Name: 経上皮電気インピーダンスモニタリングによる多孔質基板ベースのエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ多孔質基板エレクトロポレーションと経上皮電気インピーダンスモニタリングによる細胞導入法。高い細胞生存性を維持しながら、エレクトロポレーションの効果をリアルタイムで評価する手法を確立した。

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<meta charset="utf8"></head><body>A431細胞におけるエレクトロポレーション解析と送達予測のためのTEEI法

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

エレクトロポレーションは、細胞を電場にさらす技術で、細胞膜に一時的な孔を作り、タンパク質、RNA、DNAなどのカーゴが通過できるようにします1,2。最も広く使用されているのは、バルクエレクトロポレーション(BEP)です。BEPは、数百万個の細胞を含む電解質をキュベットに充填し、電解質を高電圧にさらし、拡散またはエンドサイトーシスを通じて貨物を細胞内に侵入させることによって実行されます1。BEPには、ハイスループットや多数の市販システムなど、多くの利点があります。ただし、BEP 配信には制限があります。電極に対する細胞の位置に一貫性がなく、隣接する細胞からの電界遮蔽により、BEP 3,4中の電界ばく露に大きなばらつきが生じます。BEPに必要な高電圧は、細胞の生存率にも大きな悪影響を及ぼします5。2011年6月の開始以来、多孔質基質エレクトロポレーション(PSEP)と呼ばれるエレクトロポレーション法への関心が高まっているが、局在エレクトロポレーションやナノまたはマイクロエレクトロポレーション1,7,8などの他の名前で呼ばれることもある。BEPの細胞懸濁液とは対照的に、PSEPは多孔質基質に接着した細胞上で行われます。接着状態は、大多数のヒト細胞株9にとって好ましいだけでなく、基質の細孔も電流に焦点を合わせ、膜貫通電位(TMP)を細胞膜の特定の領域に局在させる10,11。この局在化により、印加電圧の大幅な低減が可能になり、損傷が減少し、細胞の生存率が向上します。この効果の組み合わせは、細胞膜の細孔形成を制御するのに役立ち、その結果、より一貫性のある効率的な送達が実現します1,5,12。
最近の研究では、市販の多孔質膜インサート13 (図1A、B)を保持するための6ウェルの金メッキ電極アレイを備えたPSEPデバイスが導入されました。これは、Vindisらによって最初に導入された方法です14。このデバイスは、パルスを印加し、経上皮電気インピーダンス(TEEI)として知られる細胞単層全体の電気インピーダンスをリアルタイムで測定できます13。デバイスのユーザーインターフェースにより、エレクトロポレーション波形と極性を完全に制御できます。重要なのは、リアルタイムのインピーダンス測定を使用して、高価な試薬や蛍光マーカーを必要とせずに送達結果を予測できることです。これはラベルフリー送達15として知られています。
PSEPプラットフォームは、パルス発生器とTEEI測定装置を収容するデバイスの本体と、多孔質基板が挿入され、エレクトロポレーションが発生する電極アレイの2つの主要なカスタム電気部品で構成されています。すべてのカスタム電子機器と3Dプリントコンポーネントの図は、GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI にあります。カスタム電子機器に加えて、プラットフォームが正しく機能するためにはコンピューターも必要です。このカスタムソフトウェアを実行するには MATLAB (バージョン 2021a 以降) が必要であり、解析用のデータを保存してアクセスするには Microsoft Excel が必要です。このプログラムは、カスタム電子機器を制御し、設定を調整するためのグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)を提供します。これらのプログラムは、GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI でも公開されています。
予備データでは、このプロセスはさまざまなタイプの接着細胞で可能であることが示唆されていますが(図1C)、この記事では、Brooksらがこの細胞株に最適であると判断したパラメータを使用したA431細胞の調製についてのみ説明します13。さらに、ヨウ化プロピジウム(PI)カーゴは細胞毒性があるため、2つの実験が行われ、1つ目は高濃度のPIトランスフェクション培地を使用して送達効率を定量化し、もう1つは細胞培養培地のみを使用してより長い時間スケールでTEEIを測定します。これらの実験では、同一のエレクトロポレーション波形を使用しているため、結果を相関させることができます(図1D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg"> 図1:電極アレイの組み立て図と基本データ(A)電極アレイのウェル内のインサートのCADモデル。(B)電極アレイのCADモデル。(C)選択した細胞株のPSEPによるインピーダンスの増加、細胞株あたりn = 3。エラーバー:平均の標準誤差。(D)配送効率とTEEI は相関データを増やします。送達効率は、送達実験からPI画像とカルセイン画像の両方で標識された細胞の数を、Hoechstで同定された細胞の総数で割ることによって計算されました。セル数は、カスタム CellProfiler パイプライン (電圧あたり n = 6) を使用して決定しました。エラーバー:(x軸とy軸)平均の標準誤差。この図は、Brooks et al.13から許可を得て転載しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL円錐形遠心分離チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>2チップ使い捨て血球計算盤</td><td>ブルドッグバイオ</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 組織培養フラスコ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>クラスIIのタイプA2バイオセーフティキャビネット</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>カスタムコンポーネント</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>使い捨て遠心分離チューブ(50mL)</td><td>fisherbrand05-539-6</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>ギブコ</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ギブコ</td><td>A5670401</td><td></td></tr><tr><td>流体吸引システム</td><td>vacuubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Labomed</td><td>TCM400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブ 200 &micro;L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン / ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>ピペット (0.2-2 &micro;L)</td><td>fisherbrandエリート</td><td>FBE00002</td><td></td></tr><tr><td>ピペット(100-1000 &micro;L)</td><td>fisherbrandエリート</td><td>FBE01000</td><td></td></tr><tr><td>ピペット(20-200&マイクロ;L)</td><td>fisherbrandエリート</td><td>FBE00200</td><td></td></tr><tr><td>ピペット(2-20&マイクロ;L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Reaction Tube 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert (24-well)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0.4 &micro;m細孔径、2x106cm-2細孔密度、透明PET</td></tr><tr><td>組織培養プレート(24ウェル)</td><td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

経上皮電気インピーダンスモニタリングによる多孔質基板ベースのエレクトロポレーション

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

与えられたプロトコルは、TEEI測定を使用してエレクトロポレーションの中間プロセスを調べ、特にA431細胞株とPIカーゴについて送達予測を行う方法を確立します。このプロトコルの変更については、この記事で詳しく説明しますが、特定の値は変わる可能性がありますが、応答の一般的な傾向は一貫していることに注意することが重要です。例えば、初期ベースラインを下回るTEEIデータは細胞死に対応し、最小値を超えるTEEI値の最大増加は送達効率に対応する13。これらの一般的な傾向とその影響については、以下で説明します。
図2Aに示すように、PSEPプラットフォームの使用中には、さまざまなTEEI測定と細胞イメージングのトレンドが生じる可能性があります。このプロトコルの理想的な結果は、図 2Ai に示されている最適化された健康データと同様の曲線を生成することです。これは、ベースラインを下回る低下がなく、細胞死があったとしてもほとんどないことから、理想的な結果として特徴付けられます。さらに、最適化された健全曲線は、TEEIの最小値から最大の増加を示しており、送達効率が高いことを示しています13。これらの推論は、細胞単層のPSEP後イメージングによって裏付けられており、細胞死はごくわずかで、健康で完全にコンフルエントな細胞単層が明らかになります(図2Aiii)。さらに、同一のPSEP波形を使用した成功した送達実験は、図2Bに示す画像によって特徴付けることができます。適切なエレクトロポレーション波形の適用とカーゴの集中により、高い送達一貫性と細胞生存率が得られます。
細胞単層の健康状態とコンフルエンシーは、TEEIベースの送達予測16,17を成功裏に適用するために重要である。波形が最適化されていても、不健康または不完全な細胞単層は、図2Aiiの最適化された不健康なデータに示されているように、TEEI応答の低下をもたらします。ただし、この結果の画像(図2Avi)は、Brooksら13によるTEEI応答の解釈にまだ対応していることに注意してください。ベースラインを下回るディップはなく、細胞死がほぼゼロであることを示しています(図2C、D)。さらに、最小値からの減少の増加は、単分子膜内の細胞が少なくなると総PI送達が減少するため、送達効率に悪影響を与えることに対応します(図2C、D)。
最適化されていない波形を適用すると、TEEI応答がさらに大幅に低下する可能性があります。全エネルギーとそれが適用される時間枠に応じて、最適化されていない波形は、効率の低下からセル単層のほぼ完全な消滅まで、さまざまな結果を生み出す可能性があります(図2Ai、iii、v)。最適化されていない曲線と非常に最適化されていない曲線の両方で、ベースラインから大幅に減少しており、かなりの細胞死を示しています。しかし、最適化されていない波形が増えると、細胞の回収が妨げられ、送達効率が低下します。
送達効率は、送達実験からPI画像とカルセイン画像の両方で標識された細胞の数を、Hoechstで同定された細胞の総数で割ることによって計算されました。死亡は、TEEI測定実験でPIでマークされた細胞を取り、Hoechstで同定された細胞の総数で割ることによって計算されました。セル数は、両方のメトリクスのカスタム CellProfiler パイプラインを使用して決定しました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg"> 図2:一般的な条件のTEEI応答曲線とイメージング (A) (i) 最適化された条件と最適化されていない条件のTEEI変化率を示すTEEI応答データ。(ii)最適化された波形条件下での健康な単分子膜と不健康な単分子膜のTEEI応答比較。(III.-V)細胞死(赤)と生細胞(緑)を示す最適化された波形条件と最適化されていない波形条件の潜在的な結果の代表的なイメージング。(vi)細胞死(赤)生きた細胞(緑)を示す最適化された波形条件を適用した後の不健康な単分子膜の代表的なイメージング。(B)成功したPIデリバリー(赤)、生細胞(緑)、および核の位置(青)を示す画像。すべての画像が明るくなり、鮮明になりました。スケールバー:1000μm.(C)TEEIは、特定の電圧について、PSEP前のベースラインからPSEP後の最小値まで減少し、PSEP後の最小値からPSEP後のピークまで増加します。(D)特定の電圧に対する送達効率と細胞死率。エラーバーはSEM(n = 6)を表します。(C,D) 許可を得てBrooks et al.13 から転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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