虚血性脳卒中後の亜急性および慢性の時期に形質導入細胞におけるNeurod1の異所性発現を調査するためのAAVシステムとマウスモデル
2024年11月29日
このプロトコルは、皮質虚血性脳卒中後のNeurod1のウイルス媒介性異所性発現を説明しています。Neurod1は、(1)脳卒中後の亜急性期(7日間)に野生型マウスにCre-Flex AAVシステムを使用して、(2)脳卒中後の慢性期(21日間)に条件付きレポーターマウスに単一のAAVベクターを使用して送達されます。
私たちは、虚血性脳卒中の潜在的な治療法として、神経原性転写因子のAAV媒介性異所性発現を調査しています。私たちの焦点は、脳卒中後の亜急性期および慢性期にGFAP発現細胞におけるNeurod1の発現が、形質導入されたニューロンを増加させ、運動機能の改善と相関しているかどうかを確認することです。最近の知見は、皮質における遺伝子発現が同じAAVを持つ領域によって異なることを示している 私たちの研究では、GFAPプロモーターは運動皮質よりも内側前頭前皮質でより活性が高いことを発見し、形質導入された細胞が特定のプロモーターに対して異なる反応を示すことが示されました。
したがって、神経原性転写因子を含む治療法は、標的となる脳領域に合わせて調整する必要があります。現在の課題には、ET-1の注射速度や脳領域間の形質導入効率などの変数による脳卒中病変のサイズの変動が含まれます。脳領域やマウス系統にわたるAAV力価と親和性は、形質導入効率に影響を及ぼし、脳卒中後の異所性Neurod1発現の細胞評価に影響を与える可能性がある。
アストロサイトをニューロンに変換する際の主な課題は、再プログラムされたニューロンを既存のニューロンと区別することです。当研究室では、このリプログラミングが生体内で起こることを、新しいツールの開発により確認することを目指しています。最終的には、脳損傷動物のニューロン転写因子の異所性発現がどのように回復を促進するかを理解しようとしています。
まず、麻酔をかけた動物をチャンバーから取り出し、清潔な表面に置きます。マウスの手術部位を清掃した後、マウスの鼻を脳定位固定装置のノーズコーンに置き、イヤーバーを使用して頭蓋骨を安定させます。10番のメスの刃を使用して、目の中点の後ろから頭頂骨まで矢状面に平行に垂直に切開します。
次に、皮膚をそっと引っ込めて頭蓋骨を露出させます。次に、Qチップを使用して頭蓋骨の筋膜を乱し、頭蓋骨を乾かしてブレグマを完全に露出させます。高速定位固定装置ドリルを使用して、右感覚運動野の座標に3つのバリ穴を開けます。
次に、ドリルを長さ26インチの針を備えた0.375ゲージのシリンジと交換します。滅菌PBSに溶解した400マイクロモルのエンドセリン-1溶液1.5マイクロリットルをシリンジにロードします。少量のエンドセリン-1を放出して針の先端に滴を観察し、良好な流れを確保します。
針の先端を頭蓋骨を過ぎて、硬膜に穴を開けずに中央のバリ穴に下げます。位置が揃ったら、針を脳の1ミリメートル下に下げます。ハミルトンシリンジを使用して、一度に0.1マイクロリットルを分配し、次の0.1マイクロリットルを注入する前に1分間待ちます。
注射間および注射後に針が詰まるのを防ぐために、針の先端に滴が現れるまで少量のエンドセリン-1を放出します。.滅菌済みのQチップを使用して、注射前に余分なエンドセリン-1を拭き取ります。最後に、4-0滅菌縫合糸を使用して頭蓋骨の上にある皮膚を縫合し、傷を閉じます。
エンドセリン-1で処理したマウスに麻酔をかけた後、マウスを定位固定装置フレームに移します。手術用ハサミを使用して、傷口の縫合糸を切断します。鉗子でかさぶたを取り除き、皮膚を引っ込めて頭蓋骨を露出させます。
次に、滅菌済みのQチップを使用して頭蓋骨の表面を乾燥させ、バリ穴を見つけます。脳定位固定装置のマニピュレーターアームをセットします。長さ26インチの針が付いた0.375ゲージの注射器を運ぶニードルホルダーを置きます。
次に、3.4マイクロリットルのAAV溶液をシリンジにロードします。針の先端を頭蓋骨を過ぎて、最初の最も前方のバリ穴に下げます。針が硬膜に穴を開けないようにしてから、脳の1ミリメートルで下げます。
ハミルトンシリンジを使用して、前に示したように一度に0.1マイクロリットルを分注することにより、1マイクロリットルのAAV溶液を注入します。.次に、頭蓋骨の上にある皮膚を縫合し、4-0 Polysorb ポリエステル縫合糸を使用して傷を閉じます。マウスを定位固定装置フレームから取り外し、回復エリアの清潔で予熱された動物用ケージに移します。
概要
本研究では、AAV媒介による導入を用いて、皮質虚血性脳卒中後の神経新生転写因子Neurod1の異所性発現について調査します。プロトコルは2つのフェーズで構成されており、野生型マウスを用いた亜急性期（脳卒中後7日目）と、条件付きレポーターマウスを用いた慢性期（脳卒中後21日目）です。目的は、Neurod1の発現が神経再生および運動機能の改善を促進するかどうかを評価することです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 遺伝子治療
- 脳卒中からの回復
背景
- 虚血性脳卒中は、神経細胞の喪失と機能欠損を引き起こします。
- 神経再プログラミングは、機能回復の可能性を秘めています。
- この文脈における遺伝子導入には、AAVベクターが使用されます。
- 介入のタイミングが治療結果に影響を与える可能性があります。
研究目的
- 脳卒中後モデルにおけるニューロン再生に対するNeurod1発現の影響を探索すること。
- Neurod1発現と運動機能回復の相関関係を調査すること。
- 遺伝子導入法および導入時期に基づく反応の変動性を評価すること。
使用した手法
- Cre-Flexシステムを用いて、AAVベクターによりNeurod1を導入した。
- 生物学的モデルとして、脳卒中後の野生型マウスおよび条件付きレポーターマウスを用いた。
- 本研究では、異なる時点（脳卒中後7日および21日）に焦点を当てている。
- 実験プロトコルには、ベクター注入のための精密な外科的手順が含まれる。
- 脳領域間で一貫した導入効率を達成することの困難さが指摘された。
主な結果
- アストロサイトにおけるNeurod1の発現が、形質導入されたニューロンの増加に寄与した。
- 運動機能の改善は、Neurod1の発現タイミングと相関していた。
- AAVデリバリーシステムによる遺伝子発現の変動が観察された。
- in-vivoでのリプログラミング検証は依然として課題である。
結論
- 本研究は、脳卒中後の回復を促進させるNeurod1の可能性を実証しています。
- 遺伝子導入のタイミングと方法を理解することで、治療戦略を最適化できる可能性があります。
- 本研究から得られた知見は、神経修復および脳卒中リハビリテーションにおける今後のアプローチに寄与すると考えられます。
よくある質問
産業上の重要性
AAVを介した神経原性転写因子の異所性発現により、脳卒中後の脳領域における神経リプログラミングの精密な検証が可能となり、再生治療のターゲット検証を支援します。このプラットフォームは、領域特異的なプロモーター活性と導入効率という課題に対処し、初期段階の神経再生パイプラインにおける予測信頼性を高めます。標準化されたAAVシステムは、転写因子による細胞運命変化の再現性のある評価を促進し、中枢神経系（CNS）修復戦略のポートフォリオ選別（トリアージ）に直接的な影響を与えます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 疾患に関連するin vivoモデルにおいて、神経分化誘導転写因子の機能的な検証を可能にします。
- 遺伝子導入に対する領域およびプロモーター特異的な反応を明らかにすることで、メカニズムレベルでのリスク低減をサポートします。
- 損傷後の神経再プログラミングに関する、仮説に基づいた検証のためのプラットフォームを提供します。
- さらなる開発に向けた転写因子ターゲットの選択における、予測的な信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- CNSモデルにおいて再現性のある異所性遺伝子発現を実現するための、標準化されたAAVベースのシステムを確立します。
- 導入されたニューロン数およびレポーター遺伝子発現の定量的な評価を可能にします。
- 脳の各領域における神経新生因子の有効性を評価するためのアッセイ準備をサポートします。
- 異なるマウス系統や実験スケジュールのタイムラインに適応可能な、拡張性のあるプロトコルを提供します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー探索に向けた、虚血性脳卒中の疾患関連モデルに準拠しています。
- 発見段階のリプログラミングから、機能回復の前臨床検証までの一貫性を可能にします。
- 介入後の神経細胞の転帰を定量化することで、リスク調整に基づいた進展の意思決定を支援します。
- 領域特異的な遺伝子導入および細胞リプログラミングにおけるトランスレーショナルな課題に対処します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このAAVベースの外来性発現プラットフォームは、初期探索から前臨床検証までを統合しており、CNS修復パイプラインにおける反復的な仮説検証およびメカニズムのリスク低減を可能にします。
- 探索生物学： in vivoにおける神経新生因子の有効性に関する帰無仮説の検証を支援します。
- スクリーニング： プロモーター活性と導入効率を比較するための、定量的で再現性のあるアウトプットを提供します。
- 分析： 導入されたニューロン数および領域特異的な遺伝子発現の測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 探索的知見を脳卒中回復の前臨床モデルへと橋渡しします。
- 企業での再利用： 多様な神経再生プログラムに適応可能な、モジュール式の柔軟なシステムを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲット選択における予測の信頼性を高め、ニューロン再プログラミングのメカニズム的な理解を深める。
- 運用の価値： 遺伝子導入および定量プロトコルを標準化し、研究間での再現性を確保する。
- 戦略的価値： 領域およびプロモーター特異的な結果を明確にすることで、ゴー/ノーゴー（継続か中止か）の意思決定に寄与する。
- ポートフォリオへの影響： 中枢神経系（CNS）修復のための神経形成因子候補について、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 定位固定手術およびAAVベクターの取り扱いの専門知識が必要です。
- 定量的なイメージングおよび細胞運命解析のインフラへのアクセスが不可欠です。
- 注入速度およびプロモーター選択に関するチーム間の標準化が必要です。
- 脳領域やマウス系統による導入効率のばらつきを考慮する必要があります。
- 正確な解釈のためには、リプログラミングされたニューロンと既存のニューロンを慎重に区別することが不可欠です。
