Name: クマムシHypsibius exemplarisにおけるqRT-PCRによる相対転写レベルの比較のための単一動物、単一チューブRNA抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶ クマムシHypsibius exemplarisの単一動物からの迅速RNA抽出法とqRT-PCRによる相対転写レベル解析。この効率的な手法は、個体間の遺伝子発現変動を正確に評価し、極限環境適応の分子メカニズム解明に貢献します。

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<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66935/66935fig01.jpg"> 
図1:単一のクマムシからのRNA抽出のためのシングルチューブパイプライン。 (A)6回の凍結融解サイクルとその後のcDNA合成を含む、単一のクマムシからのRNA抽出のプロトコルを示すスキーム。その後、サンプルをRT-PCRおよびqRT-PCRに使用できます。(B)水分の除去に用いるマイクロピペットテーパーのイメージ。スケールバー:2 mm.(C)少量の水(点線)中のクマムシの明るい視野画像。ほとんどの水は、示されている範囲で除去する必要があり、抽出を成功させ、溶解バッファーの希釈を防ぎます。スケールバー:50μm。(D)長い鉗子を使用してサンプルを液体窒素に浸し、サンプルを安全に急速に凍結融解する様子を示す画像。一部のコンテンツはBioRenderで作成されました。(2022) BioRender.com/d93s511 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66935/66935fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
注:図1Aは、手順の概略図を示しています。クマムシおよび藻類の詳細な培養手順については、以前に公開されたレポート45,46,47を参照してください。
1.湧き水の殺菌
<ol>
	<li>2ガロンの水差しから5Lの湧き水を注ぎます(詳細については 材料の表 を参照)2Lのオートクレーブに安全なガラス瓶に入れます。</li>
	<li>オートクレーブセーフボトルにキャップをかぶせ、少量のオートクレーブテープで密封します。ボトルを締めないでください。キャップを上に置きます。</li>
	<li>湧き水を乾燥ステップなしで湿式サイクルで50分間オートクレーブします。</li>
	<li>水を室温(RT)に戻し、キャップをしっかりと密封してからRTで保管してください。</li>
</ol>
2.ガラスマイクロピペット引き(ピペット引き手付き)
<ol>
	<li>ガラス製マイクロピペット(外径:1mm、内径:0.58mm、長さ:10cm)をマイクロピペットプーラーに固定します。加熱フィラメントとの接触は、ピペットの形状が変わり、フィラメントが損傷するため、避けてください。<ol>
		<li>各フィラメントとピペットプーラーについて、ピペットの引き込みを経験的に決定します。ただし、最適化の出発点として、78°Cを使用し、182.2gの引張重量の1つの引張ステップを使用します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>フィラメントを加熱し、重力に任せて、ガラスマイクロピペットを鋭利な先端を持つ2つのガラスマイクロピペットに分離します(図1B)。</li>
	<li>これらの引っ張ったガラスマイクロピペットは、ワックスまたは粘土を入れた閉じた100mmのペトリ皿に保管して所定の位置に保持し、鋭い先端が壊れるのを防ぎます。</li>
</ol>
3.ガラスマイクロピペットプーリング(ピペットプーラーなし)
<ol>
	<li>ブンゼンバーナーまたはその他の制御された火炎源を低い設定で点灯させます。</li>
	<li>片方の端を両手に持ったガラス製のマイクロピペットを取ります。</li>
	<li>ガラスが溶け始めるまで、ガラスマイクロピペットの中央を炎の上に保持します。次に、両端をすばやく引き離します。これにより、非常に繊細でシャープな先端が2つ作成されます。</li>
	<li>滅菌した細い鉗子で先端を軽く折ってください。</li>
	<li>これらの引っ張ったガラスマイクロピペットは、ワックスまたは粘土を入れた閉じた100mmのペトリ皿に保管して所定の位置に保持し、鋭い先端が壊れるのを防ぎます。</li>
</ol>
4. RNA抽出
<ol>
	<li>0.5 Lの液体窒素をクライオセーフ容器に入れて入手します。 注意: 液体窒素は極低温であり、皮膚や目にさらされると火傷を負う可能性があります。取り扱いの際は、防護服、スプラッシュゴーグル、ニトリル手袋、クライオ手袋、白衣、つま先が閉じた靴を使用してください。液体を輸送する前に、容器が液体窒素に安全であることを確認してください。このステップにエタノールドライアイスバスを使用することも可能です。</li>
	<li>cDNA合成マスターミックスを作製します:ランダムヘキサマープライマー1 μL、DNase2 μL、5x RT Buffer4 μL、酵素ミックス1 μL、H2O1 μL、および10 mM dNTPs1 μLを含む10 μL溶液。この溶液を氷上に保存します。</li>
	<li>クマムシ溶解バッファー(5 mM Tris (pH = 8)、0.5% (v/v) Detergent 1、0.5% (v/v) Detergent 2、0.25 mM EDTA を滅菌ヌクレアーゼフリー水溶液で調製します。 注:この溶液はベンチトップに6か月間保存できます。ただし、無菌性を維持し、潜在的なRNAse汚染源を避けてください。</li>
	<li>抽出に十分な溶解バッファー(2 μL/クマムシ)を分注します。</li>
	<li>RNAse阻害剤をクマムシ溶解緩衝液に添加し、最終濃度を4 U/μLにします。</li>
	<li>溶液をボルテックスし、室温でベンチトップ遠心分離機で2000 x g の速度で5秒間スピンダウンしてから、溶液を氷上に保存します。</li>
	<li>無菌フィルターチップ付きP1000ピペットを使用して、実験に必要な数のクマムシを培養から取り除き、無菌の35 mmペトリ皿に入れます。 注:この方法では、クマムシをいくつでも処理できます。通常、条件ごとに3つのクマムシが抽出のために処理されます。</li>
	<li>オートクレーブ滅菌湧き水1 mLと滅菌フィルターチップ付きP1000ピペットを使用して、クマムシを3回洗浄します。ゆっくりとピペッティングで上下させることで、藻類の汚染物質を取り除くことができます。</li>
	<li>25倍から50倍の倍率で解剖顕微鏡を使用し、この洗浄した培養物から単一のクマムシを、滅菌フィルターチップ付きP10ピペットを使用して新しい滅菌35 mmシャーレに移します。</li>
	<li>滅菌フィルターチップ付きP200ピペットを使用して、100 μLの滅菌ヌクレアーゼフリー水で1つのクマムシを洗浄します。 注:この洗浄ステップは、リボヌクレアーゼなどの汚染物質をさらに除去するために使用されます。</li>
	<li>洗浄したクマムシを、滅菌フィルターチップ付きP10ピペットを使用して、1〜2 μLの滅菌ヌクレアーゼフリー水中の清潔な滅菌PCRチューブの底に移し、クマムシが先端の側面に付着しないように注意深く確認します。</li>
	<li>クマムシを解剖顕微鏡で25倍の倍率で視覚化します。</li>
	<li>水分の除去を容易にするために、引っ張ったガラスマイクロピペットの先端をチューブの外側で軽く折ってください。ボアが水を引き上げるのに十分な大きさであることを確認してくださいが、クマムシは引き上げないでください。</li>
	<li>引っ張ったガラスマイクロピペットの毛細管現象を使用して、動物が直径約2クマムシの長さの小さな水の泡に囲まれるまで水を取り除きます。</li>
	<li>解剖スコープで水分除去プロセスを監視し、水位が適切で、クマムシが水分補給されたままであることを確認します。 注意: 図1C は、除去する水の量の例を示しています。これは重要なステップです。クマムシが乾燥するのを防ぐために、クマムシを小さな水の泡で囲みますが、溶解バッファーの希釈を防ぐために、できるだけ多くの余分な水を取り除く必要があります。例についてはamp残りの水位のファイル、 図1Cを参照してください。</li>
	<li>水を取り除いた直後に、2 μLのクマムシ溶解バッファーをチューブの底に加え、短時間ボルテックスし、卓上遠心分離機でチューブをRTで5秒間、2000 x g で遠心分離します。</li>
	<li>クマムシを含むサンプルを直ちにPCRチューブラックに入れ、ラックにしっかりと保持されていることを確認してください。</li>
	<li>一対の長い粗い鉗子を使用してラックをつかみ、サンプルが入ったラックを完全に凍結するまで液体窒素にゆっくりと浸します(図1D)。</li>
	<li>液体窒素からラックを取り出し、すぐに氷の上に置きます。サンプルを解凍します(~45秒から1分かかります)。サンプルを氷から取り出し、目視で検査することにより、15秒ごとにサンプルを監視します。サンプルが目に見える形で透明になったら、次のステップに進みます。</li>
	<li>手順 4.18 から 4.19 をさらに 5 回繰り返します。最大限の溶解と抽出には、合計6回の凍結融解サイクルが必要です(図2A、B)。</li>
	<li>凍結融解が完了したら、サンプルを氷の上に置き、すぐに次のステップに進みます。この時点でサンプルを凍結して保存すると、cDNA調製に利用可能なRNAが減少するため、保管しないでください。</li>
</ol>
5. cDNA合成
<ol>
	<li>クマムシ溶解物を含むPCRチューブに2 μLのcDNA合成マスターミックスを加えます。チューブを短時間フリックし、卓上遠心分離機で室温2000 x g で5秒間回転させてから、氷上のサンプルを交換します。</li>
	<li>サンプルをサーモサイクラーに入れ、25°Cで10分間インキュベートしてプライマーをアニールし、55°Cで30分間インキュベートして逆転写を行い、最後に酵素を85°Cで5分間熱不活性化します。</li>
	<li>インキュベーション後、すぐにチューブを氷の上に置き、21 μLの滅菌ヌクレアーゼフリー水を加えてサンプルを総容量25 μLに希釈します。コピー数が少ない転写産物の場合は、経験的に決定されたようにこの希釈ステップを変更します。</li>
</ol>
6. qPCRの
<ol>
	<li>大量のクマムシから調製した全RNAを用いてプライマーセットのアニーリング温度を決定する、例えば、Boothby, 201843で提示されたバルク抽出法。</li>
	<li>qRT-PCRを実行する前に、PCR温度グラジエントを実行して最適なアニーリング温度を決定します(このプロトコルで使用されるすべてのPCR設定については、 表1 および 表2を参照してください)。</li>
	<li>インジケーター染料スーパーミックスの1本のチューブを氷上で解凍し、光から隔離します。96ウェルqPCRプレートを氷上に配置し、5 μLのスーパーミックス、2 μLの水、各プライマー1 μL(10 μM)、および1 μLのcDNA産物を目的のウェル数に配置します。</li>
	<li>PCRプレートをプレートシールでシールし、プライマーセットに適したアニーリング温度でqRT-PCRを実行します(このホワイトペーパーで使用したすべてのqRT-PCR設定については、 表3を参照)。</li>
</ol>
7. 定量化と結果の解釈
<ol>
	<li>結果を、課せられた条件で発現が一定であると予想される1つ以上の対照ハウスキーピング遺伝子と定量的に比較します。この研究では、アクチン遺伝子を使用しました。</li>
	<li>各ウェルのCt値またはサイクル閾値を取得し、コントロールハウスキーピング遺伝子反応のCt 値と比較します。次の式を使用して、遺伝子発現の倍率変化を計算します。 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq01.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq02.jpg" style="margin: auto;"> 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq03.jpg" style="margin: auto;"> 注:フォールド遺伝子発現は、各転写産物およびクマムシについて2-(ΔΔCt)48としてプロットされます。</li>
	<li>Ct値から転写産物数の大まかな推定値を取得するには、次の式を使用します。 
	<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66935/66935eq04.jpg" style="margin: auto;"> ここで、Nは転写産物の数であり、2は想定されるPCR効率またはPCR48のサイクル当たりの蛍光の倍増である。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>個々のクマムシのqRT-PCRに最適化されたRNA抽出

<table><tbody><tr><td>10 &micro;L プレミアム バリア チップ 低結合、ラック付き、滅菌済み</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401</td> 滅菌<td>フィルターチップ付き P 10 ピペット&nbsp;ヒント</td></tr><tr><td>1000 & マイクロ;L&nbsp;プレミアムピペットチップ、低結合、ラック付き、滅菌</td>済み <td>Genesee Scientific</td><td>23-165RS</td> は<td>、滅菌フィルターチップ付きP 1000ピペットと呼ばれています&nbsp;ヒント</td></tr><tr><td>200&マイクロ;L&nbsp;プレミアムバリアチップ低結合、ラック付き、滅菌</td>済み<td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>23-412</td>は<td>、滅菌フィルターチップ付きP200ピペットと呼ばれています&nbsp;ヒント</td></tr><tr><td>4スターストレートストロングミディアムポイントピンセット&nbsp;</td><td>エクセルタ&nbsp;</td><td>00-SA-DC</td> は<td>、長い鉗子</td></tr><tr><td>96 ウェル PCR ラック 蓋付き アソート、5 ラック/ユニット</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>27-202A</td><td>は、PCR ラック</td></tr><tr><td>アンドウィン サイエンティフィック&nbsp;3M鉛フリーオートクレーブテープ1"</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>NC0802040</td><td>オートクレーブテープと呼ばれます&nbsp;</td></tr><tr><td>オートクレーブテープ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB1170</td><td>PCRプレートシール</td></tr><tr><td>ベンチリング v8</td><td>ベンチリング</td><td>N/A</td><td>ベンチリング&nbsp;</td></tr><tr><td>BioRadHard-Shell 96ウェルPCRプレート</td><td>BioRad&nbsp;</td><td>HSS9641</td><td>PCRプレート&nbsp;</td></tr><tr><td>BULWARK FRラボコート:&nbsp;</td><td>グレインジャー&nbsp;</td><td>26CF64</td><td>は Lab Coat</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad Thermocycler と呼ばれています&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1851148</td><td>Thermocycler&nbsp;</td></tr><tr><td>C1000 Touch Bio-rad サーモサイクラー (CFX 光学モジュール搭載) &nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1845097</td><td>qPCR サーモサイクラー&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロコッカス・ヒプノスポラム.&nbsp;&nbsp;</td><td>カロライナ</td><td>152091</td><td>藻</td></tr>類コーニングとして参照されています<tr><td>&nbsp;PYREX再利用可能なメディア収納ボトルサー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-414-1E</td>は<td>、2 Lオートクレーブ対応ガラスボトル</td></tr><tr><td>Daigger&として参照会社概要 Vortex-Genie 2 ラボラトリーミキサー&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>3030A</td><td>はボルテクサーと呼ばれています&nbsp;</td></tr><tr><td>Direct-zolマイクロプレップ&nbsp;</td><td>ザイモリサーチ&nbsp;</td><td>R2060</td><td>RNA抽出キット&nbsp;</td></tr><tr><td>デュモン5生物学ピンセット</td><td>ファインサイエンスツール&nbsp;</td><td>11254-20</td><td>ファイン鉗子</td></tr><tr><td>EDTAと呼ばれる&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S311-500&nbsp;</td><td>EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>フィジー v 2.14.0/1.54f&nbsp;</td><td>ImageJ,N</td><td>/A</td><td>はFIJI/ピ</td></tr><tr><td>ペットプーラー用ImageJフィラメント&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>PC-10H</td> は<td>フィラメント フィラメント</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド エコノミー インパクト ゴーグル</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>19-181-501</td> ス<td>プラッシュ ゴーグルとして参照&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスマイクロピペット外径1mm 内径0.58、長さ10cm</td><td>TriTech Research</td><td>GD-1&nbsp;</td><td>ガラスマイクロピペットとして参照</td></tr><tr><td>Hypsibius exemplaris Z151株&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>133960</td><td>クマムシ&nbsp; または H. exemplaris&nbsp;</td></tr><tr><td>液体窒素デュワー 1 L</td><td>寒天型 サイエンティフィック&nbsp;</td><td>AGB7475</td><td>クライオセーフコンテナ&nbsp;</td></tr><tr><td>Maxima H Minus First Strand cDNA合成キット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K1651</td>は<td>cDNA合成マスターミックスと呼ばれています&nbsp;</td></tr><tr><td>ナリシゲ 2段ガラスマイクロピペットプーラー&nbsp;</td><td>トライテックリサーチ</td><td>&nbsp;PC-10</td><td>はマイクロピペットプーラーと呼ばれています&nbsp;</td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>17-000-314</td><td>ニトリル手袋&nbsp;</td></tr><tr><td>ペトリ皿、PS、35/10 mm、ベント付き</td><td>Grenier</td><td>627102</td><td>35 mmペトリ皿&nbsp;</td></tr><tr><td>ピペットマンP10、1&ndash;10 &micro;L、金属エジェクター</td><td>ギルソン</td><td>F144055M</td><td>P 10ピペット</td></tr><tr><td>PIPETMAN P1000、100&ndashと呼ばれる。1000 &マイクロ;L、金属エジェクター</td><td>ギルソン</td><td>F144059M</td><td>P 1000ピペット</td></tr><tr><td>PIPETMAN P200、20&ndashと呼ばれる。200 &micro;L、金属エジェクター</td><td>ギルソン&nbsp;</td><td>F144058M</td>、この4色モデリングクレイを<td>P 200ピペットポンドと呼んでいます</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>アメリカの科学の余剰</td><td>&nbsp;96517P001</td><td>クレイ&nbsp;</td></tr><tr><td>プリズム v10.0&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td>はプリズムを参照しています&nbsp;</td></tr><tr><td>RNAseフリー、キャップ付き8ストリップ0.2 mL PCRチューブ&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM12230</td>、<td>滅菌PCRチューブ</td></tr><tr><td>RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>Promegaと呼ばれています&nbsp;</td><td>N2111</td><td>RNAse阻害剤として参照&nbsp;</td></tr><tr><td>湧き水&nbsp;</td><td>ネスレピュアライフ</td><td>44221229</td><td>、湧き水として参照</td></tr>されます <tr><td>SsoAdvanced Universal SYBRグリーンスーパーミックス</td><td>BIO RAD</td><td>1725271</td><td>、インジケーター染料スーパーミックスとして参照されます&nbsp;</td></tr><tr><td>実体顕微鏡システム 光学・照明付&nbsp;</td><td>TriTech Research</td><td>SMT1</td>は、<td>解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>Supertek Scientificと呼ばれています&nbsp;ティリルバーナー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S09572B</td><td>ブンゼンバーナーと呼ばれる&nbsp;</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Qualitron</td><td>&nbsp;DW-41-115-NEW</td>は<td>テーブルトップ遠心分離機と呼ばれています&nbsp;</td></tr><tr><td>テンプシールド&nbsp;クライオグローブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-394-305</td><td>クライオグローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;Nunc Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-757-099</td><td>100 mm Petri Dish&nbsp;</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T395-500&nbsp;</td><td>トリスまたはトリスベース&nbsp;</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>フルカ&nbsp;</td><td>93443</td><td>洗剤1&nbsp;</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P1379-500&nbsp;</td><td>洗剤2として参照</td></tr><tr><td>水 - PCR/RT-PCR 認証、ヌクレアーゼフリー</td>の <td>Growcells</td><td>PCPW-0500</td> は<td>、無菌ヌクレアーゼフリー水と呼ばれています。</td></tr></tbody></table>

クマムシhypsibius exemplarisにおけるqrt-pcrによる相対転写レベルの比較のための単一動物、単一チューブrna抽出

Single-Animal, Single-Tube RNA Extraction for Comparison of Relative Transcript Levels via qRT-PCR in the Tardigrade Hypsibius exemplaris

一本鎖RNA抽出法の開発と最適化 クマムシのRNA抽出に関するLy et al., 201542 のプロトコルを適応させると、STSTシステムは調製物の量と質を最大化するように最適化されています(図1A)。アクチン転写産物に対してRT-PCRを行い、エクソン1およびエクソン2にまたがる527 bp領域を増幅することにより転写産物の収量を定量化しました(これらのプライマーの配列は 表1に記載されています)。予想されるアクチンバンドの光学密度を、ImageJ/FIJIを用いて蛍光強度として定量化しました。定量化された関心領域はすべて、各ゲル全体で同じ面サイズでした。
まず、クマムシのキューティクルを破壊するために必要な機械的溶解の方法を評価しました。C. elegans42について記載された単一動物によるRNA抽出プロトコルでは、プロテイナー...

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single-animal-single-tube-rna-extraction-for-comparison-relative

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