Name: 感作蛍光フェルスター共鳴エネルギー移動(SE-FRET)を使用したロイシンリッチリピート含有8チャネル(LRRC8/VRAC)活性のモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ感作蛍光FRETを用いたLRRC8/VRACチャネル活性のモニタリング法。HeLa細胞での浸透圧刺激応答をリアルタイム観察し、細胞生理学的メカニズムの解明に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>電気生理学なしでLRRC8チャネル活動を監視するためのFRETベースの方法

ロイシンリッチリピート含有8(LRRC8)ファミリータンパク質のヘテロマーからなるイオンチャネルは、脊椎動物細胞全体に見られ、幅広い生理機能に関与しています1,2。これらのLRRC8チャネルは、最初に体積調節陰イオンチャネル(VRAC)または体積感受性外向き整流チャネル(VSOR)として識別され、細胞の体積減少に重要な役割を果たします3,4。それらは塩化物イオンと有機浸透圧の排出を促進し、その後、浸透圧の膨潤に応答して水が流出します。浸透圧ストレス応答におけるそれらの役割を超えて、細胞体積調節におけるそれらの役割は、細胞の増殖と移動、アポトーシス、精子形成、および上皮の完全性に関連しています5,6,7。LRRC8/VRAC活性化による膜電位の変化は、筋管の分化8および膵臓β細胞9,10,11によるインスリン分泌に寄与することが示されている。さらに、LRRC8チャネルは、プリン作動性シグナル伝達分子ATPおよびcGAMPまたは興奮性アミノ酸グルタミン酸などの種々の有機浸透圧を伝導し、これらのチャネルを免疫系またはグリアニューロン相互作用における細胞間コミュニケーションに配置する12,13,14,15,16,17,18,19,20、21,22.染料フルオレセイン、抗生物質ブラストシジンS、または抗がん剤シスプラチンなどの生体異物でさえ、LRRC8チャネル23,24,25によって行われます。
LRRC8/VRACの活性化につながるシグナル伝達については、多数の報告があります26,27,28。しかし、そのメカニズムは依然として不明であり、文献では、特定の生理学的プロセスに依存する可能性のある幅広い潜在的なメカニズムが示されています。これらには、細胞質イオン強度、細胞骨格との相互作用、膜組成、Gタンパク質、酸化還元状態、およびリン酸化カスケード2,27,29,30,31の変化が含まれます。
LRRC8/VRACチャネルは、LRRC8Aを必須サブユニット3,4として含み、生理学的に機能的なチャネル4,14,32を形成するためには、そのパラローグLRRC8B-Eの少なくとも1つとヘテロマー化しなければならない。サブユニット組成は、整流および脱分極依存性の不活性化4,29,32,33,34、基質特異性15,17,20,21,24,35、およびいくつかの活性化経路36,37などのチャネルの生物物理学的特性を決定する.クライオ電子顕微鏡(クライオ電子顕微鏡)の構造は、LRRC8Aホモマーおよびヘテロマーがヘキサマーとして集合することを示している38,39,40、一方、機能チャネルを形成するLRRC8A/LRRC8Cキメラはヘプタマー41である。すべてのLRRC8タンパク質のN末端部分は4つの膜貫通ヘリックスを含み、C末端部分はロイシンリッチリピート(LRRD)を持つドメインを含んでいます。利用可能なLRRC8複合体構造は、細胞質3,4,23に伸びるLRRDが、チャネルゲーティング34,42,43の間にコンフォメーション再配列を受ける可能性があるという証拠を提供します。この考えは、蛍光タンパク質のC末端融合が基礎チャネル活性をもたらすという知見14、およびドメインへのナノボディの結合がチャネル活性を調節できるという知見によって裏付けられている44。さらに、C末端の立体配座変化は、複合体内フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)45によって示された。
イオンチャネル活性を研究する最も一般的な方法は、電気生理学的測定46であり、これは分子同定47の前にVRACの研究に広く適用された。ただし、VRACの活動を間接的に監視するには、伝導性基質(ハロゲン化物イオンまたは有機浸透圧)の測定や細胞体積への影響の測定など、さまざまな追加の方法があります48。実際、LRRC8タンパク質のVRACとしての同定は、活性化されたVRAC3,4を介して細胞に侵入するヨウ化物によるハロゲン化物感受性蛍光タンパク質49の消光に基づくアッセイに依存していた。LRRC8/VRACチャネル活性をモニターする別の方法は、他のイオンチャネル50,51,52,53と同様に、FRET45の変化によって観察できる細胞質ドメインの動きを利用する。そのために、ドナーとしてシアン蛍光タンパク質(CFP)/mCerulean3、受容体として黄色蛍光タンパク質(YFP)/mVenusなど、FRETペアとして機能する蛍光タンパク質をLRRC8タンパク質のC末端に融合させました(図1)。LRRC8サブユニット間の複合体内FRETは、アクセプター光退色実験45によって示された。破壊的な光退色法を避けて、FRETの経時変化を感作発光FRET(SE-FRET)によって監視し、基本的にはドナーの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルとの重なりによるドナーの励起時のアクセプターの増感放出を測定しました。LRRC8/VRAC 活性化の刺激である細胞外低張性の適用により、SE-FRET強度が可逆的に減少した45。重要なことに、低張治療中の全細胞パッチクランプ測定とFRETモニタリングの同時実施により、FRETのこの減少は実際にLRRC8/VRAC活性化を反映していることが示された45。この方法は、ピペット溶液による原形質膜の破壊や細胞内環境の変化を回避し、LRRC8/VRAC活性をモニタリングするための代替手段を提供します。これは、天然のサイトゾルを維持することが重要である、細胞内分解能が必要な場合、またはチャネル活性の長期観察が必要な生理学的環境で特に有用です。
ここでは、このようなFRETベースの読み出しを使用してLRRC8 / VRACを研究するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、細胞の取り扱いとトランスフェクション、サンプル画像と制御画像の取得、データの分析、および感作蛍光FRET(SE-FRET)値の計算方法を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig01v2.jpg"> 
図1:LRRC8 FRETペアシステムの概略図。 mCerulean3はシアン、mVenusは黄色で示されています。VRACが開くと、蛍光色素間の距離(および/または空間的配向)が変化し、ドナー(Don)とアクセプター(Acc)の間のエネルギー伝達が減少し、その結果、観察されたFRETが低下します。BioRender.com で作成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>カメラ DFC9000GTC</td><td>ライカ</td><td>11547007</td><td></td></tr><tr><td>CFP-18AAA-YFP</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elder et al. 2009 PMCID: PMC2706461;C.F. Kaminski(ケンブリッジ大学、英国)からの贈り物シ</td></tr><tr><td>クロヘキシミド(CHX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66-81-9</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Medium)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffer Saline)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>エミッションフィルターホイール (460/80, 535/70, 590/50, 642/80, 100%)</td> <td>ライカ</td><td>11525480</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清)</td><td>PAN-Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>フィルターキューブ CYR71010</td><td>ライカ</td><td>11525416</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>グラスボトムカルチャーディッシュ 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa細胞</td><td>ライプニッツ研究院 DSMZ</td><td>ACC 57</td><td>哺乳類子宮頸がん/ ライプニッツ研究院 DSMZ</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>カール・ロス</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>同上 &micro;-Disch 35 mm</td><td>同上</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>KCl (塩化カリウム)</td> <td>カール・ロス</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>LAS X FRET ウィザード</td><td>ライカ</td><td></td><td></td>11640862</tr><tr><td>光源 LED8</td><td>ライカ</td><td>11504256</td><td></td></tr><tr><td>LRRC8A-mCerulean3</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml;nig et al. 2019</td></tr><tr><td>LRRC8E-mVenus</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>K&ouml;nig et al. 2019</td></tr><tr><td>Luna-II Automated Cell Counter</td><td>logos biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Luna-II Cell Counter Slides</td><td>logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (塩化マグネシウム)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope THUNDER Imager live cell</td><td>Leica</td><td>11525681</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (塩化ナトリウム)</td><td>Carl Roth</td><td>9263</td><td></td></tr><tr><td>Objective HC PL APO 63x/1.40 OIL</td><td>Leica</td><td>11506349</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Minimal Essential Medium (MEM)</td><td>gibco</td><td>11058</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer OM807</td><td>Vogel</td><td>V04807</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Step)</td><td>gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>腫瘍壊死因子(TNF)-A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94948-59-1</td><td></td></tr><tr><td>弁制御重力灌流システム</td><td>ALAサイエンティフィックインスツルメンツ</td><td>VC3-4xG</td><td></td></tr></tbody></table>

感作蛍光フェルスター共鳴エネルギー移動(se-fret)を使用したロイシンリッチリピート含有8チャネル(lrrc8/vrac)活性のモニタリング

Monitoring Leucine-Rich Repeat Containing 8 Channel (LRRC8/VRAC) Activity Using Sensitized-Emission F&#246;rster Resonance Energy Transfer (SE-FRET)

このFRETベースの方法では、浸透圧刺激中にLRRC8 / VRAC活性を監視でき、SE-FRETの減少は細胞外低張性の程度と相関しています45。低張性誘発性チャネル活性化の代表的な結果もここに示します(図3 および 図4)。さらに、ジアシルグリセロールシグナル伝達の操作45 や筋細胞活性化56などの異なるアイソスモティック刺激によるLRRC8/VRACの活性化が観察され得る。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig04.jpg"> 
図4:SE-FRETトレース (A)5つの独立した実験からの見かけのSE-FRETトレース。データは、視野 (FOV) あたり N = 2 から N = 7 セルの平均 ± SD を表します。(B)全細胞の平均±SD値(N=31細胞)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
LRRC8/VRACチャネルはアポトーシス量の減少にも関与しているため24,57、アポトーシス誘導時のチャネル活性の観察は、ここで説明する方法の別のアプリケーションになります。そこで、LRRC8A-mCerulean3およびLRRC8E-mVenusを発現するHeLa細胞におけるSE-FRETのモニタリングプロトコールを、デスレセプター介在性アポトーシス誘導薬を適用しながら実施しました。腫瘍壊死因子(TNF)-αおよびシクロヘキシミド(CHX)は、数分以内にVRAC電流を誘発することが以前に示されていた58。2 ng/mL の TNF-α と 1 μg/mL の CHX を等張バッファーに添加すると、SE-FRETが強く減少しました(図 5)。TNF-αおよびCHXを含んでいるにもかかわらず、バッファーを高張媒体に置き換えると、SE-FRET値はベースライン近くに回復し(図5A)、アポトーシス誘導Fasリガンド58による治療中の高張性浴溶液中のVRAC電流の減少に対応する。TNF-αおよびCHXの溶媒であるDMSOで細胞を処理しても、SE-FRETの減少は得られませんでした。TNF-α + CHXは、FRET制御59としてEYFPとECFPのタンデム構造であるCFP-18aa-YFPのSE-FRETに影響を与えず、LRRC8 / VRACの特異性を示しています(図5B)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66953/66953fig05v2.jpg"> 
図5:死受容体媒介性アポトーシスによるアイソスモーティックVRAC活性化 (A)LRRC8A-mCer/LRRC8E-mVen発現HeLa細胞(n = 8皿、23細胞)の経時的な正規化されたSE-FRET値。等張イメージングバッファー(ベースライン)で15サイクル後、浴溶液を2 ng/mL TNF-αと1 μg/mLシクロヘキシミド(CHX)を30サイクル補給した等張バッファーに置き換え、続いてTNF-αとCHXを含む20サイクルの高張イメージングバッファーを補充しました。各 ROI と時点の生の平均 SE-FRET値は、それぞれの ROI のベースライン (等張) 値の平均に正規化されました。(B)LRRC8A/Eを発現するHeLa細胞をAのようにDMSOを含む等張液をCHXのビヒクル制御として使用した場合(n = 5皿、12細胞)、またはAのようにアポトーシス誘導剤を含む等張緩衝液(n = 8皿、23細胞)、またはアポトーシス誘導剤を使用してCFP-18aa-YFPを発現するHeLa細胞(n = 3皿、9細胞)の正規化SE-FRET値の定量化。データは、個々のセル(シンボル)のそれぞれのバッファ内の最後の10の時点の平均と、SD±すべてのセルの平均を表します。** p &lt; 0.01 通常の一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較の事後検定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66953/66953fig05largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

感作蛍光フェルスター共鳴エネルギー移動(SE-FRET)を使用したロイシンリッチリピート含有8チャネル(LRRC8/VRAC)活性のモニタリング

Members of the LRRC8 protein family form heteromeric ion and osmolyte channels with roles in numerous physiological processes. As volume-regulated anion ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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