Name: 腸内スイスロールおよびパラフィン包埋組織の免疫蛍光染色に最適化されたプロトコール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶスイスロール技術を用いたマウス腸管の免疫蛍光染色プロトコール。パラフィン包埋ブロックで全領域を可視化し、細胞応答と炎症機構の研究に有用です。

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この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)のACEへのK01 DK121869助成金の支援を受け、この出版物は、T32 GM132055(RME)、F31 DK139736(SAD)、T32 DK124191(SAD)、TL1 TR001451(RS)、UL1 TR001450(RS)、およびSAD & RSに対するHCSの基礎助成金によって部分的に支援されました。この研究は、サウスカロライナ医科大学(MUSC)からACEへのスタートアップ資金によって支援され、MUSC消化器疾患研究センター(P30 DK123704)および消化器および肝臓疾患のCOBRE GM120475 P20)によって支援されました。イメージングは、MUSCの細胞および分子イメージングコアを使用して行いました。

腸組織の高品質な免疫染色のための効率的なスイスロール法

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著者は何も開示していません。

ここでは、腸の構造を保存し、正確な免疫染色を促進するために、スイスロール法を使用した組織固定の最適化された方法を紹介します。一度習得すると、この技術は、腸の生理学や細胞生物学を含むさまざまな研究課題を調査するために使用できる19。いくつかの最適化されたスイスの圧延方法が公開されており、非常に便利です20,21。この技術の利点は、濾紙で腸を正確に開くことの容易さです。これにより、組織を平らに固定することができ、転がるときに組織が内側に丸まるのを防ぐことができ、特に肥厚した筋筋の炎症組織を分析する際に役立ちます。さらに、信頼性の高い結果を得るためには、組織切片化が重要な役割を担っていることを強調することが不可欠です。適切な切片作製は、組織構造の保存を確実にし、正確な免疫染色を促進し、最終的には下流の分析の成功に貢献します11。最適化されたアプローチは、他のプロトコルと比較して難しくなく、異なる個人間で一貫した結果をもたらします。こ...

腸の細胞構造は、腸組織が免疫染色のために保存される際に、その構造的完全性を維持する上で独自の課題を提起します。小腸は、絨毛1として知られる細長い指のような構造で構成されています。これらの絨毛は、埋め込みプロセス中に奇形になることがよくあります。研究者が腸を適切に埋め込んで断面を達成し、腸のすべての領域と腸を構成する層(つまり、固有筋、粘膜、漿膜)を視覚化できるようにする技術を持っていることを確認することは、堅牢な実験的分析2にとって重要です。不適切な固定、過度の固定、および不適切な組織の取り扱いは、組織の完全性を損ない、腸上皮に不注意な損傷をもたらします3,4。これらのステップで腸上皮を損傷すると、免疫組織化学プロトコルや使用される抗体の有効性に関係なく、免疫蛍光法などのその後の分析の品質が大幅に低下する可能性があります。
免疫染色は、適切な組織固定と同様に、生物医学研究の重要な部分です。免疫染色がうまくいけば、細胞の構造と機能のこれまで知られていなかった側面を明らかにすることができます。パラフィン切片の免疫蛍光染色は、固定およびパラフィン包埋プロセス5から生じる物理化学的修飾により、困難な場合があります。固定およびパラフィンの埋め込みにより、目的のエピトープの免疫蛍光検出を妨げる可能性のある抗原マスキングが生じます6。固定の遅延はタンパク質分解を誘発する可能性があり、その結果、重要なエピトープの染色が弱まるか、または存在しないことになります7。さらに、抗体はバックグラウンドが高レベルであると不正確になることがよくあります。一貫性のある特異的な抗体結合と高いS/N比を促進する免疫染色プロトコルは、研究者にとって貴重な情報を提供することができます。 
ここでは、腸管組織固定、スイスロール調製8、および免疫染色を通じて高品質の免疫蛍光画像を取得するように設計された包括的なプロトコールを提供します。腸の完全性を維持するためのガイドラインを強調し、このプロトコルは、免疫蛍光イメージング研究の品質と信頼性を向上させるための堅牢な方法論を研究者に提供することを目的としています。また、フィルターペーパーや自家製抗原賦活化、ブロッキング溶液、抗体希釈剤など、費用対効果の高いリソースを使用して、資金が限られている可能性のあるラボでもプロトコルにアクセスしやすくすることを目指してきました。すべての実験プロトコルについて、研究者は実験アプローチと関心のある領域に基づいて現在のプロトコルを最適化する必要があります。

<table><tbody><tr><td>&beta;-CATENIN</td><td>GeneTex</td><td>GTX101435</td><td></td></tr><tr><td>セルロース濾紙</td><td>Cytiva</td><td>10427804</td><td>厚手 Whatman紙</td></tr><tr><td>荷電ガラススライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23888114</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Epredia</td><td>152440</td><td></td></tr><tr><td>解剖ピン サイズ00</td><td>Phusis</td><td>B082DH4TZF</td><td></td></tr><tr><td>E-CADHERIN</td><td>R&D Systems</td><td>AF748</td><td></td></tr><tr><td>冷凍手袋</td><td>Tempshield</td><td>UX-09113-02</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブロック</td><td>プレミア</td><td>XH-2001</td><td>スライドウォーマー</td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>64111-04</td><td>試薬のクリア</td></tr>リング <tr><td>Hoescht</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>Millipore</td><td>402176</td><td></td></tr><tr><td>LAMININ</td><td>GeneTex</td><td>GTX27463</td><td></td></tr><tr><td>LAMP1</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19992</td><td></td></tr><tr><td>大型カセット</td><td>Tissue-Tek</td><td>4173</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>NC9679721</td><td></td></tr><tr><td>Mouse-on-mouse blocking reagent</td><td>Vector Laboratories</td><td>MKB-2213</td><td>マウスオンマウスブロック</td></tr><tr><td>MUC2</td><td>GeneTex</td><td>GTX100664</td><td></td></tr><tr><td>PCNA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2586S</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Cooker</td><td>Cuisinart</td><td>B000MPA044</td><td></td></tr><tr><td>ProLong gold antifade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>Reverse action Forceps</td><td>Dumont</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>スライドラック</td><td>Tissue-TEK</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>スライド染色セット</td><td>Tissue-TEK</td><td>62540-01</td><td>耐溶剤性皿と金属フレーム</td></tr><tr><td>小型カセット</td><td>Fisherbrand</td><td>15-200-403B</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>Teleostein ゼラチン</td><td>ΣG7765</td><td>ブロッキングバッファー</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J20605-AP</td><td></td></tr><tr><td>Wipes</td><td>KimTech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Chemical</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-ACTIN</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-65638</td><td></td></tr></tbody></table>

腸内スイスロールおよびパラフィン包埋組織の免疫蛍光染色に最適化されたプロトコール

Optimized Protocol for Intestinal Swiss Rolls and Immunofluorescent Staining of Paraffin Embedded Tissue

腸は、小腸と大腸からなる複雑な器官です。小腸はさらに十二指腸、空腸、回腸に分けることができます。腸の各解剖学的領域には、細胞構造の違いによって反映される独自の機能があります。腸の変化を調べるには、さまざまな組織領域と細胞の変化を詳細に分析する必要があります。腸を研究し、大きな組織片を視覚化するために、研究者は通常、腸内スイスロールと呼ばれる技術を使用します。この技術では、腸は各解剖学的領域に分割され、平らな向きに固定されます。次に、組織を慎重に巻き、パラフィン包埋のために処理します。適切な組織の固定と配向は、見落とされがちな実験室技術ですが、下流の分析にとって非常に重要です。さらに、腸組織の不適切なスイスローリングは、壊れやすい腸上皮を損傷し、免疫染色のための組織品質の低下につながる可能性があります。無傷の細胞構造でしっかりと固定され、適切に配向された組織を確保することは、腸細胞の最適な視覚化を確実にするための重要なステップです。私たちは、腸のすべてのセクションを単一のパラフィン包埋ブロックに含めるスイスロールを作成するための費用対効果の高い簡単な方法を紹介します。また、腸上皮のさまざまな側面を研究するための腸組織の最適化された免疫蛍光染色についても説明します。以下のプロトコルは、腸管組織固定、スイスロール法、免疫染色を通じて高品質の免疫蛍光画像を取得するための包括的なガイドを研究者に提供します。これらの洗練されたアプローチを採用することで、腸上皮の複雑な形態が維持され、腸の生理学と病理生物学のより深い理解が促進されます。

ヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色は、前述した12と同様に行った。最適化された方法を使用して、腸のスイスロールは、小腸と大腸の3つのセグメントすべてを1つのスライドに含めました。腸全体をスライド上に収容することで、研究者は腸のあらゆる部分の変化を解析でき、試薬の切片作成や染色のコストを節約できます(図1)。また、免疫染色時にすべての腸セグメントを同時に同じ溶液にさらすことで、正確な結果を得ることができます。H&amp;E顕微鏡写真は、小腸と大腸のすべての部分の保存された腸の構造を示しています(図2)。十二指腸絨毛の測定では、このスイスロール法と比較して、未開封の腸組織の絨毛の高さに有意差は見られず、腸を開いても組織構造が乱れないことが示唆されました(図2D)。腸内スイスロールの免疫染色は、腸のさまざまな層と絨毛陰窩軸全体を示しています。蛍光画像は、一次抗体および二次抗体の染色によるバックグラウンド...

腸は消化と吸収に不可欠です。各領域(十二指腸、空腸、回腸、結腸)は、独自の細胞構造により、異なる機能を果たします。腸の生理学を研究するには、綿密な組織分析が必要です。このプロトコールでは、スイスロール法を用いた組織の固定と処理の概要を説明し、適切な組織の保存と配向を通じて正確な免疫染色を保証します。

The intestine is a complex organ composed of the small and the large intestines. The small intestine can be further divided into duodenum, jejunum, and ...

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Research

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生物学

このビデオは、自由浮遊マウス空腸切片の腸房細胞を可視化するための免疫蛍光法を示しています。腸絨毛内では、管腔先端に緑色の蛍光が広がり、赤い細根の塊が広がっていることは、房状細胞の存在を示しています。...

空腸凍結切片における房状細胞の可視化のための免疫蛍光法

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

腸の上皮幹細胞（のISC）は、パネート細胞と混在しています。これらの細胞は、のISCをサポートするISCの子孫を分化し、抗菌保護を提供しています。ここでは、我々はパネート細胞は腸管上皮を維持する上で重要な役割を果たしていることを確立するために、トランスジェニック条件付きマウスモデルを使用する方法を示します。...

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル<em&gt;のCre-LOX</em&gt;マウスモデル

腸の粘膜内層に沿って上皮細胞の正確な同定と位置が異なる細胞系譜を定義することが不可欠です。腸組織の適切な画像化は、最大解像度でのタンパク質発現パターンの同定のために重要です。本研究では、マウスの腸組織を処理するための最適な方法および条件を線引きすることを目指しています。...

免疫組織化学および免疫蛍光分析のための腸組織の調製のための改良されたスイス・ローリングテクニック

体内組織から腸管の 3 D 構造の隔離のためのプロトコルを提案して地下行列体外埋め込み organoids、ディテールの異なる固定と、微小管の免疫分類のために最適化されたプロトコルを汚すcentrosomal、および接合部のタンパク質だけでなく細胞マーカー Lgr5...

微小管と 3 D培養腸 Organoids とEx Vivo腸組織における Centrosomal 蛋白質の免疫蛍光ラベリング

久我らはリン酸化状態アクチン結合タンパク質 girdin チロシン 1798 (pY1798) のリン酸化などに対する特異抗体できる房細胞 (TCs) をラベルに使用することを発見しました。このプロトコルは、pY1798 抗体を用いた浮遊空腸凍結切片の免疫蛍光染色を使用して Tc...

フローティング マウス腸凍結切片で腸内房細胞を可視化する抗リン girdin 抗体の使用

無料のコンピュータ支援システムを用いた腸内炎症の系統的採点は、潰瘍および炎症性変化の存在を特徴とする大腸炎モデルにおける組織病理学的変化を定量的に比較する強力なツールである。組織学的大腸炎スコア評価は臨床観察を強化し、データ解釈を促進する。...

プリンデキストラン硫酸ナトリウムによる大腸炎モデルにおける腸内炎症の系統的採点解析

この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。...

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

当社の詳細なプロトコルは、3D構造とさまざまな細胞タイプでヒトの腸粘膜をシミュレートし、微生物のコロニー形成に応答した免疫応答と細胞機能の詳細な分析を可能にする高度な腸オンチップモデルの作成と使用について概説しています。...

腸粘膜免疫応答を解析するための免疫適格腸内チップモデル

このプロトコルは、元々マウス腸向けに開発された「スイスロール」技術を改良した全胃免疫染色法を示しています。...

修正スイスロール技術を用いたマウス胃筋層の空間マッピング強化

学ぶスイスロール技術を用いたマウス腸管の免疫蛍光染色プロトコール。パラフィン包埋ブロックで全領域を可視化し、細胞応答と炎症機構の研究に有用です。

腸内スイスロールおよびパラフィン包埋組織の免疫蛍光染色に最適化されたプロトコール

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