Name: 腸内スイスロールおよびパラフィン包埋組織の免疫蛍光染色に最適化されたプロトコール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶスイスロール技術を用いたマウス腸管の免疫蛍光染色プロトコール。パラフィン包埋ブロックで全領域を可視化し、細胞応答と炎症機構の研究に有用です。

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この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)のACEへのK01 DK121869助成金の支援を受け、この出版物は、T32 GM132055(RME)、F31 DK139736(SAD)、T32 DK124191(SAD)、TL1 TR001451(RS)、UL1 TR001450(RS)、およびSAD & RSに対するHCSの基礎助成金によって部分的に支援されました。この研究は、サウスカロライナ医科大学(MUSC)からACEへのスタートアップ資金によって支援され、MUSC消化器疾患研究センター(P30 DK123704)および消化器および肝臓疾患のCOBRE GM120475 P20)によって支援されました。イメージングは、MUSCの細胞および分子イメージングコアを使用して行いました。

腸組織の高品質な免疫染色のための効率的なスイスロール法

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</ol>

著者は何も開示していません。

ここでは、腸の構造を保存し、正確な免疫染色を促進するために、スイスロール法を使用した組織固定の最適化された方法を紹介します。一度習得すると、この技術は、腸の生理学や細胞生物学を含むさまざまな研究課題を調査するために使用できる19。いくつかの最適化されたスイスの圧延方法が公開されており、非常に便利です20,21。この技術の利点は、濾紙で腸を正確に開くことの容易さです。これにより、組織を平らに固定することができ、転がるときに組織が内側に丸まるのを防ぐことができ、特に肥厚した筋筋の炎症組織を分析する際に役立ちます。さらに、信頼性の高い結果を得るためには、組織切片化が重要な役割を担っていることを強調することが不可欠です。適切な切片作製は、組織構造の保存を確実にし、正確な免疫染色を促進し、最終的には下流の分析の成功に貢献します11。最適化されたアプローチは、他のプロトコルと比較して難しくなく、異なる個人間で一貫した結果をもたらします。この論文で紹介した技術は、保存状態の良い組織構造、汎用性、および多様な抗体を使用した再現性の高い免疫染色も提供します。
このプロトコルの重要な側面は、固定と処理時間です。不適切な組織の固定と処理は、組織化学分析を損なう可能性があります。過度に固定された組織はもろくなり、固定されすぎた組織は柔らかすぎるままになります。過剰に固定された組織と固定不足の組織の両方が切片化されにくく、免疫染色が損なわれます。濾紙に解剖したら、死後の変化を減らすために、組織を直ちにホルマリンに入れるべきである22。このプロトコルでは、マウス組織をホルマリンで一晩固定します。いくつかの研究は、この固定時間を使用しています20,23,24。しかし、Boenischらは、ホルマリンに最大4日間固定された組織において免疫染色が一貫していることを示した25。固定時間と固定剤の最適化は、目的の分析に応じて必要になります。例えば、Carnoyの固定剤は、粘液染色26にしばしば好まれる。固定剤の選択と固定時間の期間は、各研究者の実験的アプローチに応じて最適化する必要があります。正確で一貫した処理時間を確保するために、自動ティッシュプロセッサーの使用をお勧めします。当研究室では、腸内組織をロール状に保持する小さなピンを使用しています。ピンがないと、処理中にティッシュが広げられる可能性があります。これらのピンは非常に小さくて鋭いため、注意が必要です。ティッシュ処理の前に、ワイヤーカッターを使用してピンの鋭利な端を取り外すことをお勧めします。一部の組織学コアは、ピン付きの組織を受け入れません。そのため、使用する前に確認しておくとよいでしょう。別のアプローチは、27を処理する前に寒天を使用して組織を固定することであり、またはカセットスポンジをカセットに使用してロールを維持することです。
免疫染色は、各抗体の最適化が必要なプロトコールです。可能な限り、ノックアウト検証済み抗体の使用が推奨されます。この組織固定およびプロセシング法により、透明な染色が得られ、未検証の抗体を使用する場合のバックグラウンドシグナルと比較して、抗体結合の同定が容易になります。固定剤の選択、抗原賦活化、抗体の希釈は、抗体の特異性に影響を与える可能性があります。研究者は、各抗体の固定、抗原賦活化、インキュベーション時間を調整することにより、プロトコールを慎重に評価し、最適化することをお勧めします。最良の結果を得るには、抗体をさまざまな希釈液で試験して最適な濃度を決定し、さまざまな抗原賦活化バッファーで試験する必要があります。エピトープ賦活化は、固定中に形成されるメチレン架橋を切断することにより、免疫染色を改善します。このプロトコルでは、酵素消化が組織形態を破壊する可能性が高いため、タンパク質分解誘導エピトープ賦活化ではなく、熱誘起エピトープ賦活化が使用される28。最も一般的な熱誘起エピトープ賦活化バッファーは、クエン酸バッファー、tris-HCl、およびtris-EDTAであり、クエン酸バッファーは組織形態に最も優しい29。バッファーの選択はさまざまであり、抗体ごとに決定する必要があります。多くの抗原賦活化バッファー、ブロッキング溶液、抗体希釈剤が市販されています。ただし、これらのソリューションは非常に高価で、法外なコストがかかる可能性があります。一般的な抗原賦活化液とブロッキングおよび抗体希釈液のレシピを提供し、費用対効果を確保しました。 
この方法の限界は、固定とプロセシングによって組織を変化させ、エピトープをマスクする可能性があることです。別のアプローチは、新鮮な凍結組織を免疫染色することです。新鮮な凍結組織は急速冷凍されるため、有毒な固定剤への曝露を回避し、タンパク質構造を維持し、一部のエピトープのアクセシビリティを向上させることができます。しかし、組織の構造と形態は、固定組織やパラフィン包埋組織よりも劣っています。新鮮な冷凍ティッシュのさらなる課題には、凍結ブロックとスライドの切片作成と保管に必要な材料とロジスティクスが含まれます。スイスロールと腸組織のストリップの分析は、以前の報告30で説明したように、絨毛の高さと幅の違い、および固有層の免疫細胞の違いを示しています。これらの結果は、腸内スイスロールが一部の腸の特徴を変化させることを示唆しており、実験を計画する際には考慮する必要があります。さらに、ホルマリン固定パラフィン包埋組織に特異的に結合する多くの抗体は、新鮮な凍結組織ではよく染色されないため、抗体の再検証が必要である31。
腸管組織の免疫染色は、消化管細胞の生物学や生理学に関するさまざまな疑問に答えるために使用できます。この手法は、腸の炎症、細菌感染後、およびがんの進行中の上皮の変化を特定するために広く使用されています。ここで紹介する方法は、費用対効果が高く、技術的に困難ではなく、再現性が高いため、腸組織の保存に最適です。最良の結果を得るために、このプロトコルで概説されているステップの最適化を、実験計画とテスト対象の仮説に基づいて最適化することをお勧めします。

腸の細胞構造は、腸組織が免疫染色のために保存される際に、その構造的完全性を維持する上で独自の課題を提起します。小腸は、絨毛1として知られる細長い指のような構造で構成されています。これらの絨毛は、埋め込みプロセス中に奇形になることがよくあります。研究者が腸を適切に埋め込んで断面を達成し、腸のすべての領域と腸を構成する層(つまり、固有筋、粘膜、漿膜)を視覚化できるようにする技術を持っていることを確認することは、堅牢な実験的分析2にとって重要です。不適切な固定、過度の固定、および不適切な組織の取り扱いは、組織の完全性を損ない、腸上皮に不注意な損傷をもたらします3,4。これらのステップで腸上皮を損傷すると、免疫組織化学プロトコルや使用される抗体の有効性に関係なく、免疫蛍光法などのその後の分析の品質が大幅に低下する可能性があります。
免疫染色は、適切な組織固定と同様に、生物医学研究の重要な部分です。免疫染色がうまくいけば、細胞の構造と機能のこれまで知られていなかった側面を明らかにすることができます。パラフィン切片の免疫蛍光染色は、固定およびパラフィン包埋プロセス5から生じる物理化学的修飾により、困難な場合があります。固定およびパラフィンの埋め込みにより、目的のエピトープの免疫蛍光検出を妨げる可能性のある抗原マスキングが生じます6。固定の遅延はタンパク質分解を誘発する可能性があり、その結果、重要なエピトープの染色が弱まるか、または存在しないことになります7。さらに、抗体はバックグラウンドが高レベルであると不正確になることがよくあります。一貫性のある特異的な抗体結合と高いS/N比を促進する免疫染色プロトコルは、研究者にとって貴重な情報を提供することができます。 
ここでは、腸管組織固定、スイスロール調製8、および免疫染色を通じて高品質の免疫蛍光画像を取得するように設計された包括的なプロトコールを提供します。腸の完全性を維持するためのガイドラインを強調し、このプロトコルは、免疫蛍光イメージング研究の品質と信頼性を向上させるための堅牢な方法論を研究者に提供することを目的としています。また、フィルターペーパーや自家製抗原賦活化、ブロッキング溶液、抗体希釈剤など、費用対効果の高いリソースを使用して、資金が限られている可能性のあるラボでもプロトコルにアクセスしやすくすることを目指してきました。すべての実験プロトコルについて、研究者は実験アプローチと関心のある領域に基づいて現在のプロトコルを最適化する必要があります。

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>セルロース濾紙</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>厚手 Whatman紙</td></tr><tr><td>荷電ガラススライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>解剖ピン サイズ00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R&D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>冷凍手袋</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブロック</td><td>プレミア</td><td>XH-2001</td><td>スライドウォーマー</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>64111-04</td><td>試薬のクリア</td></tr>リング <tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>大型カセット</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Mouse-on-mouse blocking reagent</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>マウスオンマウスブロック</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Cooker</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong gold antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>Reverse action Forceps</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>スライドラック</td><td>Tissue-TEK</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>スライド染色セット</td><td>Tissue-TEK</td><td>62540-01</td><td>耐溶剤性皿と金属フレーム</td></tr><tr><td>小型カセット</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein ゼラチン</td><td>ΣG7765</td><td>ブロッキングバッファー</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Wipes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

腸内スイスロールおよびパラフィン包埋組織の免疫蛍光染色に最適化されたプロトコール

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

腸は、小腸と大腸からなる複雑な器官です。小腸はさらに十二指腸、空腸、回腸に分けることができます。腸の各解剖学的領域には、細胞構造の違いによって反映される独自の機能があります。腸の変化を調べるには、さまざまな組織領域と細胞の変化を詳細に分析する必要があります。腸を研究し、大きな組織片を視覚化するために、研究者は通常、腸内スイスロールと呼ばれる技術を使用します。この技術では、腸は各解剖学的領域に分割され、平らな向きに固定されます。次に、組織を慎重に巻き、パラフィン包埋のために処理します。適切な組織の固定と配向は、見落とされがちな実験室技術ですが、下流の分析にとって非常に重要です。さらに、腸組織の不適切なスイスローリングは、壊れやすい腸上皮を損傷し、免疫染色のための組織品質の低下につながる可能性があります。無傷の細胞構造でしっかりと固定され、適切に配向された組織を確保することは、腸細胞の最適な視覚化を確実にするための重要なステップです。私たちは、腸のすべてのセクションを単一のパラフィン包埋ブロックに含めるスイスロールを作成するための費用対効果の高い簡単な方法を紹介します。また、腸上皮のさまざまな側面を研究するための腸組織の最適化された免疫蛍光染色についても説明します。以下のプロトコルは、腸管組織固定、スイスロール法、免疫染色を通じて高品質の免疫蛍光画像を取得するための包括的なガイドを研究者に提供します。これらの洗練されたアプローチを採用することで、腸上皮の複雑な形態が維持され、腸の生理学と病理生物学のより深い理解が促進されます。

ヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色は、前述した12と同様に行った。最適化された方法を使用して、腸のスイスロールは、小腸と大腸の3つのセグメントすべてを1つのスライドに含めました。腸全体をスライド上に収容することで、研究者は腸のあらゆる部分の変化を解析でき、試薬の切片作成や染色のコストを節約できます(図1)。また、免疫染色時にすべての腸セグメントを同時に同じ溶液にさらすことで、正確な結果を得ることができます。H&amp;E顕微鏡写真は、小腸と大腸のすべての部分の保存された腸の構造を示しています(図2)。十二指腸絨毛の測定では、このスイスロール法と比較して、未開封の腸組織の絨毛の高さに有意差は見られず、腸を開いても組織構造が乱れないことが示唆されました(図2D)。腸内スイスロールの免疫染色は、腸のさまざまな層と絨毛陰窩軸全体を示しています。蛍光画像は、一次抗体および二次抗体の染色によるバックグラウンドレベルが低いことを示しており、上皮に存在する個々の細胞をはっきりと示しています。 図3 は、杯細胞(MUC2陽性細胞)13、頂端膜(γ-ACTIN)14、上皮細胞の側膜(E-CADHERIN)15、および核の異なる腸セグメントの形態と染色を示しています。このプロトコルは、増殖細胞(PCNA)16、間質(LAMININ; 図4A)図17、リソソームドメイン(LAMP1)14、および上皮(β-CATENIN; 図4B)18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig01.jpg"> 図1:腸内スイスロールの調製と処理のワークフロー (A)腸管セグメントをPBS入りシリンジで洗い流し、PBSで洗浄します。(B)次に、湿った腸組織を乾いた濾紙の上に置きます。(C)濾紙の上で腸を縦に切り開き、(D)穏やかに広げます。(E)開いた腸の上に濾紙を敷き、腸を濾紙の間に優しく挟み、ホチキス止めします。腸管を一晩固定し、(F)を鉗子で巻く。(G)腸は逆作用鉗子から穏やかに外れ、(H)はロゼットの外観をしています。(私、 J)腸組織はピンで固定され、大きなカセットに入れられます。(K)4つの腸セグメントすべてを同じカセットに入れて、組織処理と埋め込みを行います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig02v2.jpg"> 図2:腸の4つのセグメントすべてのヘマトキシリンとエオシンの染色。 (A)タイルスキャンは、十二指腸、空腸、回腸、および結腸の個々のスイスロールを使用して、1枚のスライドで腸全体を視覚化する能力を示しています。(B)腸のスイスロールの顕微鏡写真、および(C)絨毛と陰窩の構造を示すための高倍率の挿入図。(D)スイスの圧延組織と未開封組織との間に有意差は示されていない小腸絨毛の長さの定量化は示されていません。スケールバー = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig03.jpg"> 図3:腸の4つのセグメントすべての免疫蛍光染色。 成体C57BL/6J対照マウスを、核(シアン)、側膜マーカーE-CADHERIN(緑)、MUC2で同定された杯細胞(黄色)、および頂端ブラシボーダーマーカー γ-ACTIN(マゼンタ)について免疫染色しました。スケールバー = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66977/66977fig04.jpg"> 図 4.腸の免疫蛍光染色。 (A)マウス腸の免疫蛍光染色の代表的な顕微鏡写真は、核(シアン)、増殖細胞、PCNA(緑)、および固有層、LAMININ(マゼンタ)を強調しています。(B)腸内の核(シアン)、細胞膜マーカー β-CATENIN(緑)、リソソームマーカーLAMP1(マゼンタ)を特定する免疫蛍光画像。スケールバー = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66977/66977fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

腸は消化と吸収に不可欠です。各領域(十二指腸、空腸、回腸、結腸)は、独自の細胞構造により、異なる機能を果たします。腸の生理学を研究するには、綿密な組織分析が必要です。このプロトコールでは、スイスロール法を用いた組織の固定と処理の概要を説明し、適切な組織の保存と配向を通じて正確な免疫染色を保証します。

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