イメージングと電気生理学を組み合わせて、マウスの広がりの脱分極を視覚化および記録する
2024年10月4日
このプロトコルは、軽度の外傷性脳損傷後の成体マウスにおける脱分極の拡大を確実に検出するためのイメージングと電気生理学の組み合わせを示しています。
私たちの研究の範囲は、脳モデルを使用して、脱分極の拡大と軽度の外傷性脳損傷との関係を理解することです。私たちのグループらは最近、マウスの軽度の閉鎖頭蓋骨損傷で脱分極の広がりが起こることを示しました。一般的に使用されるin vivo電気生理学増幅器は、拡散する脱分極に関連するゆっくりとした細胞外シフトをフィルタリングするため、拡散する脱分極を検出することはほぼ不可能です。
このプロトコルの利点は、イメージングとin vivo電気生理学の両方を活用して、軽度の外傷性脳損傷後の広がる脱分極の有無を確認できることです。私たちは、MTBIに関連する急性行動、病理、および長期的な認知障害における脱分極の拡大の役割を理解し始めています。まず、麻酔をかけた動物を脳定位固定装置フレームに置き、加熱パッドを使用して動物の体温を維持します。
10番のメスの刃を使用して、吻側から尾側への正中線に沿って切開を行います。そしてすぐにシアノアクリレート接着剤を切開部に塗布します。次に、皮膚を横に広げて頭蓋骨を露出させます。
頭蓋骨にシアノアクリレート接着剤を1〜2滴追加して、保護を強化します。接着剤が乾燥している間に、滅菌手術用ハサミを使用して、小脳の切開サイズを大きくします。次に、0.8mmのドリルビットを使用して、頭蓋骨に下穴を開け、ネジを頭蓋骨に回します。
余分なワイヤーをネジの周りに巻き付けて、後でヘッドステージを配置するために多少のたるみを確保します。すべての頭蓋骨ネジを所定の位置に取り付けたら、すべての金色のピンを目的のヘッドステージコネクタに差し込みます。定位固定装置アームでコネクタを所定の位置に保持し、ワイヤが接触しないようにコネクタピンをネジ頭の上の近くに配置します。
シアノアクリレート接着剤で全体をシールし、頭蓋骨ネジの前のイメージング領域が乱されないようにします。金ピンの基部の周りに歯科用セメントを積み上げ、頭蓋骨のネジからの金ピンがヘッドステージの金ピンに接続されないようにします。ヘッドステージコネクタを取り外す前に、歯科用セメントが硬化するのを待ちます。
まず、IOSコンピューターとLEDパネルボードの電源を入れます。電極を埋め込んだ麻酔動物をカメラの下のインパクトベッドに取り付けます。そして、皮質表面を覆うようにフォーカスリングを調整します。
固有の光信号、またはIOS設定をロードした後、ライブボタンを押してマウスを表示し、動物の頭蓋骨をカメラの中央に配置します。次に、Multi-D Acquisitionを押して取得設定にアクセスし、目的の時点を選択します。指定されたファイルパスに、適切な名前プレフィックスを付けて画像を保存します。
動物からの金色のピンをヘッドステージコネクタに接続し、次にヘッドステージに接続します。電気生理学コンピュータの電源を入れ、コンピュータを電気生理学機器に接続します。Intanソフトウェアの設定を読み込んだ後、[ファイル形式の選択]アイコンをクリックし、ポップアップウィンドウで[信号タイプ形式ごとに1ファイル]を選択します。
次に、[BW]タブの[ハードウェア帯域幅]で、0.13〜500ヘルツのアンプ帯域幅を選択します。[フィルター ディスプレイ セレクター] で [ワイド] を選択します。ローパスフィルターとハイパスフィルターを設定したら、[ファイル名の選択]アイコンをクリックして、保存するファイルパスを選択します。
衝撃は、電磁インパクターをONにし、レバーをフリックして、先端が適切に引っ込めて伸びるか確認してください。動物をフォームベッドに素早く置き、ベッドをインパクターの先端の下にスライドさせます。インパクターの先端を正中線に合わせ、ブレグマの1ミリメートルの吻側に配置します。
次に、インパクターの先端を下げて、動物の頭のてっぺんにしっかりと触れます。レバーを押してインパクターの先端を引っ込め、手動で5mm下げてからインパクトレバーを作動させます。すぐに動物をフォームベッドから取り出し、カメラの下に置いて5秒以内にイメージングします。
「Acquire」をクリックして、「Multi-Dimensional Acquisition」ウィンドウでIOSイメージングを開始します。4分間の画像をキャプチャして、拡散する脱分極イベント全体を記録します。電気生理学の記録を開始するには、Intanソフトウェアの[記録]アイコンをクリックします。
録音が完了したら、動物をヘッドステージとコネクタから抜き、ケージに戻します。画像スタックを開くには、[ファイル]をクリックし、[インポート]と[画像シーケンス]をクリックします。カーソルを使用して正方形を描画し、関心領域を定義して、拡散する脱分極のプロットを生成します。
[Image] に移動し、[Stacks] に移動し、[Plot Z-axis Profile] に移動してグラフをプロットし、[Live] ボタンをクリックします。生成されたプロットで、List をクリックして値のリストを生成します。視覚化するには、グレースケール画像を火のルックアップテーブルで変換します。
広がりのある脱分極は、窓を通して皮質と大きな血管を横切って伝播することが観察されました。電気生理学記録における高頻度活性は、イソフルラン除去後の偽動物で迅速な回復を示しました。しかし、脱分極した動物では、回復するまでの数分間、高頻度の活動が抑制されたままでした。
パワープロットは、両方の条件で抑制からの回復後にパワーが明らかに上昇したことを示しました。
概要
本研究では、成マウスをモデルとして、広が性脱分極（spreading depolarizations）と軽度外傷性脳損傷との関連性を調査します。イメージング技術と生体内電気生理学を統合することで、本プロトコルは広が性脱分極を確実に検出し、軽度外傷性脳損傷に伴う急性期の行動および長期的な認知機能低下におけるその重要性を明らかにすることを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- イメージング技術
背景
- マウスの軽度閉頭蓋損傷において、広がり脱分極が発生することがあります。
- 一般的なin vivo電気生理学的手法では、これらの脱分極に関連する緩やかな細胞外電位変化を検出できない場合があります。
- 本研究は、イメージングと電気生理学を組み合わせることで、広がり脱分極の検出能を向上させることを目的としています。
- この研究は、軽度外傷性脳損傷後の急性期の挙動、病理、および認知機能への影響の理解に寄与します。
研究の目的
- 軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおいて、広がり抑制（spreading depolarizations）を確実に検出するプロトコルを実証すること。
- 広がり抑制が行動および認知機能欠損に及ぼす潜在的な影響を調査すること。
- 一般的な電気生理学的手法によって制限されていた現在の検出方法を改善すること。
使用方法
- 本研究では、成マウスを用いてイメージングと電気生理学を組み合わせたプロトコルを採用しています。
- マウスに軽度外傷性脳損傷を誘発した後、イメージングと電気生理学的記録の両方を行い、広範脱分極を同定します。
- 主な手順には、動物の麻酔、手術準備、およびイメージング装置と電気生理学装置の精密な統合が含まれます。
- 損傷後の電気生理学的データを記録し、それをイメージング結果と相関させることで、脱分極イベントを解析します。
主な結果
- 軽度の外傷性脳損傷に反応して、皮質全体に伝播する広がり脱分極（spreading depolarizations）が観察された。
- 電気生理学的記録により、脱分極を起こした個体では高周波活動が抑制されており、回復に大幅な遅延があることが浮き彫りになった。
- パワースペクトルプロットにより、シャム群と損傷群の個体間で回復パターンに明確な差があることが示された。
- これらの手法を組み合わせることで、広がり脱分極のより効果的な検出と解析が可能となった。
結論
- 本研究では、損傷後の広がり抑制（spreading depolarizations）を検出するための新しいプロトコルの有用性が実証されました。
- これらの知見は、軽度外傷性脳損傷後の認知機能低下および行動変化に関連するニューロンのメカニズムへの理解を深めるものです。
- イメージングと電気生理学の両方を用いることで、脳損傷における広がり抑制の影響について重要な知見が得られます。
よくある質問
業界における重要性
拡散性脱分極（SD）を確実に検出することは、脳損傷後の急性および長期的な神経学的影響を理解する上で極めて重要です。画像診断と生体内電生理学を統合することで、SD同定における予測の信頼性が高まり、神経外傷研究におけるメカニズムのリスク低減とターゲットの検証が促進されます。このデュアルモダリティアプローチは、初期段階の発見を強化し、中枢神経系（CNS）ポートフォリオの進展に向けたトランスレーショナルな連続性を高めます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見とターゲットバリデーション
- 損傷後の病理学的機序に寄与するSDの堅牢な検証を可能にする。
- 疾患関連モデルにおけるSDの有無を確認することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 下流の治療仮説検証における予測的な信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- SD調節を標的とした化合物スクリーニングのための、検証済みin vivoモデルの調製を容易にします。
- アッセイの標準化に向けた、定量的なイメージングおよび電気生理学的アウトプットを提供します。
- SDの再現性のある検出を可能にし、候補となる介入策の信頼性の高い評価を支援します。
翻訳・前臨床研究
- SDの伝播を可視化することにより、前臨床モデルをヒトに関連する損傷メカニズムに適合させます。
- SDと機能的アウトカムを関連付けることで、創薬から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- in vivoでメカニズム的エンドポイントを確認することにより、トランスレーショナル研究におけるリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このイメージングと電気生理学を組み合わせたプロトコルは、SD検出を、中枢神経系（CNS）傷害モデルにおける初期発見、リード化合物の同定、および前臨床研究の接点に位置づけるものです。
- 発見生物学： 急性と慢性の脳損傷におけるSDの関与に関するメカニズム的な仮説を検証します。
- スクリーニング： SD調節化合物を評価するための、再現性のある定量的なリードアウトを提供します。
- 分析： 実験条件の堅牢な統計的比較のために、同期させたイメージングデータと電気生理学的データを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 発見段階の知見を、CNS（中枢神経系）薬物開発に関連する前臨床エンドポイントへと繋げます。
- 企業の再利用： 多様な神経外傷および神経血管モデルに適応可能な、汎用性の高いプロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：CNS損傷研究における予測の信頼性を向上させ、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：多施設共同研究に適した、拡張性と再現性のあるワークフローにより、SD検出を標準化する。
- 戦略的価値：標的となる病理におけるSDの関与を明確にすることで、Go/No-Go決定に情報を提供する。
- ポートフォリオへの影響：検証済みのメカニズム的エンドポイントに基づき、CNS資産のリスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- in vivoイメージングと電気生理学的手法の両方の専門知識が必要です。
- 同期されたイメージングおよび電気生理学的記録インフラへのアクセスが不可欠です。
- データ取得および解析プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 様々なげっ歯類モデルに適応可能ですが、損傷の種類に応じてプロトコルの最適化が必要な場合があります。
- 信頼性の高いSD検出には、互換性のあるアンプとイメージングシステムの利用可能性に依存します。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Preparing the Skull for Imaging and Electrophysiology to Monitor Spreading Depolarizations in Injured Mouse Brain
2:52
Detecting the Spreading Depolarizations in Mouse Brain Injury Model with Intrinsic Optical Signal Imaging and AC-Electrophysiology
