Name: 進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶテトラサイクリン制御型合成回路の設計・導入プロトコル。Leishmania major感染における免疫代謝を探索し、寄生虫排除とサイトカイン発現の調節メカニズムを解明する革新的な宿主指向療法アプローチを発見する。

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著者らは、私たちの研究とBRIC-NCCSバイオインフォマティクスファシリティを支援してくれたプネーのバイオテクノロジー研究イノベーション評議会-国立細胞科学センター(BRIC-NCCS)のディレクターに感謝します。

リーシュマニア症治療のためのテトラサイクリン制御合成回路の設計

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<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+signaling+in+leishmaniasis%3A+insights+gained+from+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo+Adv%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling.</a> Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).</li>
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<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+combating+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for combating leishmaniasis.</a> Front Microbiol. 15, 1338749(2024).</li>
<li>Volpedo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+live+attenuated+centrin+gene-deleted+Leishmania+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates.</a> Pathogens. 11 (4), 431(2022).</li>
<li>Almeida, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis%3A+Immune+cells+crosstalk+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization.</a> Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).</li>
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<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+identifies+genes%2Fpathways+associated+with+experimental+resistance+to+paromomycin+in+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol+Drugs+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani.</a> Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).</li>
<li>Bolintineanu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+changes+in+tetracycline+repressor+binding+upon+mutations+in+the+tetracycline+operator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Eng+Data%22%5BJournal%5D)">Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator.</a> J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).</li>
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<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Rabhi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+Leishmania+infected+mice+macrophages%3A+a+metabolic+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).</li>
<li>Renkema, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDHA+mutations+causing+a+multisystem+mitochondrial+disease%3A+novel+mutations+and+genetic+overlap+with+hereditary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Human+Gene%22%5BJournal%5D)">SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors.</a> Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+channelizing+protein-peptide+interactions+pipeline+for+host-parasite+paradigm+in+IL-10+and+IL-12+reciprocity+by+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC+sequencing+identifies+sleepy+macrophages+during+reciprocity+of+cytokines+in+L.+major+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection.</a> Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).</li>
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<li>Cooling, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+virtual+biological+parts%3A+a+repository+of+modular+modeling+components+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology.</a> Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).</li>
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<li>Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+adenovirus+infection%3A+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells.</a> J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).</li>
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<li>De Boeck, J., Verfaillie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inducible+overexpression+systems%3A+how+to+induce+your+gene+of+interest+without+inducing+misinterpretations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations.</a> Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methoxyl+Aesculetin+abrogates+lipopolysaccharide-induced+inflammation+by+suppressing+MAPK+and+AP-1+pathways+in+RAW+264.7+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells.</a> Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).</li>
<li>Tomiotto-Pellissier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+Leishmaniasis%3A+Broadening+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons.</a> Front Immunol. 9, 2529(2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

得られた結果は、合成回路の設計と実装にチャネル化されたパイプラインの効率を強調しています。この合成回路の構築は、リーシュマニア症のような感染症に対する精密医療の開発に向けた一歩でした。遺伝的部分の in silico アセンブリと決定論的シミュレーションを通じて、TetONシステムの特徴的な調節効果をモニターしました。特に、この回路の影響により、TetRとSDHA/GFPの相互双安定発現につながった可能性があります。SDHAの発現は周期的であり、これはドキシサイクリンの存在下でのみその発現が増加したことを示している可能性があります。.一定期間にわたる発現パターンの潜在的な変化を観察するために、時間単位 100 が選択されました。結果は、合成回路がTetRおよびSDHA/GFPに対して周期的な挙動を示したことを同定し、これはおそらくその直交的な性質に起因する21。iGEM部品登録からの遺伝子部品の組み立ては、合成回路22の構築に必要な遺伝的要素を提供したため、極めて重要な役割を果たした。遺伝子部分のモジュール化は、回路の翻訳および機能が影響を受ける可能性があり、細胞における非効率的な発現および調節効果につながる可能性があるため、不可欠である23。
合成回路の挿入サイズは、ベクトルのサイズが大きすぎないように約1.3kbであり、これは潜在的に変換効率を低下させる可能性がある24。適切なベクターを選択することは、細菌系でのコピー数を増やし、高いプラスミドコピーを生成するために不可欠な遺伝的部分を持っていなければならず、その発現機構は哺乳動物系にうまく適応しなければならないため、重要なステップである25。pEGFP-N1ベクターは、RAW264.7細胞株で十分に特徴付けられており、複数のクローニング部位を持つコンパクトなプラスミド構造を持っています26。プラスミドの単離には、ラボで標準化されたバッファー溶液を使用して、高濃度で純粋なプラスミドの生成を確保し、分光光度推定とAGEによって検証しました。pEGFP-N1ベクターへの合成回路の挿入は、制限酵素処理によって検証され、サンプルはAGEおよびシーケンシングで分析されました。AGEの結果は、インサートのバンドが1.3 kb、pEGFP-N1ベクターのバンドが4.7 kb、合成回路全体のバンドが6 kbでした。 
DNAの1:1、1:2、および2:1の比率を使用したトランスフェクション:PEI比が行われ、観察された1:1の比率が細胞形態を乱すことなく最も効果的に機能しました(データは示されていません)。トランスフェクション細胞の選択には、400μg/mL〜1000μg/mLのG418濃度を使用することが推奨される27。500 μg/mLのG418は、トランスフェクションされた細胞の細胞増殖やトランスフェクションされた細胞の形態を損なうことなく、トランスフェクションされていない細胞の増殖を効果的に抑制するため、トランスフェクションされた細胞の選択に使用されました(データは示されていません)。トランスフェクション効率における細胞表現型の重要性、特に分化を受けてトランスフェクションが困難になる可能性のあるマクロファージ細胞株では、RAW264.7細胞株の継代数が少ないことを形質転換に使用しました28。細胞継代数もトランスフェクション効率の重要な要素となる可能性があります。通過数が高いと、非効率的なトランスフェクション29につながる可能性がある。Doxは、TetRへの高い結合効率、良好な組織分布、低毒性、および24時間30の半減期により、Tet-ON誘導システムの好ましい誘導剤です。トランスフェクション後、細胞をdoxで24時間誘導し、GFP発現を観察しました。RAW264.7細胞の場合、合成回路誘導に使用されたDOXの濃度は1μg/mLであり、これは1-2μg/mLの推奨範囲に収まりました31 （データは示さず。しかし、導入後のSDHA濃度の調節は未定でした。全体として、細胞継代数、DNA:PEI濃度、哺乳類トランスフェクション選択マーカー濃度、およびドキシサイクリン誘導濃度の決定と標準化は、トランスフェクションプロセスにおける重要な要素です。
感染後の合成回路を異なる時点で誘導した後、細胞内寄生虫の負荷の大幅な減少が観察されました。感染したサンプルとIMTIサンプルの寄生虫負荷を比較したところ、合成回路で誘導された細胞の負荷が低いことが明らかになりました。これは、おそらくSDHAの発現によるものと思われます。SDHAの発現はNO産生と関連しているため、IMTI細胞は不規則で粗い形態をとることが観察され、これはRAW264.7細胞株でNOが産生されるときに発生する32。IL-10 と IL-12 のレベルは 6 時間感染後に最も高かったのは、両方のサイトカインがこの時点でアップレギュレーションされていることが報告されているため、IL-10 は IL-12 よりも多く生成されます19。IL-10およびIL-12レベルはトランスフェクション後およびIMTIサンプルで有意に変化しなかったため、サイトカインプロファイリングを実施して炎症誘発性および抗炎症性サイトカイン応答を検出しました。 
TNF-α、IFN-γ、TGF-βの発現レベルは、6時間感染、IMT、および24時間IMTIサンプルで同定されました。細胞内寄生虫を排除するためには、TNF-αとIFN-γは、NO産生を通じて酸化バーストを誘導するため、主に不可欠です。M2分極マクロファージはTGF-βを発現し、炎症誘発性サイトカインをダウンレギュレートする33。24時間のIMTIサンプルは、TGF-βよりもTNF-αおよびIFN-γの発現が増加したことを示し、これは、トランスフェクションおよび L.majorへの感染により、マクロファージが表現型を発現する炎症誘発性サイトカインに分極した可能性があることを示唆しています。したがって、この研究は、合成回路によるトランスフェクションによって誘発される表現型の変化に関する洞察を提供し、感染動態を強調しています。治療薬としての合成回路の影響は、それらの誘導が抗炎症性サイトカインと比較して炎症誘発性サイトカイン発現を有意に増加させたため、調査することができます。したがって、この研究は、合成回路の構築と送達パイプラインを確立しただけでなく、 リーシュマニアが挑戦した宿主細胞の炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを通じて、リーシュマニア症モデルでその治療可能性を実証しました。

ホリスティックで統合的な医療の進歩は、免疫細胞の代謝変化と感染症における免疫細胞の表現型を調節する能力との間に特定された重要な関連性です。免疫代謝は、ヒトに蔓延する感染症の病因を解明するための新たな視点を提供します。さらに、介入のための新規標的を特定することにより、ワクチンや医薬品の開発に有望な技術を提供します1。免疫細胞の代謝リプログラミングは、リーシュマニア症を含むさまざまな感染症で同定されています。 リーシュマニア属 リーシュマニア症の原因であり、そのうち リーシュマニアメジャー (L.メジャー)は皮膚リーシュマニア症(CL)を引き起こします。 L. major 寄生虫は、細胞内寄生虫として増殖と生存のために、宿主細胞、特にマクロファージの代謝に大きな影響を与えます2。マクロファージは通常、古典的に活性化された(M1)サブセットまたは代替的に活性化された(M2)サブセットのいずれかに分極することができ、M1細胞は高い炎症誘発性サイトカイン分泌と窒素種の代謝による一酸化窒素(NO)の産生を持っています。M2細胞は、抗炎症性サイトカインのレベルが上昇し、窒素代謝を通じて高いアルギナーゼ活性を示します3。したがって、両方の表現型は、免疫応答だけでなく、代謝経路でも異なります。
リーシュマニア症のシステムバイオロジーは、創薬・創薬を通じて新規治療法を創製するための分子標的を同定することを目的としています。シグナル伝達ネットワークと代謝経路の再構築は、リーシュマニア症を全体論的モデルとして理解するのに役立ち、疾患状態を引き起こす主要な要素の特定のための洞察を引き出します。数理モデリングは、リーシュマニア症4の複雑さを理解するための最も好まれる応用分析アプローチの1つです。免疫代謝ネットワークと数理モデルにより、寄生虫5を排除するために発現されるM1表現型の主要成分として、コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDHA)の同定が可能になりました。合成生物学は、リーシュマニア症の診断、ワクチン開発、治療薬に応用されています。免疫応答調節を標的とする代謝は、合成生物学ツールによって達成できる可能性があります。スフィンゴ脂質代謝を制御し、宿主の免疫シグナル伝達を変化させるイノシトールホスホリルセラミド合成酵素の調節には、双安定な振る舞いを持つ遺伝回路を用いて、L. major感染モデル6,7の内因性頑健性を合成的に調整した。したがって、システムと合成生物学は、リーシュマニアモデルシステムにおける精密医療の開発のためのモデルベースの遺伝子工学プラットフォームを提供することができます。
M1表現型は、免疫代謝シグナル伝達ネットワークの発現によって特徴付けられ、炎症性サイトカインと代謝経路の産生が相乗的に寄生虫の排除を促進します。M1分極は、インターロイキン-12(IL-12)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)などの炎症誘発性サイトカインの産生を意味します。M1表現型に高度に組み込まれている代謝経路には、解糖系、ペントースリン酸経路、および切断型トリカルボン酸サイクル(TCAサイクル)5が含まれます。切り捨てられたTCAサイクルは、コハク酸とクエン酸のレベルを上げることで寄生虫除去機構を指示し、NO3の生成を導きます。SDHAによるコハク酸の蓄積は、転写因子低酸素誘導因子1-α(HIF-1α)の活性化につながり、IL-1β8の産生を誘導します。M2表現型では、脂肪酸の酸化、グルタミン利用の増加、グルコースの酸化的リン酸化の増強が観察され、インターロイキン-10(IL-10)、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)、インターロイキン-4(IL-4)、インターロイキン-13(IL-13)3などの抗炎症性サイトカインの産生が観察されます。M2は細長いミトコンドリアを特徴としており、エネルギー生成の効率を高めます。それらは、脂肪酸、グルコース、およびグルタミンを基質としてTCAサイクルに燃料を供給するため、より高い速度で酸化的リン酸化を通じてATPを生成し、寄生虫の成長と増殖を促進します9。切断されたTCAを介したコハク酸の蓄積に関与するSDHA酵素は、NO産生を促進するだけでなく、電子輸送10を通じてコハク酸依存性の酸素消費を開始することもできます。リーシュマニアに感染したマクロファージでは、SDHAは2.17倍ダウンレギュレーションされ、好気性呼吸もダウンレギュレーションされる可能性があることを示しています11。コハク酸の消費量を増やして炎症誘発性サイトカイン媒介性NO産生を誘導し、寄生虫の排除を促進するためには、SDHAの発現が不可欠です。
この合成回路は、精密に標的を絞った治療法を提供し、疾患系を変化させて双安定振動を達成し、時空間レベルで健康な表現型を回復させる可能性があります。合成回路の送達と表現により、システムは動的で堅牢になります。合成生物学の進歩に貢献する重要な要因の一つは、複雑なアーキテクチャとカスタマイズされた機能の生成を可能にするために、遺伝的部分と要素をモジュール方式で組み立てる能力にある12。従来の発現技術に関連する制約が、テトラサイクリンオペロンベースの誘導性プラスミド合成回路の出現に拍車をかけ、プラスミドの迅速な評価とさまざまな細胞タイプへの容易な送達を可能にしました13。テトラサイクリン応答性リプレッサー(TetR)タンパク質は、二量体として存在する場合、テトオペロン(TetO)に対して強い結合親和性を示し、転写を効果的に抑制します。しかし、そのリガンドであるドキシサイクリン(dox)の相互作用により、TetRは構造変化を起こし、TetOから解離し、その結果、転写が妨げられることなく進行します。この回路は、タンパク質翻訳制御14を示すことができる。したがって、定義された方法論を通じて、設計されたテトラサイクリンオペロンベースの誘導プラスミド合成回路は、pEGFP-N1ベクターでSDHAを発現することを可能にしました。回路の変換効率とその歩留まりの評価により、送達の能力に関する洞察が得られました。ベクターの制限酵素消化により、クローニング効率の決定を確認しました。さらに、Balb/cマウスの腹膜マクロファージに由来するトランスフェクトRAW264.7マウスマクロファージ細胞株が、トランスフェクトされた細胞におけるドキシサイクリン用量依存的な緑色蛍光タンパク質(GFP)発現について観察されました。さらに、トランスフェクションされた細胞における寄生虫除去効果は、合成回路の発現によって裏付けられました。さらに、炎症誘発性サイトカインの誘導および発現が観察され、これは、合成回路の機能が直接関連していた合成回路トランスフェクションおよび誘導細胞における感染時点の増加を通じて指示されました。

<table><tbody><tr><td>10 &mu;L tips</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X restriction buffer</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>Restriction digestion</td></tr><tr><td>1mL tips</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1mL tube</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;Lチップ</td><td>ターソン</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430639</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>D1306</td><td>核染色</td></tr><tr><td>50mL チューブ</td><td>コーニング</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60mm プレート</td><td>ファルコン</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt シアン/オレンジ ローディングバッファー</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>Scientific 10488085</td> AGE 96ウェルカバースリップボトムプレート<td>用サンプルのローディング</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>共焦点イメージングおよびトランスフェクション用</td></tr><tr><td>96ウェルマイクロテストプレートフラットボトムウェル</td><td>ターソン</td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td>A9539</td><td>AGE用</td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動アセンブリ</td><td>GeNei</td><td>93</td><td>AGE</td></tr><tr><td>細菌層流</td><td>ESCO ライフサイエンス 2120765</td><td></td><td>形質転換用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>メルク</td><td>C4901</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>細胞培養層流</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>1323TS</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>セルスプレッダー</td><td>フィッシャー1.5mLチューブ用サイエンティフィ</td>ック<td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>EP5404000537</td><td></td></tr><tr><td>50mLファルコン用遠心分離</td>機 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>75004210</td><td></td></tr>クロ<tr><td>ロフロム</td><td></td><td></td><td>RNA分離</td></tr><tr><td>用CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>3110</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>用キュベット</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>プラスミド濃度の推定</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 ゲルイメージャー</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>AGE DEPC処理用</td></tr><tr><td>H2O 1000 ML</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>RNA単離用</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>メルク</td><td>33429</td><td>トランスフェクション細胞の誘導用</td></tr><tr><td>ドライヒーティングブロック</td><td>Labnet</td><td></td><td>制限酵素の形質転換と不活性化のために</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地</td><td>細胞科学</td><td></td>のための国立センター <td>細胞培養用</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00983</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Sigma</td><td>E7637</td><td>AGE用</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12635</td><td>緩衝液 /試薬調製</td></tr><tr><td>Evos 明視野顕微鏡</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>合成回路の構築用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>FV31S-SW ソフトウェア</td><td>Olypmus</td><td></td><td>画像取得</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>トランスフェクション用</td><td>1563411</td></tr><tr><td>ギブソンアセンブリ法によるクローニング</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>合成回路の構築</td></tr><tr><td>Graphpad プリズム</td><td>グラフパッド</td><td></td><td>統計解析</td></tr><tr><td>大容量cDNA逆転写キット</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>for cDNA synthesis</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>13825</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>シグマ</td><td>60615</td><td>形質転換およびコロニー選択用</td></tr><tr><td>ルリア・ベルティーニブロス</td><td>ヒメディア</td><td>M1245</td><td>培養用 E.coli</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP214</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>マイクロフィルト 垂直層流</td><td>マイクロフィルト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 8チューブストリップ、0.1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4358293</td><td>qRT-PCR用</td></tr><tr><td>MicroAmp光学8キャップストリップ</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032 Mula</td><td>for qRT-PCR</td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>LG</td><td>MC-7649DW</td><td>AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1用 (IFN-&gamma;)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>4331182</td><td>タクマン・プローブ</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>4331182</td><td>タクマン・プローブ</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>4331182</td><td>タクマン・プローブ</td></tr><tr><td>マウス ELISA キット IL-10</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BMS614</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>マウス用 ELISAキット IL-12</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BMS616</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky (タッチ スクリーン付き) + &mu;</td><td>ELISA</td>MX-Mマイクロプレートミキサー用ドロッププレート<td>ThermoFischerサイエンティフィック</td><td>51119600DP</td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレートミキサー調整可能0-1500rpmラボシェーカー改拌機</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr>バイオテクノロジー<tr><td>情報国立センター</td>合成<td>回路の構築のための</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td></tr> ノイ<tr><td>バウアーの部屋マリ</td><td>エンフェルドスーペリア</td><td>640010</td><td>セルカウントの場合</td></tr><tr><td>ノンベント 25cm2 フラスコ</td><td>コーニング</td><td>353014</td><td>寄生虫の培養用</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>バイオデザイン</td><td>1QIA</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>オリンパス セル Sens Dimension デスクトップ 2.3 ソフトウェア</td><td>オリープマス</td><td></td><td>画像処理</td></tr><tr><td>オリンパス FV 3000</td><td>オリンパス</td><td></td><td>共焦点イメージング用</td></tr><tr><td>OPTI-MEM培地</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>トランスフェクション用培地</td></tr><tr><td>pEGFP-N1ベクター 合成回路でクローニング</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>15070063</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン</td><td>MERCK</td><td>764965</td>トランス<td>フェクション用</td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>フィッシャー科学</td><td>YBP364500</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー Scientific</td><td>BP366</td><td>緩衝液 /試薬調製</td></tr><tr><td>リン酸カリウム モノベーシック</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>緩衝液 /試薬調製</td></tr><tr><td>電源パック</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>標準</td></tr><tr><td>生物部品のAGE登録</td>用 <td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>合成回路の構築用</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>宝</td><td>38220090</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>用 RNase A</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>12091021</td><td>バッファー/試薬調製</td></tr><tr><td>ロズウェルパーク記念研究所 ミディアム</td><td>国立細胞科学</td><td></td>センター <td>寄生虫の培養用</td></tr><tr><td>シェイカーインキュベーター</td><td>REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>培養用 E.coli</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15895</td><td>緩衝液/試薬調製</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性</td><td>シグマ</td><td>S5136</td><td>緩衝液/試薬準備</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>プラスミド濃度の推定</td></tr><tr><td>スピンウィン</td><td>Trason</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne plus リアルタイムPCRシステム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>272006777</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>StepOneソフトウェアバージョン2.3</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td>qRT-PCR用</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), no AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>Tinker 細胞</td><td></td><td></td><td>合成回路の構築とシミュレーション</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA ラダー</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>For AGE</td></tr><tr><td>トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン塩酸塩</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>バッファー/試薬調製</td></tr><tr><td>トリス-酢酸-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>バッファー/試薬調製</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>細胞数用</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>制限酵素</td></tr></tbody></table>

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

免疫代謝は、リーシュマニア症の進行における極めて重要な決定要因です。合成生物学に基づくアプローチは、リーシュマニア症を引き起こす宿主関連因子を標的とした治療介入への一歩として、大きな注目を集めています。合成生物学では、遺伝子構成要素を直交的かつモジュール的に操作して、生物学的システムを正確に調節し、細胞に新たな機能を付与します。本研究では、細胞内 リーシュマニア 原虫の排除を促進する治療薬としてコハク酸デヒドロゲナーゼを送達することを目的とした、誘導性テトラサイクリン制御(TetON)ベースの合成回路開発のための系統的パイプラインの解明を目指した。概説されているプロトコルは、合成回路の設計とその後の検証を説明しています。提案された戦略は、送達ビヒクルとしてプラスミドバックボーンに合成回路を組み込むことにも焦点を当てています。さらに、合成回路の送達にポリプレックスベースのナノ粒子を用いた送達装置をマウスマクロファージ細胞株に用い、細胞形態を損なうことなく使用しました。トランスフェクションした細胞を選抜し、合成回路発現に最適な誘導濃度を決定するための方法の標準化が行われました。観察により、トランスフェクションされた細胞では、感染した細胞と比較して、細胞内寄生虫の負荷が明らかに減少していることが明らかになりました。炎症誘発性サイトカインは、寄生虫の排除を促進するメカニズムとして、トランスフェクションおよび誘導された合成回路細胞で感染後に発現されました。このことは、合成生物学に基づく方法が、疾患の進行に関連する宿主因子を標的とすることにより、リーシュマニア症における強力なアプローチであることを強調しています。

合成回路を発現するための合成回路を形成する遺伝子部分の配置を図1Aに示す(図1A)。対応するパーツは、pEGFP-N1ベクターに直交的かつモジュール的にクローニングされました( 図1B)。合成回路のシミュレーションにより、SDHAとテトラサイクリンリプレッサーの両方で振動ダイナミクスが明らかになりました。この観察結果は、周期的な波動関数によって特徴付けられる相互表現パターンを示唆しています。SDHA濃度の増加はドキシサイクリンの誘導に起因する可能性がありますが、TetRの発現はドキシサイクリンのレベルの低下に起因する可能性があります(図1C)。SDHAとTetRの誘導性振動発現がin silicoで観察されたことを踏まえて、pEGFP-N1プラスミドベクターを介した合成回路の送達戦略が設計され、実施されました。
この研究で同定されたiGEMのパーツには、TetOのBBa_K1493803、Kozak配列のBBa_K4344028、TetRのBBa_C0040、P2AのBBa_K1537016がそれぞれ含まれています。SDHAのNCBIアクセッションIDはNM_025848です。これらの部品を組み立てて、合計1317塩基対に及ぶドキシサイクリン誘導性TetON合成回路を構築しました(補足ファイル1)。TetOはDNA調節因子として機能するため、その配列は翻訳されませんでした。SDHAの下流に位置する、5' TetRからP2Aの3'末端まで伸びるKozak配列の下流の配列を、翻訳の in silico 検証のために選択しました。観察の結果、内部終止コドンが存在しないことが明らかになり、配列全長にわたって翻訳が途切れることがなかった(補足ファイル2)。1317 bpからなる合成回路の制御部分は、EGFPの5'上流にあるNotI制限部位とXhoI制限部位の間に挿入されました(図1B)。シーケンシングの結果は、インサート配列がプラスミドにクローニングされたことを強調しています(補足ファイル3)。
大腸菌DH5α株への免疫代謝回路の導入により、細菌の形質転換中に選択的マーカーとして使用される抗生物質であるカナマイシンに対する耐性を示す形質転換コロニーが増殖しました。選択プレート上の形質転換コロニーの豊富な存在は高かったため、コンピテントセルは形質転換の可能性が高いことを示し、利用された形質転換プロトコルの効率を示しています(図1D)。
プラスミドの単離のために、単一のコロニーを単離し、カナマイシンを添加した10mLのLBに播種しました。10 mLの培養から得られるプラスミド収量を 表1に詳述します。この手順では、プラスミド単離の標準的な方法を採用しました。緩衝液はプラスミド単離の前日に新たに調製し、インキュベーション条件を最適化してプラスミド収量を最大化しました。得られたプラスミド濃度は1μg/μLを超え、260/280および260/230の比率はそれぞれ1.8および2.0を超えました。これらの知見は、単離されたプラスミドが高純度であり、タンパク質、EDTA、炭水化物、フェノールなどの汚染物質がなかったことを示しています。
分離された合成回路の電気泳動移動度シフトを評価しました。制限酵素は、合成回路が挿入された制限部位であるNotIおよびXhoI制限酵素を使用して行われました。1%アガロースゲルでは2つのバンドが観察され、1つは1500 bp付近で、もう1つは4 kbから5 kbの間で観察されました。チップサイズが1317 bpであることを考えると、1500 bpのバンドはインサートに対応している可能性があります。pEGFP-N1ベクターのサイズは4.7kbです。したがって、5kb付近のバンドはpEGFP-N1ベクターと推定されます。その結果、完全で無傷の合成回路が送達ベクトル内に存在していたという推論が導き出されました。さらに、未消化のインタクト合成回路について約 6 kb のバンドが検出され、pEGFP-N1 ベクターがプラスミドベクター内に約 1.3 kb のインサートを保持していることが示されました(図 1E)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> 図1:合成回路の設計と検証 (A)遺伝子部品と制御コンポーネントの組み立てによる合成回路の表現。(B) SDHAとTetRの周期的発現を100時間単位で示した決定論的シミュレーショングラフ。(C)カナマイシンに耐性のある 大腸菌 DH5αの合成回路形質転換コロニー。単位は決定論的シミュレーションであるため、100 倍単位です。(D)NotIおよびXhoI制限酵素を使用したインタクトおよび制限消化合成回路のアガロースゲル電気泳動。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>プラスミドの濃度(μg/mL)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>表1:プラスミド単離後に得られた合成回路コンストラクトの収率。 この表は、プラスミドの濃度をμg/mLで示し、その比率を260/280および260/230に示しています。
対照細胞および感染細胞では、観察された蛍光強度はGFPに対して低かった。しかし、プラスミドとPEIを1:1の比率で500 μg/mL G418でトランスフェクションし、1 μg/μL DOXで誘導した合成回路のトランスフェクションでは、IMT細胞で高いGFP発現が誘導されることが観察されました。6時間IMTI細胞では、GFP発現も有意に高かったが、GFP発現はIMTサンプルよりも低かった(図2A、B)。さらに、12時間IMTI、18時間IMTI、および24時間IMTIサンプルでGFP発現の増加が観察されました。この増加は、感染時間の増加によるものかもしれないが、これは、居住型寄生虫17によるマクロファージの代謝変化の増加を誘発した可能性がある。細胞内SDHAレベルは、感染時間の増加により影響を受ける可能性がある18。これらのIMTIサンプルにdoxを添加すると、合成回路を介したSDHAレベルが上昇し、SDHAの発現が増加した可能性があります。
DAPI染色は、マクロファージ中の居住性寄生虫の数を同定するために行われました。6時間 L.メジャー 感染マクロファージでは、観察された細胞内寄生虫の数はマクロファージあたり6細胞であり、マクロファージあたり1〜2個の細胞内寄生虫を持っていた6時間IMTIサンプルと比較して高かった。トランスフェクションおよびドックス導入後、感染の異なる時点で細胞内寄生虫負荷の有意な減少が観察されました(図2C)。観察結果は、合成回路がSDHA発現を刺激することにより寄生虫除去効果を誘発した可能性があることを示唆しました。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> 図2:共焦点レーザー走査型顕微鏡。 コントロール、感染、IMT、および IMTI サンプルの画像。(A)コントロール、6時間感染およびIMT、6時間IMTIの場合は20μm、12時間IMTIの場合は10μm、18時間IMTI、24時間IMTIの場合はそれぞれ50μmのスケールバーを使用したすべての実験サンプルでのGFPの発現分析。使用されたチャネルは、DIC、DAPI、GFP、およびすべてのチャネルのマージされたイメージでした。(B)GFP発現のすべての実験サンプル（n = 3）（p&lt;0.05は有意とみなされる）のテューキー補正検定による一元配置ANOVAエラーバーは標準偏差を表します。(C)Tukeyの補正試験による一元配置ANOVAは、(A)(n = 3)のサンプルについて、100個のマクロファージ細胞における寄生虫負荷の分析を行いました(p &lt; 0.05は有意であると考えられます)。エラーバーは標準偏差を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
すべてのサンプルの培地中のIL-10およびIL-12レベルを検出したところ、IL-10およびIL-12の濃度は感染後6時間で最も高く、感染後24時間後にサイトカインレベルがダウンレギュレーションされることが明らかになりました。IL-10 と IL-12 のレベルには、合成回路のトランスフェクションと誘導による有意差はありませんでした。また、IMTI時点サンプルでは、IL-10レベルとIL-12レベルに有意差はありませんでした(図3)。6時間感染したサンプルは、IL-10とIL-12の発現を示すことがすでに報告されています19,20、IL-10とIL-12の有意でない違いを観察したことから、合成回路が他のサイトカインに及ぼす影響を調査することになりました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> 図3:IL-10およびIL-12のELISAにより、異なるサンプルの培地中の分泌レベルを同定。 サンプル(n = 2)には、コントロール、6時間感染、24時間感染、IMT、6時間IMTI、12時間IMTI、18時間IMTI、24時間IMTIが含まれます。Tukeyの補正テスト分析による二元配置ANOVAを実行しました(p &lt;.05は有意であると考えられます)。エラーバーは標準偏差を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
感染した6時間、IMT、および24時間のIMTIサンプルでTNF-α、IFN-γ、およびTGF-βの転写レベルを検出したところ、感染およびIMTサンプルと比較して、24時間IMTIサンプルでTNF-αが2.5倍に有意に増加したことが明らかになりました(図4)。24時間のIMTIサンプルでは、感染サンプルやIMTサンプルと比較して、IFN-γレベルが35倍に増加したことが観察されました。TGF-βレベルは、24時間IMTIサンプルで1.5倍まで有意なアップレギュレーションを示したものの、TNF-αおよびIFN-γと比較して相対的な倍率変化は低く、24時間IMTIサンプルでは炎症誘発性サイトカインが有意にアップレギュレーションされていることを示唆しています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> 図4:サイトカインのqRT-PCR解析(A)TNF-α、(B)IFN-γ、(C)TGF-βの6時間感染、IMTおよび24時間IMTIサンプル(n = 2)。テューキーの補正検定による一元配置ANOVAを実施しました(p &lt; 0.05は有意であると考えられます)。エラーバーは標準偏差を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:遺伝子部分の塩基配列が組み立てられて合成回路を形成した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:TetR、P2A、SDHAを発現する合成回路の翻訳配列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:pEGFP-N1プラスミドにおけるクローニング合成回路のシーケンシング結果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、テトラサイクリン制御ベースの誘導合成回路を設計、構築、および提供するためのプロトコルが提示されます。寄生虫の除去とサイトカイン発現に対する合成回路の影響は、提示されたパイプラインをチャネリングすることで研究できます。このプロトコルは、感染症における合成回路ベースの治療薬を研究する研究者に関連しています。

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

単球は、活性化時に解糖代謝に依存する人間の自然免疫系の不可欠な構成要素です。新鮮な全血中の全単球および単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを測定するためのフローサイトメトリープロトコルについて説明します。...

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

このプロトコルは、 リステリア・モノサイトゲネスのEGD株と（リステリア菌）を C57BL / 6Jマウスに接種すると、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT（NKT）細胞によるインターフェロンγ（IFN-γ）反応を測定する方法を説明しますそして、適応Tは、感染後のリンパ球。このプロトコルは、病原体の改変されたLD 50用量での感染後のマウスの生存の研究を実施する方法について説明します。...

と実験感染<em&gt;リステリア菌</em&gt;ホストインターフェロンγ応答を研究するためのモデルとして、

このプロトコルは、世代のためと麻疹ウイルスの例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコードを使用して免疫の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの体内における性状 ex 詳細なワークフローを説明します。アプリケーションと他のベクトルのプラットフォームや遺伝子への適応は、臨床的翻訳の新規 immunovirotherapeutics...

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)-翻訳免疫腫瘍学研究のためのヒトヒト異種移植片マウスモデルについて説明する。このプロトコルは、I-O療法評価のための同様のモデルを確立し、特徴付けるための一般的なガイドラインとして役立つ可能性があります。...

ヒト末梢血単核細胞(PBMC)移植型ヒト型異物移植モデル翻訳免疫腫瘍学(I-O)研究

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin...

in vitro腫瘍微小環境における免疫応答を解剖するためのマイクロ流体共培養モデル

全血ベースのイムノアッセイは、診断および研究目的で抗原特異的免疫を分析するための簡単でリソース効率の高いツールを提供します。この記事では、真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の包括的な分析のための、二重共刺激による最適化された全血ベースのプロトコルを提供します。これには、小児患者および小動物向けの少量バージョンが含まれます。...

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

本プロトコルは、前処理された腫瘍細胞との同種共培養システムにおけるヒトT細胞刺激の ex vivo...

前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析

この記事では、細胞の自己組織化による細胞由来の組織のリングを作成するには、汎用的な方法を概説します。平滑筋細胞は、リング状のアガロース井戸の集合体と7日以内に強固な3次元（3D）の組織を形成するために契約に播種。ミリスケールの組織のリングは機械的なテストに資するものであり、組織の組み立てのためのビルディングブロックとして機能する。...

生体力学的解析と組織工学のための細胞由来の組織のリングを製作する監督セルラーセルフアセンブリ

このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています...

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

学ぶテトラサイクリン制御型合成回路の設計・導入プロトコル。Leishmania major感染における免疫代謝を探索し、寄生虫排除とサイトカイン発現の調節メカニズムを解明する革新的な宿主指向療法アプローチを発見する。

進化する宿主指向療法のための感染における免疫代謝回路

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