Name: 虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 40 s
Description: 学ぶAAVシステムを用いた虚血性脳卒中後のNeurod1異所性発現とマウスモデルにおける神経再生メカニズム。この手法は運動機能回復と神経細胞再プログラミングの相関を評価し、脳卒中治療戦略の最適化に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>脳卒中後の異所性Neurod1発現を研究するためのAAVシステムとマウスモデル

<ol><li>GBD 2016 Stroke Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+burden+of+stroke%2C+1990-2016%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016.</a> Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).</li>
<li>Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+stroke%3A+Mechanisms%2C+modulation%2C+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential.</a> J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).</li>
<li>Kuriakose, D., Xiao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+treatment+of+stroke%3A+Present+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).</li>
<li>Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+degeneration+of+neurons+in+the+penumbra+region+following+a+small%2C+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke.</a> Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).</li>
<li>Burda, J. E., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+gliosis+and+the+multicellular+response+to+CNS+damage+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease.</a> Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).</li>
<li>Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelin-1+and+endothelin+receptor+antagonists+in+inflammatory+response+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+scar+is+more+than+just+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The glial scar is more than just astrocytes.</a> Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+reactive+astrogliosis+and+glial+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation.</a> Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).</li>
<li>Adams, K. L., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+and+disparity+of+the+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The diversity and disparity of the glial scar.</a> Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).</li>
<li>Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+overview+of+neuroinflammation+in+an+experimental+mouse+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model.</a> Sci Rep. 9 (1), 507(2019).</li>
<li>Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Bridging+the+gap+between+basic+science+and+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).</li>
<li>Berninger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+neurons+derived+from+in+vitro+reprogrammed+postnatal+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia.</a> J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurod1+aav-based+gene+therapy+for+functional+brain+repair+after+ischemic+injury+through+in+vivo+astrocyte-to-neuron+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion.</a> Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).</li>
<li>Ghazale, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascl1+phospho-site+mutations+enhance+neuronal+conversion+of+adult+cortical+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo.</a> Front Neurosci. 16, 917071(2022).</li>
<li>Wang, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+astrocyte+to+neuron+conversion+with+lineage+tracing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo.</a> Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).</li>
<li>Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aav+tools+fail+to+detect+neurod1-mediated+neuronal+conversion+of+muller+glia+and+astrocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo.</a> EBioMedicine. 90, 104531(2023).</li>
<li>Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+neuronal+reprogramming%3A+Fast+forward+from+new+concepts+toward+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches.</a> Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promise+for+neuronal+repair%3A+Reprogramming+astrocytes+into+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo.</a> Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).</li>
<li>Hickmott, J. W., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia-to-neuron+reprogramming+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Glia-to-neuron reprogramming to the rescue.</a> Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).</li>
<li>Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+reactive+glia+into+iPSCs+to+produce+new+neurons+in+the+cortex+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 22490(2016).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+direct+reprogramming+of+reactive+glial+cells+into+functional+neurons+after+brain+injury+and+in+an+alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).</li>
<li>Livingston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+neurod1+is+sufficient+for+functional+recovery+following+a+sensory-motor+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke.</a> Biomedicines. 12 (3), 663(2024).</li>
<li>Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+through+in+vivo+cell+fate+reprogramming+for+neural+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair.</a> Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+conversion+of+striatal+astrocytes+into+gabaergic+neurons+in+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).</li>
<li>Roome, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+endothelin-1+model+of+forelimb+motor+cortex+stroke+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse.</a> J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).</li>
<li>Islam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+in+a+model+of+ischemic+stroke+leads+to+enhanced+cell+survival%2C+endogenous+neural+precursor+cell+activation+and+improved+functional+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes.</a> Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).</li>
<li>Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+post-stroke+behavior+in+mouse+models+of+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).</li>
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<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).</li>
<li>Jiang, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+reactive+astrocytes+to+induced+neurons+enhances+neuronal+repair+and+functional+recovery+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke.</a> Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), e76310(2013).</li>
<li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+specificity+of+GFAP+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Expression specificity of GFAP transgenes.</a> Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).</li>
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<li>Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+astrocyte+subtypes+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain.</a> Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).</li>
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<li>Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+Impact+to+brain+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease.</a> Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).</li>
<li>Miller, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system.</a> Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).</li>
<li>Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+advanced+age+upon+astrocyte-specific+responses+to+acute+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).</li>
<li>Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tamoxifen-induced+cre+activity+and+its+effect+on+immune+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations.</a> Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).</li>
<li>Gresita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+low+efficiency+of+direct+reprogramming+of+astrocytes+into+neurons+in+the+brains+of+young+and+aged+mice+after+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia.</a> Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#77ドリルビット(.018")</td><td>David Kopf Instruments</td><td>8177</td><td></td></tr><tr><td>AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCre</td><td>ベクトル&nbsp;Biolabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorbable Suture with Needle Polysorb&trade(針ポリソーブ&貿易付き吸収性縫合糸);ポリエステル CV-15 3/8 サークル テーパー ポイント ニードル サイズ 4 - 0 編組</td><td>Covidien</td><td>GL-881</td><td></td></tr><tr><td>抗 NeuN 抗体 (ウサギ)&nbsp;</td><td>ミリポアシグマ</td><td>ABN78&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>チャールズ リバー</td><td>027</td><td></td></tr><tr><td>クロルヘキシジン溶液</td><td>Partnar</td><td>PCH-020</td><td></td></tr><tr><td>Contec&trade;&nbsp;PREempt&trade;RTU消毒液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>29-636-6212</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>HM525 NX&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エンドセリン1</td><td>ミリポアシグマ</td><td>05-23-3800-0.5MG</td><td></td></tr><tr><td>フェザーセーフティカミソリミクロトームブレードフェ</td><td></td><td>ザー12-631P</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;カバーグラス:長方形フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実装用メディウム</td><td>Agilent Technologies</td><td>S3023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ</td><td>ハミルトン カンパニー</td><td>7634-01</td><td></td></tr><tr><td>高速固定装置ドリル</td><td>デビッド・コップフ・インスツルメンツ</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>メタカム・ソリューション (メロキシカム)</td><td>ベーリンガー・インゲルハイム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.C.T コンパウンド</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>pAAV2/5-GFAP-iCre</td><td>ベクター・ビルダー</td><td>P190924-1001suq</td><td></td></tr><tr><td>ポリダーム軟膏USP</td><td>タロ</td>ウ<td>2181908</td><td></td></tr><tr><td>ソムニサイエンティフィック&trade;&nbsp;動物温度加熱パッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>04-777-177</td><td></td></tr><tr><td>固定装置</td>デ<td>ビッド・コップフ インスツルメンツ</td><td>モデル902</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド、白い</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>tdTomato レポーター マウス&nbsp;</td><td>ジャクソン研究所</td><td>007914</td><td></td></tr><tr><td>V-1卓上実験動物麻酔システム</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr></tbody></table>

虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるneurod1の異所性発現を調査するためのaavシステムとマウスモデル

AAV Systems and Mouse Models for Investigating Ectopic Expression of Neurod1 in Transduced Cells at Subacute and Chronic Times Post-Ischemic Stroke

野生型(C57BL/6J)およびトランスジェニックtdTom-Creレポーター株(具体的にはB6.ET-1脳卒中傷マウスには、Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 2つのAAV5ベースのシステムが使用されました(図1A-C)。脳卒中の亜急性モデルでは、Neurod1をCre-Flex AAVシステムにパッケージ化し、脳卒中後7日目に野生型マウスに送達しました(図1B)。2番目のFlexベクターには、ヘテロタイプの逆平行loxP型組換え部位に隣接するCAGプロモーターによって駆動されるGFPの逆配列が含まれています(図1B)。両方のウイルスコンストラクトは、脳卒中後に同時に注射されます。形質導入細胞でCreが発現すると、GFPは反転して組換え部位で切除され、配列がセンス方向に向けられるため、GFPの発現が可能になります。したがって、Creを発現する細胞はGFP陽性となり、Cre-Flexベクターによって形質導入されたことを示します。亜急性モデルでは、形質導入後21日(すなわち、脳卒中後28日)にマウスを屠殺し、脳卒中損傷脳の実質において、形質導入細胞(GFP+)の数とNeuN+GFP+(NeuNを発現する形質導入細胞)細胞の数をカウントしました。図2Aに見られるように、ニューロンは虚血性損傷の部位で失われます。Cre-Flex AAVシステムを使用した亜急性パラダイムにおける形質導入細胞の定量化は、Stroke-Cre対照マウスと比較して、Neurod1治療マウスの有意に多くの標識ニューロン(NeuN + GFP + / GFP +細胞)を明らかにします(43.05 +/- 5.50%対18.43 +/- 3.03% NeuN + GFP + / GFP +細胞、Stroke-Neurod1対。Stroke-Cre(対照)処理マウス、それぞれ)(p = 0.0172)(図2B、C)。
別の一連の実験では、脳卒中の慢性モデルでAtN変換が行われました(図1B、C)。転写因子 Neurod1 は、脳卒中後21日目にET-1脳卒中傷害tdTom-Creレポーターマウスに送達されました(図1C)。野生型マウスに用いられたCre-Flexシステムと同様に、 Neurod1 の発現は短鎖GFAPプロモーターによって駆動されました。しかし、このシステムでは、 Neurod1 に続くCreリコンビナーゼとともに単一のAAVコンストラクトが使用されました(図1B)。したがって、GFAP発現細胞はCreリコンビナーゼを産生し、AAV形質導入された細胞を示すtdTomレポーターを誘導します。マウスは脳卒中後77日(AAV後8週間)に屠殺されました(図1C)。 図3Aに見られるように、tdTom-Creマウスでは脳卒中後77日目に皮質病変が観察されます。ニューロンマーカーであるNeuN+を発現する形質導入細胞の数を定量化し(脳卒中後の慢性期における(NeuN+tdTom+/tdTom+細胞の相対割合))、Stroke-Neurod1 を投与されたマウスは、Stroke-Cre 対照マウスと比較して有意に多くの標識ニューロンを有することを発見しました(74.81 +/- 4.835% vs. 53.05 +/- 5.028% NeuN+tdTom+/tdTom+ cells.Stroke-Cre (対照)処理マウス、それぞれ)(p = 0.0355)(図3B、C)。
全体として、この結果は、野生型およびtdTom-Creレポーターマウスの亜急性期および慢性脳卒中後期の両方で、ニューロンのベースライン形質導入と、 Neurod1 送達を伴うNeuN+を発現する形質導入細胞の数が多いことを実証しています。これは、2つの異なるAAVベースのシステムを用いています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig01.jpg"> 
図1: Neurod1、ベクトル、およびタイムラインの異所性発現 (A)マウス運動皮質へのエンドセリン-1(ET-1)注入による脳卒中誘発のグラフ表現。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ET-1注射部位と病変の周囲、前方および後部1mmの3つの部位に送達されます。運動皮質にAAV-Neurod1 を導入された細胞を示す拡大パネル。(B)野生型マウスに送達されたCre-Flexシステムの2つのAAVベクターの概略図(上面)。AAV5ベクター1には、短いGFAPプロモーター、 Neurod1 転写因子、およびloxP部位(黒の三角形)とlox2272部位(白の三角形)に挟まれたCreリコンビナーゼ配列が含まれています。AAV5ベクター2は、loxPおよびlox2272サイトのペアに隣接する逆GFP遺伝子レポーター配列を運びます。細胞内で両方のベクターを形質導入すると、Creを介した切除と逆転が起こり、形質導入細胞を標識するためのGFP発現が可能になります。 Neurod1 は、1つのAAV5ベクターを使用してtdTom-Creマウスにも導入されました(下パネル)。AAV5ベクター1では、短いGFAPプロモーター、 Neurod1 転写因子、およびCreリコンビナーゼ配列がパッケージ化されています。形質導入細胞におけるCreの発現は、loxP部位(黒色の三角形)のStopコドンの切除を促進し、tdTomatoの発現を可能にします。(C)Cre-Flexシステムは、脳卒中後の亜急性期(脳卒中後7日目)にAAVを注射した野生型マウスでテストされました。野生型マウスは、AAV形質導入の21日後(脳卒中後28日)に屠殺されました。脳卒中後の慢性期(Post-Stroke Day 21)にtdTom-CreマウスにAAVを送達し、AAV形質導入後56日(脳卒中後77日)にマウスを屠殺しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig02v4.jpg"> 
図2:脳卒中後の亜急性期にCre-Flex AAVを使用した異所性Neurod1送達は、NeuNを発現する形質導入細胞の数の増加につながります。 (A)脳卒中後28日目に運動皮質を介した冠状脳切片の免疫染色をStroke-Creコントロール(左)およびStroke-Neurod1(右)マウスから。病変の部位にニューロンの喪失が観察されます(白い破線)。皮質には、形質導入細胞(GFP+、緑)、ニューロン(NeuN+、赤)、および共局在するNeuN+GFP+(オレンジ)細胞が見られます。スケールバー:250μm.(B)ニューロン(NeuN+、赤)とAAV形質導入GFP+(緑)を示すStroke-Creコントロール(上)とStroke-Neurod1(下)の脳組織の代表的な画像。白で縁取られたインセットは、各チャネルのセルのクローズアップを示しています。白い矢印はAAV形質導入細胞(GFP+)を示します。白い矢印は共局在したNeuN+GFP+細胞を示しています。スケールバー:125 μm. (C) Stroke-CreおよびStroke-Neurod1マウスにおけるNeuN+GFP+/GFP+細胞の定量。N = グループあたり3匹のマウス。データは、平均± SEM. Shapiro-Wilk Test (p = 0.3223) で表されます。対応のないt検定、*p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66965/66965fig03.jpg"> 
図3:脳卒中後の慢性期におけるtdTom-Creレポーターマウスへの異所性 Neurod1 の送達は、NeuNを発現する形質導入細胞の数の増加につながります。 (A)脳卒中後77日目の運動皮質を介した冠状脳切片の免疫染色 脳卒中-Cre コントロールおよび脳卒中-Neurod1 マウスによる。虚血性損傷部位(白い破線)にニューロンの喪失が見られます。形質導入細胞は、梗塞周囲でtdTom(赤)で標識されます。NeuN+tdTom+(オレンジ色)は、神経細胞マーカーを発現する形質導入細胞です。スケールバー:250μm.(B)ニューロン(NeuN+、緑)とAAV形質導入細胞(tdTom+、赤)を示すStroke-Cre コントロール(上)とStroke-Neurod1 (下)の脳組織の代表的な画像。白で縁取られたインセットは、各チャネルのセルのクローズアップを示しています。白い矢印はAAV形質導入細胞(tdTom+)を示します。白い矢印は共局在したNeuN+tdTom+細胞を示しています。スケールバー:125μm.(C)慢性パラダイムにおけるNeuN+tdTom+/tdTom+細胞の定量は、 Neurod1 処理マウスにおいてNeuN+(NeuN+tdTom+/tdTom+細胞)を発現する形質導入細胞が有意に多いことを示しています。N = グループあたり3匹のマウス。データは平均±SEMで表されます。 Shapiro-Wilk Test(p = 0.2044)。対応のない t検定、*p &lt; 0.05。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66965/66965fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル

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