ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

血小板凝固促進剤の形成は、止血を維持するために重要です。このプロセスには、リン脂質の発現と血小板表面での微小胞の放出が含まれ、これは凝固ステップに不可欠です。このプロセスの評価により、血小板凝固剤の反応が多様なヒト疾患でどのように起こるかについての新しいデータが得られました。

フローサイトメトリーは基礎であり、血小板上のホスファチジルセリン発現および微小胞放出の評価において広く受け入れられています。血液から精製された血小板の単離と分析には時間がかかり、特殊な実験装置が必要になるため、現在のところ日常的な臨床診断には利用できません。ホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の分析も、サイズが小さく、関心のあるマーカーの陽性イベントの数が少ないため、困難です。

まず、活性抗凝固剤であるクエン酸三ナトリウムとクエン酸およびデキストロースを含む収集チューブに末梢静脈血を採取します。チューブを静かに反転させて血液を抗凝固剤と混合し、混合物を室温で15分間休ませます。自動セルカウンターを使用して血小板をカウントし、遠心分離の適切な速度を決定します。

多血小板血漿を調製するには、ブレークを適用せずに、血液を250gで室温で10分間遠心分離します。次に、1ミリリットルのACDAと6.25マイクロリットルのアピラーゼを9ミリリットルの多血小板血漿に加えます。.混合物を1,100gで室温で10分間遠心分離する。

Pastureピペットを使用して、血小板の乏しい血漿を含む上清を取り除き、血小板ペレットを1ミリリットルの洗浄緩衝液に穏やかに再懸濁します。.次に、3〜4ミリリットルの洗浄バッファーをチューブに加え、再度遠心分離します。上清を取り除いた後、ペレットを1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。.

150マイクロリットルの血小板懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。残りの懸濁液に3〜4ミリリットルの洗浄バッファーを追加して、前に示したように追加の洗浄を行います。次に、血小板ペレットを反応バッファーに再懸濁して、最終濃度が5 x 10で1リットルあたり11血小板の累乗になるようにします。

まず、フローサイトメトリー用の所望のバッファーで洗浄した血小板を得る。反応バッファー中のすべてのアゴニストと蛍光色素を調製します。内部アッセイでは、100マイクロリットルの洗浄済み血小板を50 x 10の濃度で、1リットルあたり9血小板の累乗でさまざまな治療チューブに加えます。

各アリコートを静かに振って、摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、各マイクロチューブに5マイクロリットルの非希釈アネキシンV-FITCを加えてインキュベートします。その後、各チューブに500マイクロリットルの反応バッファーを追加してプロセスを停止します。

前方散乱法または FSC を使用して血小板集団をゲートし、密度プロットを使用して各集団を個別に同定します。休止状態の血小板集団の右端に負のカットオフを設定します。活性化後、このカットオフの右側にあるイベントを、ホスファチジルセリンを露出する血小板として分類します。

微小胞を分化するには、休止血小板集団で観察される最も低いFSC値にカットオフを設定します。活性化後、このしきい値を下回るホスファチジルセリン陽性イベントを微小胞として分類します。.ベースライン測定では、非活性化血小板の2.9%未満がホスファチジルセリン曝露を示したことが示されました。.

活性化すると、血小板の26.7%がコラーゲンでホスファチジルセリン陽性になり、9.1%がトロンビンで、36.2%がコラーゲンとトロンビンの両方で陽性になりました。イオノフォア処理により、49.6%のホスファチジルセリン陽性血小板が得られました。微小胞のベースライン割合は0.3%で、コラーゲンとトロンビンを合わせただけで約11.4%、イオノフォアが44%と有意な増加が見られました