Name: in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶレトロウイルスCRISPR/Cas9を用いたTh17細胞分化の遺伝子ターゲティング法。Cas9トランスジェニックマウス由来の一次T細胞にガイドRNAを導入し、Th17分化における遺伝子機能を解析する効率的なプロトコルです。

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<meta charset="utf8"></head><body>Th17分化における遺伝子編集のためのガイドRNAのレトロウイルス形質導入

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
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<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td><td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 細胞および組織培養ディッシュ</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (遊離酸、滅菌)</td><td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル細胞および組織培養プレート</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>48 ウェル細胞および組織培養プレート</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>BrefeldinA Solution (1,000x)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 anti-mouse CD4 抗体 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>CD3e モノクローナル抗体 (145-2C11), Functional Grade, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Monoclonal Antibody (IM7), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectin) モノクローナル抗体(MEL-14)、APC、eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer Auto 2000</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer (40 &mu;m)</td><td>バイオシャープ</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (70 &mu;m)</td><td><a name="RANGE!B14">biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5425&nbsp;R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBRカラーqPCRマスターミックス</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress IIワンステップクローニングキット</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha;コンピテントセル</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit</td><td>STEMCELL</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Mini Plasmid KitII</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Transfection Reagent</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Premium Plus</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse IL-17A 抗体 (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix for qPCR?+gDNA ワイパー?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>1950</td><td></td>年7月7</tr>日 <tr><td>マウス GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Reduced Serum Medium</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse CD4 抗体 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>100531</tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD25 抗体 (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 anti-mouse CD4 抗体 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PMA/TPA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9マウス&nbsp;</td><td>Shanghai Model Organisms Center</td><td>カタログ番号 NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTGF-β 1(CHO発現)タンパク質、CF</td><td>R&D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>研究用細胞分析装置</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>研究用細胞選別機</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp サーマルサイクラー PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム溶液 (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD28 抗体 (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse IFN-&gamma;抗体 (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-4 抗体 (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Purified anti-mouse IL-12/IL-23 p40 抗体 (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール (50 mM)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitroでのth17分化の研究のためのレトロウイルスcrispr/cas9媒介遺伝子ターゲティング

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

本研究では、sgRNAターゲットをRorcにクローニングし、sgRNAノンターゲティングコード配列をmCherry蛍光タンパク質を用いたpMX-U6-MCSベクターにクローニングしました(図1A,B)。レトロウイルスの作製は、図2に概説したプロトコルに従って行った。トランスフェクションは0日目に開始され、レトロウイルスの収穫は2日目に行われました。トランスフェクション効率は、mCherryの蛍光強度で試験できます(図1C)。ウイルスを回収する前に、ナイーブなCD4+ T細胞を選別し、活性化しました。次いで、これらの活性化CD4+ T細胞をスピン感染を用いて感染させ、続いて、説明したように分化ステップを継続させた。最後に、形質導入の効率と分化の結果について、フローサイトメトリー解析とqPCR解析を用いて評価しました。
図3は、ナイーブCD4+ T細胞の選別に適用されるゲーティング戦略を示しています。メイン細胞集団と一重項細胞を選択した後(図3の最初の2つのゲートに示すように)、FVD-CD4+細胞をゲートして、Th17細胞に分極したCD4T細胞とAPC細胞のCD4T細胞を区別しました。最後に、CD4 T細胞によって産生されるIL-17AはTh17の分化効率を表しており、これはノックアウト効率を示しています。mCherry陽性細胞の割合はレトロウイルス感染の効率を反映し、ノックアウト効率はIL-17A陽性細胞の割合で示されます。細胞生存率を高め、ソーティング時間を最小限に抑えるために、マウスCD4+ T細胞単離キットを使用して脾細胞を濃縮したところ、濃縮効率は90%を超えました。
レトロウイルス感染の効率は、mCherry陽性細胞の存在によって示され、通常約40%です(図4A)。ウイルスを集中させることで感染効率を高めることができますが、このアプローチでは実験期間が長くなり、コストが高くなります。私たちの実験では、Th17細胞分化カクテルなしで培養した感染細胞がTh17分化陰性コントロールとして機能し、Th0と命名されました。ノンターゲティングsgRNAをポジティブコントロールとして用いた、これをsgNTと呼んだ。遺伝子編集には、RORγt遺伝子を標的とするgRNA(sgRNA-Rorc)を採用しましたが、これによりTh17の分化効率が大幅に低下しました(図4A)。この介入により、 Rorc と IL-17a の発現レベルも大幅に低下しました (図 4B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
図1:レトロウイルスベクターにサブクローニングされたsgRNAの例とトランスフェクション効率。 pMX-U6-MCS ベクトルを初期構成体として使用しました。gRNAスキャフォールドは、(A)スクランブル部位と(B) Rorcを標的とするsgRNA配列(オレンジ色の部分)とともに、U6プロモーターの下流に挿入されました(緑色の部分はU6プライマーによるシーケンシングのための切片として)。sgRNA含有プライマーおよびシーケンシングプライマー部位の位置は、環状ベクターの下に示されています。略語:AmpR =アンピシリン、カルベニシリン、および関連する抗生物質に対する耐性。LTR = 長い端子の繰り返し;MMLVψ = モロニーマウス白血病ウイルスのパッケージングシグナル; gag = 開始コドンを欠く切断されたモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV) のgag 遺伝子。(C)プラスミドDNAトランスフェクトPlat-E細胞におけるmCherryの顕微鏡イメージング。スケールバー: 500 px。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
図2:プロトコルの概略図。 トランスフェクションの前日に、Plat-E細胞の密度を適切な範囲に調整する必要があります。翌日(0日目)にトランスフェクションを行い、12時間後に培地を交換します。1日目に、Cas9発現マウスのナイーブT細胞を選別し、活性化します。続いて(2日目)、ウイルス含有培養上清を回収し、活性化されたT細胞と結合してレトロウイルス形質導入を行います。その後、感染した細胞をTh17細胞に3〜4日間分化させ、FACSを用いて解析します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
図3:CD4ナイーブT細胞を選別するためのゲーティング戦略。 濃縮されたCD4 T細胞に対して表面染色を行い、CD4、CD25、CD44、およびCD62Lを標識しました。採用されたゲーティング戦略は次の通りでした:最初に、リンパ球は前方散乱および側方散乱パラメータに基づいてゲートされました。続いて、FSC-HおよびFSC-Wを用いて単一細胞を同定した。次に、CD4+CD25- 細胞をゲーティングして、制御性T細胞(Treg)を排除しました。最後に、CD44低CD62L高 ナイーブT細胞が同定されました。単離されたCD4+ ナイーブT細胞は、その後の実験のために収集されました。略語:FSC =前方散乱;SSC = サイドスキャッター。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
図4:活性化T細胞の形質導入とTh17の分化の成功例。 (A)Th17の分化効率は、RORγt gRNA(mCherry+ IL-17a+集団のゲーティング)によって編集され、大幅に低下します。(B)Th0(Th17細胞分化カクテルなしで培養した感染細胞)、sgNT(ノンターゲティングsgRNA)、およびsgRNA-Rorc( RORγt 遺伝子をターゲットとするsgRNA)におけるRorγtおよびIL-17aの相対的mRNA発現。p &lt; 0.001 (対応のない両側スチューデントの t 検定; データは SEM ±平均として表されます)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">PCR反応成分</td>
			<td colspan="4">PCRプログラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>容量 (μL)</td>
			<td>歩</td>
			<td>一時。</td>
			<td>時間</td>
			<td>サイクル</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × Phanta Mix(ダイプラス)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95°C</td>
			<td>3分間</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95°C</td>
			<td>15秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>プライマー-F (10 μM)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56°C</td>
			<td>15秒</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">プライマー-R (10 μM)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72°C</td>
			<td rowspan="2">5 分 30 秒</td>
			<td>ステップ 2 に進みます</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>テンプレート (~30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72°C</td>
			<td>5分間</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12°C</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1: gRNAベクター構築のためのPCR反応コンポーネントとPCRプログラム。

in vitroでのTh17分化の研究のためのレトロウイルスCRISPR/Cas9媒介遺伝子ターゲティング

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