Name: ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学ぶ ヒト精製血小板のホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定法。遠心分離とフローサイトメトリーで凝固促進血小板を特性評価し、止血機構と疾患における血小板機能を解明する。

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<meta charset="utf8"></head><body>血小板ホスファチジルセリンと微小胞放出の分析

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A 採血チューブ</td><td>BD バキュテイナー</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>アネキシン-V FITC</td><td>BD ファーミンゲン</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>アピラーゼ グレード VII</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン 30%</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸一水和物</td><td>メルク</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン&nbsp;</td><td>スタゴ</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>グルコース&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>ヘペス&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>イオノフォア&nbsp;</td><td>カルバイオケム/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>メルク</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>メルク</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>メルク</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>トロンビン&nbsp;</td><td>Hyphen Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2O</td></tr><tr><td>&alpha;IIbインテグリン(CD41、GPIIb)PC7</td>ベ<td>ックマンコールター</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

凝固促進剤の血小板および微小胞の定量は、Annexin-V染色を使用して行われ、サンプルあたり少なくとも50,000のイベントが記録されています。ステップ 2.2 で述べたように、ベースラインの血小板測定値は、 図 1A に示すように、反応バッファーでインキュベートしたサンプルから行いました。血小板サイズは、前方散乱(FSC)の中央値を使用して測定されました。FSCはさまざまな要因の影響を受けますが、血小板を含む細胞サイズの推定の一般的なプロキシであることに変わりはありません。面積の密度プロット(図1A)を使用して、休止血小板と放出された微小胞を同定し、ゲートしました。
非活性化血小板の場合、アネキシン-V染色によって決定されるホスファチジルセリン(PS)を示したのは2.9%未満でした。コラーゲン単独またはトロンビンまたはカルシウムイオノフォアと組み合わせて洗浄した血小板を活性化すると、PS曝露の観察可能な上昇が見られました。.コラーゲンだけでも、PS陽性血小板が26.7%増加しました。トロンビンはPS曝露への影響が最小限(9.1%)であったが、コラーゲンと関連させると、PS曝露血小板の割合が36.2%に増加した。参考までに、2 μM イオノフォアで処理すると、血小板の 49.6% が凝固促進剤になりました。
図1 は、健康な個人の洗浄された血小板からの微小胞のベースライン割合が最小(0.3%)であったことを示しています。トロンビンとコラーゲンは微小胞形成を最小限に増加させましたが、微小胞形成が有意に増加したのはコラーゲンとトロンビンの組み合わせだけでした(図1D;11.4%)。2 μM のイオノフォアを添加すると、コントロール血小板によって形成された微小胞の 44.0% が PS 曝露されました。
図 2 は、このプロセスから予想される変動、再現性、および再現性に関する情報を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
図1:安静時および活性化した対照血小板におけるPS曝露と微小胞形成。血小板は、30 μg/mL コラーゲン (B)、0.5 U/mL トロンビン (C)、コラーゲンとトロンビンの組み合わせ (D) と 2 μM イオノフォアを使用して、活性化または不活性化 (安静時) (A) しました。代表的なドットプロットは、血小板サイズ(前方散乱光(FSC log))とアネキシン-V結合を示しています。水平線と垂直線(E)は、血小板陰性の集団を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
図2:イオノフォアとのインキュベーション後のPS曝露と微小胞形成の再現性と再現性。 クエン酸塩(カルシウムキレート剤)で処理した、または未処理の洗浄血小板中の2μMまたは5μMイオノフォアとインキュベートした後のPS曝露および微小胞形成の分析:(A)4つの異なる健康なコントロールから;(b)1つの健康なコントロールから5回繰り返される;(C) 2 人の異なる技術者によって準備された 2 つの健康なコントロールから。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>全血中の血小板数(109 / mL)</td>
			<td>相対遠心力(g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;30</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:全血中の血小板数に対する多血小板血漿調製の相対遠心力。.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>クエン酸一水和物(C6H8O7。H2O, 38 mM)</td>
			<td>8グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>クエン酸三ナトリウム二水和物(Na3C6H5O7.2 H2O、61 mM)</td>
			<td>180グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>グルコース(C6H12O6、136 mM)</td>
			<td>24.6 グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">溶液のpHは調整しないでください。.溶液を4°Cに保ちます。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2:酸-クエン酸-デキストロース(ACD)の1L水溶液の調製。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>クエン酸一水和物(C6H8O7。H2O, 36 mM)</td>
			<td>7.56 グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOHの</td>
			<td>4グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0.203グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">pHを6.5に調整します。溶液を4°Cに保ちます。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3:洗浄バッファーの原液の調製。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% ウシ血清アルブミン (BSA)</td>
			<td>583 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2、0.25 M</td>
			<td>400μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>グルコース</td>
			<td>40ミリグラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>アピラーゼ</td>
			<td>31.5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4:ストック溶液からの洗浄バッファーの50mL即席溶液の調製。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl(2.7 mM)</td>
			<td>0.2グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0.203グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES(5 mM)</td>
			<td>1.19 グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O;0.3 mM</td>
			<td>0.05グラム</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">pHを7.4に調整します。溶液を4°Cに保ちます。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5:反応バッファーの原液の調製。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>試薬</td>
			<td>量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% ウシ血清アルブミン (BSA)</td>
			<td>167μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2、0.25 M</td>
			<td>400μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>グルコース</td>
			<td>50ミリグラム</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表6:ストック溶液からの反応バッファーの50mL即席溶液の調製。

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

Research

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