Name: 高分化型および分極した網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶResipherデバイスを用いた網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング手法。理想的な培養条件下で数週間にわたるバイオエネルギー解析により、ミトコンドリア機能評価と視力低下のメカニズム解明に貢献します。

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Daniel Hass博士とJim Hurley博士には、新しい媒体と条件付けされた媒体のO2 溶解度を対照としてテストするというアイデアに感謝します。原稿の編集にご協力いただいたMagali Saint-Geniez博士に感謝します。Kellogg Eye CenterのInstrument and Electronic Services CoreのScott Szalay氏に、Resipher USBケーブルを使用して低酸素チャンバーを改造してくれたことに感謝します。HFTの研究には連邦政府の資金は使用されていません。Electronic Services Coreは、National Eye InstituteのP30 EY007003によってサポートされています。この研究は、Research to Prevent Blindness(RPB)からの無制限の部門助成金によってサポートされています。J.M.L.M.は、ジェームズ・グロスフェルド・イニシアチブ・フォー・ドライ・エイジング・マグロース・マッキュラー・デパートメント、E・マチルダ・ジーグラー盲人財団、エバーサイト・アイバンク助成金、国立眼科研究所からのK08EY033420助成金、ディー・アンド・ディクソン・ブラウン、デビッド・ドリューズ・ディスカバリー・ホープ財団の支援を受けています。D.Y.S.は、UNSWサイエンティアプログラムの支援を受けています。L.A.K.は、Iraty Award、Monte J. Wallace、Michel Plantevin、National Eye InstituteからのR01EY027739助成金、および国防総省のArmy Medical Research Acquisition Activity VR220059によってサポートされています。

差別化されたRPE培養のための新しいOCRモニタリングシステム

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
<li>McNally, L. A., Altamimi, T. R., Fulghum, K., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+using+isolated+cell+systems+to+understand+cardiac+metabolism+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Considerations for using isolated cell systems to understand cardiac metabolism and biology.</a> J Mol Cell Cardiol. 153, 26-41 (2021).</li>
<li>Misare, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+tetraploidy+on+Caenorhabditis+elegans+physiology+and+sensitivity+to+chemotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The consequences of tetraploidy on Caenorhabditis elegans physiology and sensitivity to chemotherapeutics.</a> Sci Rep. 13 (1), 18125(2023).</li>
</ol>

リチャード・A・ブライアンとキン・ローは、Resipherシステムを製造しているLucid Scientificの従業員です。

RPEのミトコンドリア代謝は、AMDやPVRなどの一般的な失明性網膜疾患の病因に重要な役割を果たします。RPEミトコンドリア代謝 をin vitro でモデル化することで、その代謝状態を周囲の組織から分離するとともに、組織を制御された方法でさまざまな疾患をシミュレートする侮辱にさらすことができます。このようなRPEミトコンドリア代謝の in vitro モデリングは、 in vivoでRPEを厳密に近似するために必要な適切な分化状態と極性を達成する高忠実度のヒト初代およびiPSC-RPE培養物の出現によって促進されました。このような培養物における酸素消費率(OCR)のモニタリングは、ミトコンドリア代謝のモニタリングに理想的な方法ですが、OCRモニタリングの設定では、高度に分極した完全分化RPEに必要な条件で培養物を成長させることができないことがよくあります。ここでは、高分化型および分極化したRPE培養におけるOCRのリアルタイムかつ長期的な評価を通じて、RPEミトコンドリア代謝をモニタリングするための新しいシステムとしてResipherについて説明します。
RPEでOCRを監視するために、他の方法が使用されています。Seahorse XFアナライザーは、ミトコンドリア機能の急性操作により、OCRを短時間で監視するように設計されています。しかし、タツノオトシゴアッセイでは、細胞をカスタムプレート上で増殖させる必要があり、これは高いRPE極性および分化21をサポートするのに役立たない。Calton、Vollrath、および同僚たちは、タツノオトシゴを微多孔質支持体上で増殖させた高分化RPE培養の評価にタツノオトシゴを適応させ、微多孔質膜を断片に切断してタツノオトシゴプレートに配置したが、この方法は、細胞がCO2 にアクセスできないため、培養の短期的なエンドポイントモニタリングにしか機能しないアッセイ中、アッセイは非滅菌条件下でのみ行うことができ、微多孔性支持体を切断すると、時間の経過とともに微小孔性支持体のエッジ部分に死亡および機能不全が誘発される22。バロフューズは、微多孔質支持体上に成長したRPEのストリップを灌流システムに装填できるポンプレス灌流システムであり、OCRをリアルタイムで監視することができます23。Calton、Vollrath、および同僚によるSeahorseの変更されたセットアップと同様に、Barofuseを使用したRPE評価の主な制限は、微多孔質のサポートを切断する必要があることと、アッセイの短期的なエンドポイントの性質です。オキシグラフは、代謝操作24に応答してOCRの高速な運動学的変化のためにも設計されています。RPE文化には使用されておらず、タツノオトシゴやバロフューズのように高度に分極化し差別化されたRPE文化を評価するための同じ制限を受けることになります。
これらの他の方法とは対照的に、ここで説明するOCRシステムでは、標準細胞培養CO2 インキュベーター内の標準RPE培地を使用して、標準条件下でRPEを標準細胞培養プレート/基質で培養しながらOCRをモニタリングすることができ、高度に分化した分極したRPE培養を簡単かつ便利にプローブできます。システムによるリアルタイムのOCR変更に関するデータを生成するだけでなく、OCRモニタリング期間の終了時に同じ細胞を追加のアッセイに利用することができます。これにより、OCRに対する介入の効果が数週間にわたって繰り返しテストされる実験(例: 図5のRPE EMT誘導)や、介入からの長期的な回復をテストできる実験(例: 図3のミトコンドリアの分離からの回復)、または初期介入に応答したカスケード代謝変化を監視できる実験(例: 図の培地栄養素が枯渇した後のOCRに対する血清の影響)2). この論文のOCRシステムは、高度に分極され分化したRPE培養物におけるOCRの測定に特に便利です。このような培養物は機能的に有糸分裂後であり、密集した充填と重い色素沈着を伴います。これは、各ウェルにほぼ同一の細胞番号9が含まれていることを意味し、したがって、ほとんどの実験でOCRを細胞番号に正規化する必要がなくなります。細胞数への正規化が必要な場合でも、RPEの色素沈着が重く、細胞境界が明確に区切られているため、明視野イメージングに基づく非侵襲的な単純な細胞数で標準化を行うことができます。 図5のEMT実験のように、未分化のRPEおよびRPE増殖を伴う実験では、「細胞ごと」のOCRが何であるかを知るために、ウェルごとのOCRを細胞数に正規化することが必要になります。
網膜野以外では、このシステムは、膵島細胞25、骨格筋26、卵巣癌27、心筋細胞28、さらには C.エレガンス29などの生物全体を含む、さまざまな細胞タイプの細胞呼吸と代謝活性を研究するために採用されています。ここで説明したOCRシステムを使用したOCRのリアルタイム長期モニタリングにより、これらの多様な疾患モデルにおける生体エネルギーシフトとミトコンドリア機能障害に関する重要な洞察が明らかになりました。
Resipher システムには制限があります。OCRを決定する方法は、Seahorse Analyzer、BaroFuse、またはOxygraphとは根本的に異なります。OCRを計算するにはO2 勾配を確立する必要があり、勾配の確立には数時間かかる場合があります。したがって、他のシステムでは可能な高速速度論実験は、このシステムでは不可能です。さらに、他のシステムとは異なり、Resipherには低分子の迅速な送達や代謝物の収集のための注入ポートがありません。代わりに、細胞培養フードでセンシング蓋を取り外し、薬物をスパイクするか培地を交換し、分析する代謝物を手動で収集する必要があります。
このホワイト ペーパーで説明する OCR システムを使用して実験を確立し、トラブルシューティングを行うには、次のことをお勧めします。まず、蒸発を最小限に抑えます。RPE単層の上のメディアカラムのO2 勾配は、カラム9の高さに大きく依存し、システムはO2 勾配に基づいてOCRを計算することを思い出してください。したがって、実験中に蒸発によって培地カラムが著しく低下すると、O2 勾配が変化し、OCRの読み取り値に影響が及びます。インキュベーターのウォータートレイをいっぱいに保つことは重要ですが、96ウェルプレートのすべての未使用のウェルに水を入れることもお勧めします。さらに、プレートの端にあるウェルは蒸発速度が高いため、上記の典型的な実験では、これらのウェルには細胞が空のままになっています。OCRシステムの湿度センサーは、インキュベーターの湿度を監視するのに役立ちます。図8Aでは、実験中の湿度の低下は、インキュベーターの水トレイが空であることを示唆しています。ウェル内での蒸発が加速すると、ウェルの O2 濃度の読み取り値は上昇し、最終的には大気中の O2 濃度 (~200 μM) で「フラットライン」になります (図 8A)。
次に、OCRシステムの「サンドイッチ」が適切に組み立てられていることを確認します。デバイスの底面とセンシングリッドの上部にある金属接点は、完全な接触を妨げる破片がなく、きれいである必要があります。デバイスとセンシングリッドは、96ウェルプレート上に傾けることなく、完全に平らに取り付け、均等に位置合わせする必要があります。デバイスをハブに接続するUSBケーブルに張力がかかってはいけないと、「サンドイッチ」のトルクが発生し、デバイスの適切な動きが制限される可能性があります。
第三に、デバイスとセンシング蓋センサーが校正されていることを確認します。 図2B は、各実験の開始時に適切なセンサー機能を迅速に確認する方法を詳しく説明しています。第 4 に、実験操作の前に、特定のウェルが外れ値の OCR を示していないことを確認します。センサーが機能していることを確認した後、細胞を含むすべてのウェルのベースラインOCR値を決定することで、特定のウェルに異常な細胞が含まれているかどうかを判断できます。 図8B は、ベースラインOCR評価を受けているいくつかのウェルを示しており、青色のウェルはOCRが低い(したがって、O2 濃度が高い)ことをはっきりと示しています。この井戸は外れ値であり、実験操作から除外する必要があります。
第 5 に、アクティブな OCR 読み取り中の環境操作を最小限に抑えます。O2 グラジエントは、温度、湿度、インキュベーターのCO2 レベル、および大気圧の変化に非常に敏感です。インキュベーターのドアの開口部はこれらの要因に大きく影響し、培地カラムのO2 グラジエントが平衡に戻るまで、OCRの読み取りに一時的な混乱を引き起こします(図8C)。OCRに影響を与えるパラメータは、システムのオンラインインターフェイスの[環境]タブで監視できます(図8A)。
第六に、実験に最適な培地の量を決定します。培地の量が不十分な場合、過剰な蒸発(上記の最初のトラブルシューティング方法を参照)や培地中の栄養素の早期枯渇によるアーチファクトが発生する可能性がありますが、培地の量が多すぎると、RPE単分子膜へのO2 の利用可能性が制限され、低酸素症9が引き起こされます。 図7 は、RPE単分子膜のO2 濃度に対する培地量の影響を決定するために利用可能なオンライン計算機のスクリーンショットです。特定のメディアボリュームで可能な最大OCRを 図9Aに示します。所与の容量を使用した特定の実験のOCRレートが 図9Aに示されているレートに近似している場合、RPE単層でのO2 濃度は無酸素症(0%)に近づき、より低い培地容量が必要になります。一般に、RPE培養におけるミトコンドリア集約的なプロセスを含む実験では、培地容量は96ウェルあたり75μL以下である必要があります。
第 7 に、OCR に対する実験的介入の影響を分離するために、適切な正規化を実行します。ウェルが異なればベースラインOCRも異なるため、実験的介入の前に各ウェルのベースラインOCR測定値を取得することが重要です。実験的介入後のOCRからベースラインOCRを差し引くと、OCRに対する実験的介入の効果を示す「デルタOCR」が得られます。「Delta OCR」を得る方法を図3および図9Bに示す。ある実験的介入が別の実験的介入のOCR誘発能力に及ぼす影響に興味がある場合は、追加の正規化ステップである「デルタデルタOCR」が必要です。このような例は図9Bに示されており、パルミチン酸(1つの実験的介入)がOCRの増加を誘導する能力(β酸化の誘導による)は、RPE培養用の培地の種類(2番目の実験的介入)に依存します。
最後に、汚染のリスクを最小限に抑えます。このシステムは、細胞の上の培地に酸素センサーを導入することにより、OCRを監視します。これにより、感染のリスクが高まります。実験中にOCRが予想外に低下したり、実験開始時にOCRが予想外に低くなったりした場合は、感染の兆候である可能性があります。プレートは、細胞培養顕微鏡で感染を積極的に監視する必要があります。96ウェルプレート間のクロスコンタミネーションは、センシングリッドを再利用すると発生する可能性があります。このような交差汚染を最小限に抑えるには、実験が行われた後、新しい実験で検出蓋を再利用する前に、除染のために蓋全体を70%エタノールに20分間浸す必要があります(プロトコルセクション1.2.15を参照)。
結論として、Resipherと呼ばれる新しいシステムを使用したOCRの評価により、高忠実度RPE培養におけるミトコンドリア代謝のリアルタイムかつ長期的なモニタリングのためのプロトコルが提示されます。これは、高度に分極され分化したRPE培養、特に単離されたRPEの生理学的代謝特性の探索、およびAMDやPVRを含む網膜疾患の in vitro モデルにおけるRPE代謝の変化を調べるための多数のアプリケーションに使用できます。

網膜色素上皮(RPE)は、機能的に有糸分裂後の高度に分極された上皮細胞の単層であり、網膜の光感受性光受容体とその血液循環との間の障壁を形成します。これは、絨毛毛細血管と呼ばれる毛細血管床です。グリア支持ニューロンの役割と同様に、RPEは、視細胞の外側セグメントの食作用、光受容体の栄養素の輸送と代謝サポート、視覚機能の維持に不可欠な成長因子の分泌など、光受容体をサポートするための無数の機能を実行します。
RPEの変性は、視覚のいくつかの一般的な変性疾患の根底にあります。加齢黄斑変性症(AMD)は、世界で最も多い難治性視力喪失の原因の一つであり、RPEが死滅し、その上にある光受容体が二次変性を起こします。増殖性硝子体網膜症(PVR)では、RPEは代わりに通常は静止している有糸分裂後の状態から抜け出し、増殖して間葉系状態(いわゆる上皮間葉系への移行[EMT])に脱分化し、代謝が変化します。RPEの脱分化は、光受容体へのRPEサポートの喪失を引き起こすと同時に、より線維化した状態を引き起こします。これにより、視細胞の変性とRPE誘発性の瘢痕化の両方が起こり、どちらも視力低下を引き起こします1,2。
RPEの光受容体に対するサポートの大部分は代謝性であり、代謝調節不全はAMDやPVRを含む多くの網膜疾患の重要な要素です。RPEは、光受容体とその酸素および栄養素の供給源である絨毛毛細血管との間の調節障壁として機能します。したがって、RPEが代謝するために選択するものと、RPEが絨毛細血管から光受容体を通過するために選択するものが、光受容体の代謝と生存を強く支配します。多くの研究により、RPEは正常な健康のためにミトコンドリア代謝に大きく依存しており、光受容体は代わりに解糖系に大きく依存していることが示されています3。これにより、光受容体とRPEとの間の補完的で絡み合った代謝状態の概念が導入されました。具体的には、RPEは、好ましい視細胞代謝基質の代謝を減少させ、代わりに、光受容体が消費しない代謝産物と組み合わせた光受容体代謝の副産物を利用します。PVRやAMDなどの疾患では、RPEがより解糖性が高くなり、ミトコンドリア代謝への依存度が低くなるという証拠が強く示唆されています。このRPE解糖系へのシフトは、必要な代謝物の光受容体を飢えさせ、変性を引き起こす可能性があります4,5,6。RPEと光受容体代謝がどれほど相互依存的であるか、そして代謝の変化が網膜疾患の根底にあるかを考えると、治療目的でRPE代謝をモデル化および操作することに強い関心が寄せられています。
RPEミトコンドリア代謝をin vivoで研究することは理想的ですが、RPEミトコンドリア代謝の多くの側面は、in vitro培養システムでしか実際に調査できません。過去数十年の間に、忠実度の高いRPE培養に向けた大きな進歩が見られ、現在では最も慎重に手入れされたRPE培養物がヒト臨床試験の細胞補充療法に使用されています7。このような忠実度の高い培養を維持するためには、実験の数か月前に、RPEを特定の培地の特定の基質上で増殖させる必要があります。これらの条件により、RPE培養物は最大限に分化および分極され、in vivo RPEに近似します。残念ながら、現在、in vivo の RPE からミトコンドリア代謝を特異的に測定できる機器はありません。網膜毛細血管網の酸素モニタリングは、電子常磁性共鳴(EPR)酸素濃度計8を使用してin vivoで達成されていますが、これはRPE分析では不可能です。in vivoとin vitroのRPE代謝の違いは十分に説明されていませんが、RPE培養物はin vivoのRPEと同様に高いミトコンドリア活性を持つことが示されています3,9、これは、忠実度の高いRPE培養を使用してRPEミトコンドリア代謝に関する重要な洞察を得ることができることを示唆しています。
すべてのミトコンドリア代謝は酸素消費につながるため、RPE酸素消費率(OCR)の測定はミトコンドリア代謝の忠実な代理です。RPEの分極と分化を最大にする条件では、タツノオトシゴアナライザーなどの現在利用可能な技術では長期にわたる正確なOCR測定ができないことが多いため、RPE培養におけるOCRの測定は困難でした。この手法論文では、Resipher(以下、「システム」)と呼ばれる新しいデバイスが導入され、偏光と分化を最大限に促進する条件下で成長したRPEでOCRを数週間にわたって連続的に測定できます。RPEの分化と分極を最大限促進するRPE培養条件において、このシステムによるOCRの測定の容易さは、既存のOCR測定デバイスの中でも独特です。
このホワイト ペーパーでは、RPE カルチャでシステムを使用するためのヒントとコツを提供し、その後に 2 つの特定のアプリケーションのデモを示します。まず、PVRを模倣したRPE EMTは、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)1,10,11,12への曝露によって引き起こされます。このシステムは、EMTプロセス中にRPE代謝がどのように進化するかを監視するために使用されます。第二に、RPE代謝における低酸素症の役割は、このシステムを使用して調査されます。低酸素症は、絨毛細血管が13,14 歳で薄くなるため、AMD の病因に重要な貢献をしています。このシステムを低酸素チャンバーと組み合わせることで、RPEミトコンドリア代謝の変化と、加齢に伴う微妙な低酸素症をモデル化することができます。最後に、Resipherデータを使用したオンライン計算機が導入され、RPE培養物が低酸素、正常酸素、または高酸素のいずれの状態にあるかを判断できます。このような情報は、in vitro RPE培養研究からRPE代謝に関する結論を導き出すために重要です。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32チャンネル Resipher lid</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A for Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A from streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>電子伝達鎖複合体III阻害剤</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>ミトコンドリア呼吸を増加させるアンカップリング剤</td></tr><tr><td>DMSO、細胞培養グレード</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>ミトコンドリア薬物再構成用ビヒクル</td></tr><tr><td>細胞外マトリックスコーティング基材: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>hfRPE細胞外</td></tr><tr><td>マトリックスコーティング基板用細胞外マトリックス:ビトロネクチン</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>iPSC-RPE用細胞外マトリックス</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>シグマ</td><td>C2920-10MG</td><td>ミトコンドリア呼吸を増加させるアンカップリング剤</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(バイオテクネS11550H)</td><td>バイオテクネ</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン-シクロデキストリン</td><td>シグマ</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>低酸素チャンバー</td><td>エンブリエント(株)</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 メディアサプリメント</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>O2 センサー</td><td>感光技術または法医学検出器</td><td>P100 または FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト TGF&β;2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>上皮間葉系遷移を誘導するトランスフォーミング成長因子β-2</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマ</td><td>R8875-1G</td><td>電子伝達鎖の複合体Iの阻害剤</td></tr><tr><td>システム互換プレート</td><td>コーニング</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;MEM(Alpha Modification of Eagle's Media)</td><td>コーニング</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

高分化型および分極した網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

ミトコンドリアの代謝は、光受容体の生存に重要な網膜の細胞の単層である網膜色素上皮(RPE)の正常な機能にとって重要です。RPEミトコンドリア機能障害は、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢性黄斑変性症(AMD)と、網膜剥離の失明を伴う合併症である増殖性硝子体網膜症(PVR)の特徴です。RPEの変性条件は、 in vivo RPEを模倣するために高度に分化され、分極されたRPE培養システムによって十分にモデル化されています。しかし、ミトコンドリア機能の代理である酸素消費率(OCR)のモニタリングは、理想的なRPEの分極と分化を促進する条件ではOCR測定が容易ではないため、このような培養システムでは困難でした。 
ここでは、標準的な細胞培養インキュベーターで最適な増殖基質と生理学的培養培地上のRPEを維持しながら、高分化型RPE培養で一度に数週間OCRをモニターする新しいシステムResipherを紹介します。このシステムは、細胞上の培地に存在する酸素濃度勾配を測定することによりOCRを計算します。OCRを検出するための他の方法と比較した場合のこのシステムの利点と、RPE培養でOCRを測定するためのシステムのセットアップ方法について説明します。システムの使用に関する重要なヒントとコツ、データの解釈に関する注意、予期しない結果のトラブルシューティングに関するガイドラインについて説明します。 
また、システムによって検出された細胞上の培地中の酸素勾配に基づいて、低酸素症、正常酸素症、または高酸素症のRPE培養の経験のレベルを推定するためのオンライン計算機も提供しています。最後に、PVRモデルにおけるRPE細胞の代謝状態の測定と、RPEが低酸素症にどのように代謝的に適応するかを理解するという、システムの2つのアプリケーションについて概説します。このシステムを高度に分極し分化したRPE培養に使用することで、生理学的および疾患的状態の両方でのRPEミトコンドリア代謝の理解が深まると期待しています。

私たちは、網膜色素上皮(RPE)培養における酸素消費率(OCR)を測定するための新しいデバイスを紹介します。このデバイスは、プレートが標準細胞培養インキュベーター内にある間に、標準培地で標準細胞培養プレートで成長したRPEで一度に数週間OCRを測定できます。

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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このプロトコルは、マウス網膜フラットマウントの調製および免疫蛍光染色および分析のための詳細な方法を記載する。マウスの仔に対するフルオレセイン眼底造影(FFA)の使用および画像処理についても詳細に説明されている。...

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ヒト網膜色素上皮細胞(H-RPE)の代謝状態は、その健康と機能を反映しています。ここでは、高解像度の呼吸測定を使用してH-RPEのリアルタイムの代謝フラックスを調べるための最適化されたプロトコルを紹介します。...

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生きた組織のリアルタイム分析により、重要な機能的およびメカニズム的データが得られます。このホワイトペーパーでは、幅広い組織および細胞モデルを維持および評価する、ポンプ不要の新規マルチチャンネル流路系システムによる正確で再現性の高いデータ生成を確保するためのプロトコルと重要な変数について説明します。...

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網膜色素上皮 (RPE) は目の多機能上皮です。ここでマウスの網膜色素上皮から派生した一次電池文化を確立するためのプロトコルを提案する.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

学ぶResipherデバイスを用いた網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング手法。理想的な培養条件下で数週間にわたるバイオエネルギー解析により、ミトコンドリア機能評価と視力低下のメカニズム解明に貢献します。

高分化型および分極した網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング

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