Name: 高速液体クロマトグラフィーを用いたマウス眼組織および非眼組織における食事性ビタミンA代謝物の定量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 学ぶ高速液体クロマトグラフィーを用いたマウス眼組織および非眼組織におけるビタミンA代謝物の定量分析法。STRA6およびRBPR2輸送体の生理機能を解明し、視覚機能におけるビタミンA輸送メカニズムの理解を深める。

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<meta charset="utf8"></head><body>ロドプシン機能研究のためのマウス組織におけるビタミンA代謝物分析

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Octanol、HPLCに適しています、&ge;99.5%</td><td>シグマ-アルドリッチ、ミリポアシグマ</td><td>203-917-6</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ジオキサン、HPLCに適しています、&GE;99.5%</td><td>シグマ-アルドリッチ、ミリポアシグマ</td><td>204-661-8</td><td></td></tr><tr><td>11-シス-レチナール</td><td>国立眼科研究所</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>11-シス-レチノール</td><td>トロント研究化学品</td><td>TRC-R252105</td> 13-シス-レチノール トロント研究化学品 TRC-R239900 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13-シス-レチノール</td><td>トロント研究化学品</td><td>TRC-R252110</td><td></td></tr><tr><td>すべてのトランス網膜</td><td>トロント研究化学品</td><td>TRC - R240000</td><td></td></tr><tr><td>すべてのトランスレチノール</td><td>トロント研究化学品</td><td>TRC - R252002</td><td></td></tr><tr><td>エチルアセテート、HPLCに適しています、&ge99.7%</td><td>Sigma-Aldrich, Millipore Sigma</td><td>205-500-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC Grade</td><td>Fisher Scientific, Spectrum Chemical</td><td>18-610-808</td><td></td></tr><tr><td>メタノール (HPLC)</td><td>Fisher Scienctific</td><td>A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>レチニルパルミチン酸</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>TRC-R275450</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II 分析フラクションコレクター</td><td>Agilent</td><td>G1364F</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II バイナリポンプ</td><td>Agilent</td><td>G7112B</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II ダイオードアレイ検出器</td><td>Agilent</td><td>G7115A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II マルチカラムサーモスタット</td><td>Agilent</td><td>G7116A</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity II バイアルサンプラー</td><td>Agilent</td><td>G7129A</td><td></td></tr><tr><td>ST40R 冷蔵遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSST40R</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus 遠心分離機濃縮器</td><td>Eppendorf</td><td>22820168</td><td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL 琥珀色スクリュートップバイアル</td><td>Agilent</td><td>5188-6535</td><td></td></tr><tr><td>クリンプキャップ、PTFE/赤色ゴムセプタム付き、11 mm</td><td>Agilent</td><td>5183-4498</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブルガラス円錐遠心分離チューブ</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS9950215</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップチューブ、15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>バイアルインサート、150 & マイクロ;L、ポリマー製の足付きガラス</td>、<td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

高速液体クロマトグラフィーを用いたマウス眼組織および非眼組織における食事性ビタミンa代謝物の定量分析

Quantitative Analysis of Dietary Vitamin A Metabolites in Murine Ocular and Non-Ocular Tissues Using High-Performance Liquid Chromatography

ここでは、上記の方法を利用して、マウスの眼組織および全身組織中のレチノイドを検出および定量し、代表的なクロマトグラムを生成しました。さらに、これらの組織で検出できる典型的なレチノイドの概要を示します。
生後6か月で、マウスはCO2 窒息によって安楽死させられました。眼のレチノイド含有量を維持するために、マウスは安楽死と抽出の2日前に暗順応しました。2つの眼、0.2 gの肝臓、および75 μLの血液を採取し、レチノイド抽出とその後のHPLC分析を行いました。眼組織については、片方の眼をヒドロキシルアミンを添加せずに摘出し、もう片方の眼をヒドロキシラミン処理に供した。肝臓と血液の場合、レチナールデヒドは通常これらの組織で検出されないため、ヒドロキシルアミン治療は必要ありませんでした。.
ヒドロキシルアミンで処理していないマウスの眼のクロマトグラムでは、2つの非標準的なレチナールデヒド異性体のうちの1つである13-cis-レチナールが同定されました。さらに、11-cis-レチナールとオールトランス-レチナールの両方、2つの標準的なレチナールデヒド異性体が同定されました。両方のクロマトグラムで、視覚周期の中間体である 11-cis-レチノールと、主要なビタミン A 輸送形態であるオールトランスレチノールの両方が同定されました(図 4A)。
ヒドロキシルアミンで処理したマウスの眼のクロマトグラムでは、前述のすべてのレチナールデヒド異性体がまだ存在していました。しかし、これらの異性体の保持時間は大幅に増加しました。さらに、これらのレチナールデヒド異性体は、現在、 syn および 抗 異性体の両方として存在します。ピーク波形解析による定量では、正確な波形解析値を得るためには、 syn ピークと アンチ ピークの両方を合計する必要があります。11-シス-レチノールとオールトランス-レチノールの両方がまだ存在していました(図4B)。
マウス肝組織のクロマトグラムでは、これらの組織内でパルミチン酸レチニルとオールトランスレチノールが同定されました。レチニルエステルであるパルミチン酸レチニルは、哺乳類のビタミンAの主要な貯蔵形態として機能し、哺乳類の肝臓組織内にかなりの量で見つけることができます。肝臓は、ビタミンAをホロRBP4として全身組織に放出し、RBP4-トランススリエチン複合体内に全トランス-レチノールを含んでいます。その後、このクロマトグラム内で大きなオールトランスレチノールピークを同定できます(図 4C)。
マウスの血液のクロマトグラムでは、大きなオールトランスレチノールピークが同定されました。肝臓から採取されたholo-RBP4が循環器系を通じて全身組織に放出されることを考えると、これは予想通りです(図4D)。時間依存分離 HPLC ピーク上のレチノイドアイソフォームの特性 UV スペクトル吸光度(~250-400 nm)は、特定の各ピークにおけるアイソフォームの存在の品質を最初に交差確認するのに役立ちます(図 5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig01.jpg"> 図1:レチノイドの化学構造。 (A)これらのレチノイドは、典型的には抽出されたマウス組織に見出される。極性末端基が異なること、およびレチノイド異性体中の シス 二重結合の位置が異なることに注意してください。(B)レチナルデヒドをレチナールオキシムに変換すると、抽出効率が向上し、パルミチン酸レチニルとのピークの共溶出、およびレチナールデヒド異性体内での共溶出が防止されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig02.jpg"> 図2:組織回収、均質化、レチノイド抽出、分析のワークフロー。 暗順応マウスの網膜および組織サンプルを均質化し、抽出した。 ステップ1: ガイドラインに従ってマウスを安楽死させた後、血液や各種組織を採取します。 ステップ2-4: 次に、生理食塩水とメタノールを用いて組織の均質化を行い、定量分析のために塩酸ヒドロキシルアミンを用いて行います。 ステップ5〜7: レチノイドはヘキサンを使用して処理され、続いて蒸発します。 ステップ 8、9: 100 μLのヘキサンで再懸濁し、すべてのレチノイドが溶解していることを確認します。 ステップ10: 最後に、サンプルをHPLCを使用して分析します。略語:HPLC=高速液体クロマトグラフィー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig03.jpg"> 図3:レチノイド標準試料およびヒドロキシルアミン処理レチノイド標準試料のクロマトグラム。 (A)このクロマトグラムには、パルミチン酸レチニル、13-シス-レチナール、11-シスレチナール、オールトランスレチナール、11-シス-レチノール、13-シス-レチノール、およびオールトランスレチノール標準物質が含まれています。(B)このクロマトグラムには、パルミチン酸レチニル、13-シス-レチナール、11-シス-レチナール、オールトランスレチナール、11-シス-レチノール、13-シス-レチノール、およびオールトランスレチノール標準が含まれています。このクロマトグラムには、レチノール異性体に加えて、 シン および 抗 オキシムレチナールデヒド異性体が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig04.jpg"> 図4:代表的なクロマトグラム (A)マウスの眼組織の代表的なクロマトグラム。このクロマトグラムには、レチノール異性体に加えて、レチノール異性体に加えて、レチノール異性体など、マウスの眼組織に通常見られるレチノイドが含まれています。(B)ヒドロキシルアミン処理したマウス眼組織の代表的なクロマトグラム。前のクロマトグラム(図 4A)で見つかった非化学的修飾のレチナルデヒドの代わりに、このクロマトグラムには、レチノール異性体に加えて、syn および抗オキシムのレチナルデデ異性体が含まれていることに注意してください。(C)マウス肝臓組織の代表的なクロマトグラム。このクロマトグラムには、パルミチン酸レチニルやオールトランスレチノールなど、マウスの肝臓組織に一般的に見られるレチノイドが含まれています。 (D)マウス血液の代表的なクロマトグラム。このクロマトグラムには、マウスの血液中に通常見られるレチノイドが含まれており、これにはオールトランスレチノールが含まれています<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig04large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig05.jpg"> 図5:マウス眼組織からのレチナールデヒド異性体のUV吸光度スペクトル。(A)13-cis-レチナール、(B)11-cis-レチナール、(C)9-cis-レチナール、(D)オールトランスレチナール、(E)syn 11-cis-レチナールオキシム、(F)抗11-cis-レチナールオキシムの吸光度スペクトル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67034/67034fig06.jpg"> 図6:HPLCモジュール、移動相フロー、およびその他の装置の概要。 移動相の流れは、調製された溶媒ボトルから始まり、バイナリーポンプによって高圧でオートサンプラーにポンプで送られ、そこで分析物が溶媒の流れに取り込まれます。移動相と分析種は、温度調節されたカラムコンパートメントに到達し、最終的に測定のためにダイオードアレイ検出器に到達します。(A)レチノイドの光異性化を最小限に抑える赤みがかったモニター画面。(B)バイナリポンプ。(C)バイアルサンプラー。(D)マルチカラムサーモスタット。(E)ダイオードアレイ検出器。(F)分析フラクションコレクター。(G)高密度ポリ廃棄物容器。(H)左から右へ、アルミニウム製クリンプキャップ、ポリマー脚付き250μLインサート、琥珀色着色のクリンプトップバイアル、インジェクションバイアルの最終組み立て。(I)左、冷蔵遠心分離機。右、遠心分離機濃縮器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67034/67034fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>化合物</td>
			<td>モル吸収率 (ε)</td>
			<td>溶媒</td>
			<td>参考</td>
		</tr><tr><td>パルミチン酸レチニル</td>
			<td>49260</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>ハバード他49</td>
		</tr><tr><td>13-シス-レチナール</td>
			<td>35500</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>ハバード他49</td>
		</tr><tr><td>11-シス-レチナール</td>
			<td>24935</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>ハバード他49</td>
		</tr><tr><td>9-シス-レチナール</td>
			<td>36100</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>ロブソン他51</td>
		</tr><tr><td>オールトランスレチナール</td>
			<td>42880</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>ハバード他49</td>
		</tr><tr><td>11-シス-レチノール</td>
			<td>34890</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>ハバード他49</td>
		</tr><tr><td>13-シス-レチノール</td>
			<td>48305</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>Robeson et al.50 および Robeson et al.51</td>
		</tr><tr><td>オールトランスレチノール</td>
			<td>52770</td>
			<td>エタノール</td>
			<td>ハバード他49</td>
		</tr></tbody></table>表1:エタノール中のレチノイドのモル吸収率。 レチノイドのモル吸収率は、Kane and Napoli44、Hubbard et al.46、Robeson et al.47、および Robeson et al.48 から収集されました。モル吸収率は溶媒に依存します。ここにリストされている値は、エタノールに溶解したレチノイドに固有のものです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>組織</td>
			<td>ティッシュ収穫量</td>
			<td>均質化のためのボリューム</td>
		</tr><tr><td>血</td>
			<td>75 μL</td>
			<td>該当なし</td>
		</tr><tr><td>肝臓</td>
			<td>0.2グラム</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>腎臓</td>
			<td>2腎臓全体</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>皮膚</td>
			<td>0.2グラム</td>
			<td>1 mL – 1.5 mL</td>
		</tr><tr><td>脾臓</td>
			<td>脾臓全体1個</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>目</td>
			<td>両方の網膜、プール4網膜</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>脳</td>
			<td>1 全脳</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr><tr><td>心</td>
			<td>1 ホールハート</td>
			<td>1 mLの</td>
		</tr><tr><td>肺</td>
			<td>0.2グラム</td>
			<td>2ミリリットル</td>
		</tr></tbody></table>表2:分析ごとの推奨組織量。 Kane と Napoli44 が推奨する、組織の均質化のための 50% 氷冷生理食塩水 (0.9%) と 50% メタノールの分析あたりの組織量。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>化合物</td>
			<td>保持時間 (分)</td>
			<td>UV吸光度最大(nm)</td>
		</tr><tr><td>パルミチン酸レチニル</td>
			<td>5.177</td>
			<td>326</td>
		</tr><tr><td>13-シス-レチナール</td>
			<td>7.268</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>11-シス-レチナール</td>
			<td>7.691</td>
			<td>366</td>
		</tr><tr><td>9-シス-レチナール</td>
			<td>7.931</td>
			<td>364</td>
		</tr><tr><td>オールトランスレチナール</td>
			<td>8.993</td>
			<td>370</td>
		</tr><tr><td>11-シス-レチノール</td>
			<td>17.003</td>
			<td>318</td>
		</tr><tr><td>13-シス-レチノール</td>
			<td>17.83</td>
			<td>328</td>
		</tr><tr><td>オールトランスレチノール</td>
			<td>23.933</td>
			<td>326</td>
		</tr></tbody></table>表3:レチノイドの保持時間と最大吸光度波長。 これらの値は、記載されている方法および移動相とともに使用した場合に観察され、参照ダイオードアレイ検出器で検出されました。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>化合物</td>
			<td>保持時間 (分)</td>
			<td>UV吸光度最大(nm)</td>
		</tr><tr><td>Syn 11-cis-レチナールオキシム</td>
			<td>9.59</td>
			<td>346</td>
		</tr><tr><td>シン オールトランスレチナールオキシム</td>
			<td>10.6</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>Syn 13-cis-レチナールオキシム</td>
			<td>11.3</td>
			<td>352</td>
		</tr><tr><td>抗 13-シス-レチナールオキシム</td>
			<td>13</td>
			<td>356</td>
		</tr><tr><td>抗 11-シス-レチナールオキシム</td>
			<td>15.1</td>
			<td>350</td>
		</tr><tr><td>反 オールトランスレチナールオキシム</td>
			<td>19.7</td>
			<td>360</td>
		</tr></tbody></table>表4:ヒドロキシルアミン処理されたレチナルデヒドの保持時間と最大吸光度波長により、各レチナルデヒドの シン および 抗 オキシム異性体が得られます。 これらの値は、記載されている方法および移動相とともに使用した場合に観察され、参照ダイオードアレイ検出器で検出されました。

高速液体クロマトグラフィーを用いたマウス眼組織および非眼組織における食事性ビタミンA代謝物の定量分析

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