表1)。vg/dg値は、新鮮凍結肝臓組織サンプルおよびFACS選別細胞について定量化され、各サンプルにそれぞれ187.7 vg/dgおよび4.7 vg/dgが存在することが示されました(図3B、D)。PBSを注入したマウスおよび核酸を含まない非テンプレートコントロールのサンプルをネガティブコントロールとして使用した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig01.jpg"> 図1:静脈内注射ステーションの概要(A)IV注射を行うために必要なツール。ここに示されているのは、(1)タイマー、(2)マウスチューブ拘束具、(3)未カットおよび(4)カットプラスチック拘束コーン、(5)アルコール綿棒、(6)マウスチューブ拘束具を上昇させるためのプラットフォームとして使用される空のピペットチップボックス、(7)使い捨て吸収パッド、(8)温水入り15mLコニカルチューブ、(9)15mLチューブホルダー、(10)ガーゼ、(11)インスリン注射器です。(B)マウスは最初にチューブ拘束具の内側に配置されます。次に、マウスが小さすぎてチューブ拘束装置だけでは拘束できない場合は、カットされた拘束コーンを挿入してマウスの周りに拘束スリーブを作成します。マウスの呼吸が拘束具によって妨げられていないことを確認してください。チューブ拘束具は、マウステールを温水に配置できるように、高架プラットフォームの上部に配置されています。(C)注入を行う直前のマウステールの位置と針の保持角度。テールを引き戻してテールを伸ばし、注入部位が完全に水平になるようにします。針は尾と静脈に平行で、斜角は上を向いています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig02.jpg"> 図2:IV注入後の蛍光レポータータンパク質の検出。CreレポーターAi14対立遺伝子を有する7〜9週齢の雄マウスに、160μL(5.8-5.9 × 1013 vg/kg)またはPBSで1.5 × 1012 vg/マウスのAAV9-CMV-CreをIV注射しました。Cre IV注射を投与するAAV9後のマウス(A)肝臓または(C)大腿四頭筋切片の代表的な蛍光画像。(B)PBSを注入したマウスの肝臓または(D)大腿四頭筋切片を、ネガティブコントロールとして機能するように画像化しました。組織は収集され、IV注射の28日後に固定凍結されました。Creばく露後、蛍光tdTomatoタンパク質は、形質導入細胞および形質導入細胞の子孫細胞で発現します。厚さ10μmの切片を10倍の倍率で画像化しました。スケールバー = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66934/66934fig03.jpg"> 図3:二倍体ゲノムあたりのベクターゲノム(vg/dg)定量 (A)肝臓組織または(C)AAV9-CMV-CreまたはPBSを注射したマウスから採取したFACSソート細胞におけるdPCRベクターゲノム定量の1D散布図。散布図は、陽性と陰性のdPCRパーティション、およびサンプルを横切る水平線で示された検出しきい値を示しています。(B、D)(B)肝臓組織または(D)FACSで選別された細胞サンプル中のマウス二倍体ゲノムおよびベクターゲノムを定量した後のvg/dg定量。ここに示す結果は、AAV9を注入したマウス1匹とPBSを注入したマウス1匹と、各マウスにテクニカルdPCRの複製を行ったものです。エラーバーは、各サンプルの95%信頼区間を示します。略語: NTC= 非テンプレート制御;dPCR =デジタルPCR;FACS = 蛍光活性化細胞ソーティング。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66934/66934fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>入門</td>
			<td>順序</td>
		</tr><tr><td>Cre フォワードプライマー</td>
			<td>CTGACGGTGGGAGAATGTTAAT</td>
		</tr><tr><td>Cre リバースプライマー</td>
			<td>CATCGCTCGACCAGTTTAGTT</td>
		</tr><tr><td>Cre プローブ</td>
			<td>/56-FAM/CGCAGGTGT/ZEN/AGAGAAGGCACTTAGC/3IABkFQ/</td>
		</tr><tr><td>Polr2a フォワードプライマー</td>
			<td>GACTCCTTCACTCACTGTCTTC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a リバースプライマー</td>
			<td>TCTTGCTAGGCAGTCCATTATC</td>
		</tr><tr><td>Polr2a プローブ</td>
			<td>/5HEX/ACGAGATGC/ZEN/TGAAAGAGCCAAGGT/3IABkFQ/</td>
		</tr></tbody></table>表1:vg/dgの定量に使用したプライマーとプローブの配列。 Cre プライマーとプローブを使用して、ベクターゲノムを定量しました。 Polr2a プライマーとプローブを使用して、マウスの二倍体ゲノムを定量しました。

ここでは、成体マウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)を全身投与するためのマウス側尾静脈注射の最適化されたプロトコルについて詳しく説明します。さらに、AAV形質導入を評価するために一般的に使用されるアッセイのプロトコルについても説明します。

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