Name: 小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 学ぼう、ウシ小腸および大腸オルガノイド由来の2D単分子膜を作製する手法を。上皮バリア機能の評価法も含み、宿主病原体相互作用の研究に応用可能なモデルを確立します。

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この研究は、国立衛生研究所所長室(YMAのK01OD030515およびR21OD031903)およびWSU VCSレジデントおよび大学院生研究助成金(GDDへ)によって部分的に支援されました。著者は、ドナー牛を提供してくれた参加食肉処理場に感謝します。

腸内陰窩は、地元の食肉処理場で調達された余剰の腸内標本から調達され、ドナーの信号は 補足表1に記載されています。オルガノイドは、屠殺場で人道的に安楽死させた動物に由来する組織を用いて作製したものであり、この研究のためだけに動物を調達したわけではありません。したがって、この研究は IACUC レビューから免除され、倫理ステートメントは適用されません。
1. オルガノイド由来の2D単分子膜培養のための細胞培養インサートへのECMコーティング
注:すべての手順は、バイオセーフティキャビネット内の滅菌材料と無菌技術を使用して実行されます。すべての試薬は、特に明記されていない限り、手順全体を通して氷上に保管されます。
<ol><li>0.33 cm2 細胞培養インサート各100 μLをコーティングするために、基礎培地と2%(v/v)ECMベースのハイドロゲルをマイクロチューブ内で完全に混合して、ECMを調製します。</li>
	<li>滅菌した鉗子でパッケージから個々の細胞培養インサートを取り出し、24ウェルの透明で平底の細胞培養プレートのウェルに個別に入れます。</li>
	<li>ステップ1.1で調製したECMコーティング100μLを、ステップ1.2で調製した各細胞培養インサートのアピカルチャンバーに塗布します。</li>
	<li>蓋を元に戻し、コーティングされた細胞培養インサートを含む細胞培養プレートを加湿インキュベーターで37°Cおよび5%CO2 で1時間インキュベートします。<ol><li>回腸オルガノイド細胞の場合、インサートは1時間のインキュベーション後にすぐに使用できます。直腸オルガノイド細胞の場合、1時間のインキュベーション後、ECMコーティングを直腸単層培養培地に交換し、一晩インキュベートします(表1)。TEER測定を実行する場合は、ブランクコントロール用の追加の細胞培養インサートを準備します。</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>回腸</td>
			<td>直腸</td>
		</tr><tr><td>ECMコーティングのインキュベーション時間</td>
			<td>1時間</td>
			<td>1 時間後に 単層培養培地で一晩</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">サプリメント オルガノイド培地</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>CHIR99021</td>
		</tr><tr><td>LY2157299</td>
			<td>LY2157299</td>
		</tr><tr><td>Y-27632</td>
			<td>Y-27632</td>
		</tr><tr><td>ウシ胎児血清</td>
			<td>ウシ胎児血清</td>
		</tr><tr><td>細胞播種密度(細胞/ウェル)</td>
			<td>5×105</td>
			<td>3×105</td>
		</tr></tbody></table>表1:成体ウシ回腸オルガノイドおよび直腸オルガノイドに由来する2D単分子膜を作成するための最適化されたプロトコルの要約。
2. ウシ回腸オルガノイドおよび/または直腸オルガノイド細胞の播種と2D単層培養
注:このセクションで説明するプロトコルは、記載されている技術5を使用して48ウェルプレート上で培養および維持されたウシ回腸および直腸オルガノイドを使用します。最適な結果を得るには、最初の樹立から3回以上経過し、直近の継代から3日以上経過して培養された、安定して維持されたオルガノイドを使用することが推奨されます。
<ol><li>成熟オルガノイドを含むECMベースのハイドロゲルドームを乱さずに、真空システムに取り付けられた使い捨てガラスパスツールピペットを使用してオルガノイド培養培地を取り出し、ウェルあたり300 μLの氷冷ECM解重合溶液を加えます。4°Cで少なくとも1時間インキュベートします。 注:あるいは、ECM解重合溶液を添加した後、ECMベースのハイドロゲルドームを含むオルガノイドを機械的に破壊し、4°Cでインキュベートする前に15mLのコニカルチューブに懸濁液を回収します。 この方法は、2D単層培養に使用しないオルガノイドを同じプレート上で同時に培養する場合に推奨されます。オルガノイド培養の密度は、細胞培養インサートへの最適な播種に必要なオルガノイド培養ウェルの数に大きく影響します。<ol><li>高密度オルガノイド培養(補足図1A)の場合、直腸細胞培養インサートは1:1〜1:2の範囲の播種比を使用します。これは、1つの培養ウェルで1〜2ウェルの播種が可能であることを意味します。回腸の場合は、比率を1:1に保ちます。対照的に、低密度の培養(補足図1B)では、より多くの培養ウェルが必要です。1つの直腸細胞培養インサート(3-4:1の比率)には3-4の直腸オルガノイド培養ウェルを使用し、1つの回腸細胞培養インサート(4-5:1の比率)には4-5回の回腸オルガノイド培養ウェルを使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>ECMベースのハイドロゲルが完全に溶解するかどうかを目視検査し、オルガノイド懸濁液を15 mLのコニカルチューブに回収します。</li>
	<li>オルガノイドを200 x g 、4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを10 μM Y-27632を添加した組換え細胞解離酵素溶液1 mLに再懸濁します。</li>
	<li>オルガノイド懸濁液を37°Cの水浴で10分間インキュベートし、3〜5秒を断続的に振とうし、2〜3分ごとに渦を巻き起こして、効果的なオルガノイドの解離を促進します。</li>
	<li>酵素消化後、5 mLの基礎培地を加え、P1000マイクロピペットで積極的にピペットでピペット操作を行い、オルガノイドをさらに破壊して単一細胞にします。懸濁液にオルガノイドの塊がないか検査し、それでも視覚的に確認できる場合は、ピペッティングを繰り返して単一細胞の解離を促進します。</li>
	<li>50 mLのコニカルチューブと70 μmのセルストレーナーを調製します。1〜2mLの基礎培地を塗布して、ストレーナーを事前に濡らします。</li>
	<li>ストレーナを介して細胞懸濁液をろ過し、残留ECMベースのヒドロゲル破片や大きな細胞塊を除去します。元の15 mLチューブと70 μmセルストレーナーを、さらに10 mLの基礎培地ですすいでください。 注:細胞懸濁液がストレーナを容易に通過しない場合は、オルガノイドの不完全な解離を示している可能性があります。回収した細胞懸濁液を同じ70 μmの細胞ストレーナに再通過させることを試みることができます。追加の酵素的または機械的な混乱が必要になる場合があります。.</li>
	<li>ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞を適切な量の基礎培地で再懸濁して細胞数を計数します。</li>
	<li>トリパンブルー染色後に血球計算盤で生細胞をカウントし、収集された細胞の総数を計算します。</li>
	<li>ペレット単細胞懸濁液を200 x g および4°Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞をそれぞれの単層培養培地で適切な播種密度に再懸濁します(表1)。<ol><li>回腸オルガノイド細胞については、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632、および20%ウシ胎児血清(FBS)を添加したオルガノイド培地である200 μLの回腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり5 x 105細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を2.5 x 106細胞/mLの濃度に再懸濁します。</li>
		<li>直腸オルガノイド細胞の場合、100 nM CHIR99021、500 nM LY2157299、10 μM Y-27632を添加したオルガノイド培養培地である200 μLの直腸単層培養培地で、細胞培養インサートあたり3 x 105細胞/mLの播種密度を達成するために、細胞を1.5 x 106</li></ol></li><li><li><li><li></li><li></ol><ol><li><li><li> </li><li> </li><li> </li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig01large.jpg" target="_blank"></a><ol><li> </li><li><li><li><li><li><li></li><li><li><li><li> </li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67010/67010eq01.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol><ol><li><li><li><li><li><li> </li><li><li> </li><li><li><li></ol>

ウシ腸オルガノイドからの2D単層培養物の開発

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</ol>

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

腸管の健康は、牛の生産性と全体的な健康の両方にとって最優先事項です16。オルガノイド由来の2D単分子膜技術を活用することで、科学者は in vitro 環境内でウシ腸上皮の複雑な構造をより正確に模倣できるようになりました5。この革新的なアプローチは、多細胞系譜を含む腸内壁の多様な細胞組成を再現するだけでなく、粘液分泌や微絨毛の存在など、腸の生理学と病理を理解するために不可欠な主要な機能特性も捉えます3。回腸と直腸のセグメントに合わせた培養プロトコルの開発により、ウシの腸の健康を研究する能力を大幅に向上させる高度なプラットフォームが生まれました。この洗練されたアプローチにより、人獣共通感染症の病原体とウシの腸内環境との間の相互作用についての詳細な調査が可能になります。ウシの腸内生態系のユニークな側面を in vitro で密接に再現し、研究する能力は、家畜の健康を改善し、人獣共通感染症の蔓延を緩和するための的を絞った戦略の開発に向けた大きな前進です。
しかし、ウシ腸オルガノイドを用いた2次元単分子膜の開発を成功させるためには、オルガノイドとその解離した単一細胞の両方の健康と活力を維持することが重要です。慎重な取り扱いとストレスの最小化は、オルガノイドの効果的な増殖とその後の機能的な単分子膜の作製に不可欠な細胞の完全性と機能を維持するために最も重要です。さらに、均一な単分子膜を達成するには、大きな塊を形成せずにオルガノイドを単一細胞にうまく解離させることが必要です。このような凝集体は、細胞の分布を乱し、単分子膜の構造を損なう可能性があります。したがって、スムーズな解離のための精密な技術を採用することが重要であり、その結果、一貫した単一細胞懸濁液が得られます。さらに、細胞接着時や過剰な非接着性細胞を洗い流す際の障害を最小限に抑えることが有益になります。このアプローチは、3D形態形成の潜在的な問題に対処するために特に重要であり、単層の全体的な品質を向上させます。
生物学的起源のECMベースのハイドロゲルの注目すべき課題は、組成のバッチ間変動です17。これは、記載されているプロトコルや材料では観察されませんでしたが、ECM組成のバッチ間のばらつきは、単分子膜の開発を成功させるための課題となる可能性があります。ECM製品、ブランド、またはロット番号が変更されたことにより単層形成が損なわれる場合、細胞培養インサートのコーティングに必要な適切なECM濃度を決定するための最適化ステップが必要になることがあります。
さらに、変更を加える前に培地を室温に調整することは、熱衝撃を軽減し、細胞の健康を保護し、オルガノイド培養と単層培養の両方の品質を維持するのに役立つ重要なステップです。また、形成中およびその後のアッセイ中に単分子膜の完全性を維持するためには、穏やかな洗浄方法が最も重要であり、混乱を避けることで結果の不正確さを防ぐことができます。PBSをハンク平衡塩溶液(HBSS)に置き換えると、パラセル透過性アッセイなど、PBSへの反復洗浄または長時間の曝露中に問題となった単層の剥離を最小限に抑えるのに役立つと思われました。最後に、腸管のさまざまなセグメント(回腸や直腸など)の細胞の特定のニーズに合わせて培地を調整することは、 in vivo 条件を正確に再現するために不可欠です。この特異性により、最適な細胞の健康と機能が確保され、牛の腸の生理機能や病原体との相互作用の正確なモデリングが容易になり、オルガノイド研究におけるこれらの重要なステップが浮き彫りになります。
細胞の取り扱いを丁寧に行うだけでなく、細胞計数とTEER測定に関連する優れた技術的能力を構築することは、機能する2D単分子膜の開発を成功させるために重要です。細胞の過大カウントまたは過少カウントに起因する播種密度が低すぎる場合と高すぎる場合、それぞれ単層の成長が損なわれる可能性があります。細胞数を慎重に検討し、不正確な播種密度が疑われる場合は適切な播種密度を確保することをお勧めします。さらに、TEER測定技術が不十分な場合、電極に不注意な傷が付くことで単層が破壊される可能性があります。電極を頂端チャンバーに慎重に導入し、膜表面に対する垂直方向を維持することに特に注意を払うことで、単分子膜への偶発的な損傷のリスクを軽減できる可能性があります。
ここに記載されている傍細胞透過性アッセイの方法は、以前のプロトコル18から適応されています。報告されたプロトコルの変更には、120 分を超える複数のサンプリングや、サンプリングされたアリコートを等量の PBS に置き換えることが含まれ、結果の精度と信頼性を向上させるために行われます。チャンバー内の総容積を維持することは、浸透圧バランスの維持、細胞の完全性の確保、正確な透過性評価に不可欠な濃度勾配の維持、輸送速度に影響を与える可能性のある静水圧の変化の防止など、いくつかの理由で重要です。サンプリングされた蛍光トレーサー含有PBSの量と同等の新鮮なPBSを基底外側チャンバーに補充するこの方法は、これらの条件を維持し、単層透過性の正確で有意義な評価を可能にするために極めて重要です。傍細胞透過性アッセイは、単層を通るトレーサー分子の動きを直接評価することにより、TEER測定を補完する役割を果たします。さらに、様々な実験室間でTEER値を比較することは、関連する洞察をもたらさないかもしれない、なぜなら、これらの値は、温度や細胞が培養される特定の条件、例えば細胞タイプ、継代数、および培養培地の組成など、多数の変数によって影響を受ける可能性があるからである19。パラセルラー透過性アッセイは、上皮バリア20内の接着体およびタイトジャンクションの効果的な発現の機能的なin vitro評価を提供する。
3Dオルガノイドから2D単分子膜の開発は、培養技術の大きな進歩を表していますが、2D単分子膜に関連する制限を認識することが重要です。大きな欠点の1つは、これが静的な培養システムのままであり、 in vivo 環境で見られる動的な刺激を欠いていることです。さらに、培養システム内の酸素含有量の変更は、蓋付きの培養プレートを含むオープンセットアップのため、嫌気性細菌との長期共培養には適していないため、課題があります。これらの制限は、より制御された生理学的に関連性のある環境を提供するマイクロ流体システム21のような、よりダイナミックな培養プラットフォームを採用することによって対処できる可能性がある。さらに、現在の培養条件は幹細胞の成長維持に有益な栄養素が豊富である一方で、上皮細胞の生理的分化を誘導するには最適ではない可能性があることを認識することが重要です。この不一致は、 in vivo 条件を厳密に模倣し、分化プロセスをサポートするために、将来の研究で最適化する必要性を浮き彫りにしています。これらの制限に対処し、これらのアプローチを洗練させることで、オルガノイド培養技術の有用性と適用性が向上し、 in vitroでの消化管の複雑なダイナミクスと相互作用の再現に近づきます。
ウシの回腸組織および直腸組織から2D単分子膜を生成するためのプロトコルは、研究者に小腸上皮と大腸上皮の両方の管腔界面の貴重なin vitroモデルを提供します。このモデルは、基本的な動物栄養学研究、特にさまざまな条件下で栄養素がどのように吸収されるかを調べるための応用に、大きな可能性を開きます。注目すべき関心領域は、リーキーガット症候群の調査であり、しばしば食事の変化と極端な環境温度によって引き起こされる胃腸透過性の異常な増加を特徴とする22,23。さらに、このモデルは、腸内細菌叢とその宿主との間の複雑な相互作用を調査するための重要なツールとして機能します。これにより、共生微生物が宿主生物の健康にどのように影響するかを研究することができ、獣医学および医学の重要な側面に取り組んでいます1,24。さらに、ヒトの食品媒介性病原体は、牛の腸8,9,25の異なるセグメントで共生として頻繁に発見され、このプロトコルは、これらの人獣共通感染症の病原体がそれぞれのニッチで繁栄することを可能にする特定の条件の詳細な研究を可能にします。
この研究を通じて、直腸オルガノイド由来モノローヤと回腸オルガノイド由来の単分子膜は、開発を成功させるために異なる条件が必要であることが観察されました。具体的には、直腸オルガノイド由来の単分子膜を、基礎培地中の2% ECMベースのハイドロゲルで調製した細胞培養インサートに最初に播種したところ、大きな穴と細胞の脱落が認められました。この問題は、特殊な直腸単分子膜培地に切り替え、インキュベーション期間を播種前の一晩に延長することで解決されましたが、回腸オルガノイド由来の単分子膜は、より短い調製プロトコルを使用して開発に成功しました。さらに、培地へのCHIR99021の添加は、直腸単分子膜26 の確立を一貫して改善したが、回腸単分子膜27には必要ではなかった。さらに、回腸単層は、直腸オルガノイドと比較して、開発を成功させるためにより高い細胞密度を必要としました27。これらの最適化された条件(表1)は、耐性バリアの完全性を維持する単分子膜を繰り返し開発しており、特定の腸セグメントに合わせて培養条件を調整することの重要性を強調しています。
これらの研究には、 in vivo 腸の多細胞系譜の複雑さを正確に反映するモデルへのアクセスが重要です。これにより、研究者は腸環境の自然条件を厳密に模倣することができ、実験のより信頼性の高い基盤を提供することができます。このプロトコルにより、研究者は研究能力を強化する堅牢なモデルを装備し、研究分野での画期的な発見につながる可能性があります。このアプローチは、腸の健康と病気の理解に貢献するだけでなく、家畜管理と食品の安全性を改善するための戦略の開発にも役立ちます。

腸管オルガノイドとして知られる3次元(3D)培養物での腸上皮幹細胞の培養は、腸の機能、栄養、および病原体との相互作用を調査するためのin vitro技術における大きな進歩を示しています1,2。これらのオルガノイドは、自己複製し、さまざまな腸細胞系統を包含する3D形成に組織化することにより、in vivo腸上皮の複雑な構造を模倣します3。この特徴は、腸内生物学の理解を前進させる彼らの大きな可能性を浮き彫りにしています。
腸内オルガノイド技術を家畜に応用することへの関心が高まっているため、培養と維持技術の改良が必要とされている4,5。この技術の関連性は、家畜の腸内健康の研究に潜在的な影響を与えることで強調されており、これは家畜の生産性に重要な役割を果たし、その結果、動物福祉と運用コストに影響を与えることにより、食用動物産業の経済性に重要な役割を果たします6,7。具体的には、サルモネラ属菌や大腸菌(大腸菌)O157:H78などの人獣共通感染症の腸内病原体の貯蔵庫としての役割を考えると、ウシの腸内オルガノイド培養を使用して腸内オルガノイド培養を使用することが最も重要です。これらの病原体は腸の特定の部分に局在しているため、研究の精度を高めるためには、腸内オルガノイド培養法を腸内セグメントごとに区別することが不可欠です9。
腸オルガノイドの研究における大きな障害は、上皮細胞の頂端表面へのアクセスが制限されていることである10。細胞外マトリックス(ECM)内で培養すると、細胞は自然に向きを変え、基底面が外側を向き、頂端面が内側を向くようになる10。この課題に対処するために、3Dオルガノイドを単一細胞に解離し、それらを半透過性の細胞培養インサートに播種する方法が提示されています。このセットアップにより、頂端面と基底外側コンパートメントとの間にインターフェースが確立されます。このプロトコルは、ウシ腸オルガノイドに由来する細胞が、経上皮電気抵抗(TEER)測定および傍細胞透過性アッセイによって証明されるように、コヒーレントな2D単層を形成できることを実証しています。さらに、オルガノイド由来の2D単層細胞におけるブラシ境界とタイトジャンクションによる細胞極性の発達は、免疫蛍光法と電子顕微鏡法によって確認されており、 これはin vivo 腸上皮の特性を反映しています。
この研究では、回腸は小腸管を表し、直腸は大腸管を意味します。これらの選択は、回腸11を転座させることができるサルモネラ属菌や、主に牛の直腸9にコロニーを形成することが知られている大腸菌O157:H7などの関連する腸管病原体に基づいています。これらの特定の腸セグメントの選択は、研究の精度を高めるために腸内オルガノイド培養法を腸領域に合わせて調整する必要性を浮き彫りにしています。これらの方法は、これらの腸セグメントからオルガノイド由来の2D単層界面を効果的に培養する手順を詳しく説明し、牛の腸の健康、病原体感染、および腸内細菌叢と宿主との間の相互作用を調査するための堅牢なモデルを提供します。

<table><tbody><tr><td>Basal Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>n/a</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamine (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>1X</td></tr><tr><td>オルガノイド培養培地 (基礎培地へのサプリメント)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788-5MG</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50X)</td><td>Gibco</td><td>17504-001</td><td>1X</td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.5MG</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>マウス Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>MP Biomedicals 194603</td><td></td><td>1 mM</td></tr><tr><td>N-2 MAX 培地サプリメント (100X)</td><td>R&D Systems</td><td>AR009</td><td>1X</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin Conditioned Medium</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10 vol/vol %</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td>100 &micro;g/mL</td></tr><tr><td>R-Spondin-1 コンディショニング ミディアム</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 vol/vol %</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-25MG</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>単層培養培地(オルガノイド培地のサプリメント)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046-5MG</td><td>2.5 &micro;M</td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>20 vol/vol %</td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2851-5MG</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>StemCellTechnologies</td><td>72308</td><td>10 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Mouse anti-E-cadherin</td><td>BD Biosciences</td><td>560061</td><td>1:200 希釈</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Cytiva</td><td>SH30574.02</td><td>2 w/vol %</td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>n/a</td></tr><tr><td>DAPI溶液(1 mg / mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>1:1000</td></tr>希釈<tr><td>DPBS(1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>n / a</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート&ndash;Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td>0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>マトリゲルマトリックス</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液 (4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J19943K2</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>SNA, EBL, Fluorescein Vector</td><td>Laboratories</td><td>FL-1301</td><td>1:100 希釈</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16046.AE</td><td>0.3 vol/vol %</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>VWR Life Science</td><td>K940-100ML</td><td>n/</td></tr><tr><td>aMaterials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 &micro;m Cell Culture Insert</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plate</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>48-well Cell Culture Plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;m 滅菌細胞ストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5910Ri</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>上皮電圧-オーム計</td><td>ミリポア</td><td>ミリセル ERS-2</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>倒立共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>SP8-X</td><td></td></tr><tr><td>倒立位相差顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>ズ DMi1</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバー ガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-540-B</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>SpecrtraMax i3x</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-034-486</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>iMed サイエンティフィック-</td><td></td><td>#11 炭素鋼</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>サイエンティフィックインダストリー</td>ズ <td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS X イメージングソフトウェア</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>LAS X 3.7.6.25997</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダーソフトウェア</td><td>Molecular Devces</td><td>SoftMax Pro 7.1.2</td><td></td></tr></tbody></table>

小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩

Advancements in Bovine Organoid Technology Using Small and Large Intestinal Monolayer Interfaces

消化器生理学とその疾患に関する知識の進歩は、in vivo腸組織を忠実に模倣する正確な種特異的なin vitroモデルの開発に大きく依存しています。これは、深刻な公衆衛生上のリスクをもたらす病原体の重要な貯蔵庫であるウシの宿主と病原体の相互作用を調査するために特に重要です。従来の3Dオルガノイドは、腸管上皮の頂端表面へのアクセスが限られており、2D単分子膜培養の出現によって克服されたハードルでした。オルガノイド細胞に由来するこれらの培養物は、よりアクセスしやすい研究のための露出した管腔表面を提供します。本研究では、ウシの小腸オルガノイドおよび大腸オルガノイドの細胞から2次元単層培養物を作製し維持するための詳細なプロトコールを紹介します。この方法には、経上皮電気抵抗および傍細胞透過性による膜の完全性を評価するためのプロトコルと、免疫細胞化学染色技術が含まれます。これらのプロトコルは、2Dウシ単層培養システムの確立と特性評価の基礎を築き、公衆衛生上重要な生物医学およびトランスレーショナル研究におけるこれらのメソッドアプリケーションの限界を押し広げます。この革新的なアプローチを採用することで、牛の腸生理学の正常な状態と病気の状態の両方を調べるための生理学的に適切なin vitroモデルの開発が可能になります。生物医学と農業の進歩への影響は深く、牛の腸疾患に対するより効果的な治療への道を開き、それによって動物福祉と食品の安全性の両方を向上させます。

このプロトコールは、小腸管および大腸管から堅牢なウシ腸オルガノイド由来の2D単分子膜を確実に生成し、 in vivo 腸上皮の複雑さをエミュレートします。この方法は、最適な条件で培養された健康な牛の腸管陰窩標本から開発された成熟オルガノイドを利用しています。興味深いことに、オルガノイド由来の2D単分子膜の成功および再現性のある条件は、腸のセグメントに固有です(表1)。このことは、関心のある腸の部分に最適化された培養技術を持つことの重要性を強調しています。
解離した成熟オルガノイドを細胞培養インサートに播種してから1日後に、2D単層が形成されたように見えました(図2A)。しかし、この最初の出現にもかかわらず、回腸単分子膜と直腸単分子膜の両方のTEER測定値は、この段階では低いままでした(図1C)。さらに、傍細胞透過性アッセイにより、単層は、培養のわずか1日後に、細胞層を横切って4 kDaのFITC-デキストラントレーサーを通過させることが明らかになりました(図1C)。培養3日目までに 、両方のタイプのオルガノイド由来2D単分子膜は有意な成熟を示し、TEER値の増加と4 kDaのFITC-デキストラントレーサーに対する耐性によって証明されました。この傾向は培養5日目まで続きました。
特に注目すべきは、種間の変動性であり、ウシオルガノイド由来の2D単層培養物のTEER値が、同様の条件下でのヒトおよびイヌの対応物と比較して低いにもかかわらず12,13,14,15、膜の完全性は損なわれていない。この結論は、透過性アッセイにおける単分子膜の適切な応答から導き出され、ウシサンプルのTEER値が低いことが必ずしもバリア機能の欠如を反映しているわけではないことを示唆しています。この完全性は、機能的な上皮バリアにとって重要であり、TEER測定と並行して透過性アッセイ結果を慎重に解釈することで効果的に実証されます。
走査型電子顕微鏡による2D単分子膜の頂端表面における細胞境界とよく発達した微絨毛の可視化、特殊な微小解剖学的構造の表示、回腸および直腸オルガノイド由来の2D単分子膜の成熟をさらに強化しました(図2B)。さらに、2D単分子膜の免疫蛍光染色により、回腸(図3A)および直腸(図3B)オルガノイド由来の2D単分子膜の両方に、頂端ブラシ境界、基底外側接着接合部、および粘液産生杯細胞の存在が確認されました。これらの結果は、開発された2D単分子膜が組成と形成が複雑であり、無傷の腸上皮の主要な特徴を発現するだけでなく、多系統の細胞集団で構成されていることを補強しています。
2D単分子膜の開発が成功するには、細胞のECMへの接着とコンフルエンスへの成長により、無傷の上皮層が作られます。特に、細胞培養インサートでのインキュベーション中のECM分布が不均一であったり、最適でない条件であったりすると、細胞層が部分的に剥離し、特にそのエッジに沿って顕著になることがあります(図4Ai)。この問題は、細胞が最適密度よりも高い密度で播種されている場合や、播種細胞が培養表面全体に均一に分布していない場合、オルガノイドが単一の細胞懸濁液に不完全に解離することに起因していることが多いため、さらに悪化します。このような不均一な分布は、単分子膜内にギャップが形成されたり、細胞培養インサート上の3D形態形成につながる可能性があります(図4Aii)。対照的に、細胞の播種不足は、予想される培養期間にわたって単層の発達が失敗または遅延する可能性もあり、2D単分子膜システムを利用する後続の研究の効率に不注意で影響を及ぼします(図4Aiii)。さらに、培養システムの汚染は、単分子膜内にギャップの形成にもつながり、培養の後の段階で一度形成されたコンフルエント単層を破壊する可能性があります(図4Aiv)。持続的なTEER値と傍細胞透過性応答は、前述の失敗の潜在的な原因がこれらのアッセイの前に遭遇していなかった場合でも、積極的な洗浄または取り扱い技術による細胞層の乱れによって影響を受ける可能性があります(図4B)。したがって、単分子膜の形成または破壊の慎重な細胞の取り扱いと評価は、トラブルシューティング戦略の効果的な適用を通じてオルガノイド由来の2D単分子膜の開発を成功させるために最も重要です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig02.jpg"> 図2:ウシ回腸および直腸オルガノイド由来の2D単分子膜の顕微鏡的特性評価 (A)細胞培養インサート上の培養1日目および3日目(D1およびD3)の2D単分子膜の代表的な位相コントラスト顕微鏡画像。スケールバー=100μm.(B)低倍率(左)と高倍率(右)の2D単分子膜の代表的な走査型電子顕微鏡画像。微絨毛を含む詳細な細胞表面構造は、回腸(上)と直腸(下)の両方の単層で評価できます。左スケールバー = 10 μm、右スケールバー = 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig03.jpg"> 図3:回腸オルガノイドおよび直腸オルガノイドに由来する2D単分子膜の免疫蛍光特性評価。 (A、B)パネル(A)は回腸、パネル(B)は直腸オルガノイドを示しています。左側では、F-アクチン繊維がファロイジン(赤)で強調表示されており、細胞骨格構造と頂端ブラシの境界形成を示しています。中央の画像は、E-カドヘリン(緑)でマークされた接着接合部の基底外側局在を捉えており、細胞間接着と単層の完全性を示しています。右側では、ムチン産生杯細胞の存在がSNA(緑)によって識別され、回腸単層におけるムチンの頂端分泌を示すzスタック画像があります。すべての画像にわたる核をDAPI(青)で対比染色しました。さらに、すべての画像にわたるzスタックイメージングは、培養インサート内の単一細胞層の形成をさらに示しています。スケールバー = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67010/67010fig04.jpg"> 図4:最適でない2D単分子膜形成の特性評価。 (A)(i)細胞培養インサートのエッジに沿った単層の部分的な剥離を示す代表的な位相コントラスト画像;(ii)3D伸長の発達および単分子膜内のギャップの形成。(iii)細胞の斑状の付着として指摘される最適な播種密度よりも低いため、単層形成が不完全または遅延する。(iv)一度形成された2D単層内に後の段階でギャップが形成され、汚染が疑われるためである可能性が高い。スケールバー = 100 μm. (B) TEER 測定値の低下と 3 日目以降の透過性プロファイルの上昇は、安定した機能的な上皮バリアを確立できなかったことを示しています。結果は、2 回のテクニカル反復による 1 回の実験からの平均±標準誤差(SEM)として示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/67010fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:ECMベースのヒドロゲルにおけるウシ腸オルガノイド培養の密度変動。 ECMベースのヒドロゲルで培養したウシ腸オルガノイド。(A)高密度および(B)低密度。スケールバー = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/R1.Suppl%20Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:要約された組織ドナーシグナル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67010/R1.Dykstra.JoVE.SupplTable1_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この研究は、オルガノイドからウシ腸の2D単分子膜を生成するためのプロトコルを提示し、宿主と病原体の相互作用を研究するためのアクセスを改善します。これには、膜の完全性と機能性を評価する方法が含まれており、牛の胃腸生理機能を模倣した in vitro モデルを進歩させています。このアプローチは、治療戦略の強化など、生物医学的および農業上の大きな利益を約束します。

Advancing knowledge of gastrointestinal physiology and its diseases critically depends on the development of precise, species-specific in vitro models ...

私たちの研究目標は、成体のウシの小腸オルガノイドと大腸オルガノイドに由来するステープル腸単層界面を生成するための堅牢な技術を確立することです。私たちは、確立された単分子膜内の機能的な上皮バリア形成を確認するために、マルチモーダル分析アプローチを採用しました。3次元モデルとは異なり、2D単分子膜は、宿主病原体の相互作用を研究するために重要な、露出したアクセス可能な管腔表面を提供します。これらの単層は、複数の細胞系譜を持つin vivo腸を反映しており、小腸および大腸のニッチなどの特定の腸切片の病原体を調査するためのカスタマイズされたプロトコルを提供します。私たちの研究では、ウシモールの細胞や大腸オルガノイドの細胞から2D単分子膜を作成し維持するための最適化された培養条件を特定しました。これらの単層内での機能的上皮バリアの形成を、経上皮電気登録者と傍細胞透過性アッセイ、および免疫細胞化学染色技術を使用して確認しました。私たちのプロトコルは、ウシの腸オルガノイド由来単層モデルの欠如に焦点を当てることで、研究のギャップに対処しました。これらのモデルはマウスとヒトで十分に研究されていますが、深刻な公衆衛生への影響を持つ腸内病原体の主要な貯蔵庫であるウシは十分に調査されていません。私たちの研究は、2Dウシ単層培養システムを確立し、特徴付けています。この革新的なツールにより、ウシの腸生理学の正常状態と疾患状態の調査が可能になり、公衆衛生上重要な生物医学研究やトランスレーショナル研究に応用できる可能性があります。

advancements-bovine-organoid-technology-using-small-large-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、文化人間 enteroid または colonoid 単分子膜細胞および生化学的レベルでホスト上皮細菌相互作用を研究するそのままバリア機能を持つプロトコルを提案する.

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ここでは、腸管バリア機能、透過性、および輸送を研究するためのヒトオルガノイド由来腸上皮単層の調製について述べる。オルガノイドは外部刺激に対する元の上皮組織応答を表すので、これらのモデルは細胞株の拡張性の利点と初代組織の関連性と複雑さを兼ね備えています。...

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。...

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

ここでは、凍結保存された上皮陰窩からブタ腸管3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルを記載する。また、3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜を確立し、上皮細胞の頂端側へのアクセスを可能にする方法についても説明します。...

凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

イヌ腸オルガノイドとGut-on-a-Chipマイクロ流体システムの統合により、ヒトの腸疾患に関連するトランスレーショナルモデルが提供されます。提示されたプロトコルは、腸の3D形態形成と動的 in vitro モデリングを可能にし、One...

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

エンテロイドは、組織生理学や病態生理学、医薬品開発、再生医療を研究するための新しいモデルとして浮上しています。ここでは、関連する組織細胞タイプとの共培養を可能にするウシ初代細胞2Dエンテロイド由来培養システムについて説明します。このモデルは、消化器研究のモデリングにトランスレーショナルな利点をもたらします。...

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

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呼吸リハビリテーションは、広く呼吸器疾患の管理で認識されている。成功した呼吸リハビリテーションへの鍵となる要素は、推奨運動トレーニングの遵守である。本プロトコルの目的は、連続データのトラッキング技術は、正確に所定の有酸素トレーニング強度に対する接着性を測定するために使用できる方法を記述することである。...

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