Name: 閉じ込めインピンギングジェットミキサーにおける乱流による脂質ナノ粒子の合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぼう、閉じ込めインピンギングジェットミキサーを用いた乱流混合による脂質ナノ粒子の再現性のある合成方法。スケーラビリティと均一性を向上させ、創薬研究におけるナノ粒子製造の課題を解決します。

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CIJおよびμMIVMミキサー技術を用いた脂質ナノ粒子の合成

<ol><li>Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for mRNA delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).</li>
<li>Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -S., Jadhav, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+RNA+therapeutics%3A+The+great+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape.</a> Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).</li>
<li>Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvoluting+lipid+nanoparticle+structure+for+messenger+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery.</a> Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).</li>
<li>Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles%E2%94%80from+liposomes+to+mRNA+vaccine+delivery%2C+a+landscape+of+research+diversity+and+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement.</a> ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).</li>
<li>Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+DNA+therapeutics%3A+Hallmarks+of+non-viral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery.</a> ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).</li>
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<li>Lam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trialkyl+ionizable+lipids+are+versatile+lipid-nanoparticle+components+for+therapeutic+and+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications.</a> Adv Mater. 35 (15), 2209624(2023).</li>
<li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery%2C+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).</li>
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<li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies%3A+From+concepts+to+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).</li>
<li>Jürgens, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-scale+siRNA+and+mRNA+LNP+manufacturing+by+various+microfluidic+mixing+techniques+-+an+evaluation+of+particle+properties+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22OpenNano%22%5BJournal%5D)">Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques - an evaluation of particle properties and efficiency.</a> OpenNano. 12, 100161(2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+selective+organ-targeting+%28sort%29+lipid+nanoparticles+%28LNPs%29+using+multiple+technical+methods+for+tissue-specific+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery.</a> Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).</li>
<li>Yanez Arteta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+reprogramming+of+cellular+protein+production+through+mRNA+delivered+by+functionalized+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).</li>
<li>Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+lipid+nanoparticles+for+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery.</a> Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).</li>
<li>Shepherd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+and+siRNA+lipid+nanoparticle+production+using+a+parallelized+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device.</a> Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).</li>
<li>Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+mixing%3A+A+general+method+for+encapsulating+macromolecules+in+lipid+nanoparticle+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems.</a> J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).</li>
<li>Prakash, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+fabrication+of+lipid+nanoparticles+for+the+delivery+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids.</a> Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197(2022).</li>
<li>Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+microfluidic+technologies+for+lipid+nano-microsystems+from+synthesis+to+biological+application%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application.</a> Pharmaceutics. 14 (1), 141(2022).</li>
<li>Webb, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+for+scalable+manufacturing+of+nanomedicines+from+bench+to+GMP%3A+A+case+study+using+protein-loaded+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes.</a> Int J Pharm. 582, 119266(2020).</li>
<li>Warne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+3+billion+doses+of+comirnaty+in+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021.</a> Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).</li>
<li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+nanoprecipitation+of+organic+actives+and+block+copolymers+using+a+confined+impinging+jets+mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+J+Chem%22%5BJournal%5D)">Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer.</a> Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).</li>
<li>Hogarth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+impact+of+systematic+hydrophobic+modification+of+model+drugs+on+the+control%2C+stability+and+loading+of+lipid-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles.</a> J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).</li>
<li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37(2012).</li>
<li>D'addio, S. M., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+drug+nanoparticle+formation+by+rapid+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation.</a> Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).</li>
<li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+rapid+self-assembly+of+block+copolymer+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles.</a> Phys Rev Lett. 91 (11), 118302(2003).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+confined+impingement+jets+mixer+for+flash+nanoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation.</a> J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).</li>
<li>Markwalter, C. E., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+small-scale+multi-inlet+vortex+mixer+for+scalable+nanoparticle+production+and+application+to+the+encapsulation+of+biologics+by+inverse+flash+nanoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation.</a> J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).</li>
<li>Johnson, B. K., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+processing+and+micromixing+in+confined+impinging+jets%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE%22%5BJournal%5D)">Chemical processing and micromixing in confined impinging jets.</a> AIChE. 49, 2264-2282 (2003).</li>
<li>Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+nanoprecipitation+for+the+encapsulation+of+hydrophobic+and+hydrophilic+compounds+in+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles.</a> J Vis Exp. (143), e58757(2019).</li>
<li>Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulating+and+characterizing+lipid+nanoparticles+for+gene+delivery+using+a+microfluidic+mixing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform.</a> J Vis Exp. (168), e62226(2021).</li>
<li>Bizmark, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribogreen+fluorescent+assay+kinetics+to+measure+ribonucleic+acid+loading+into+lipid+nanoparticle+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers.</a> Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083(2024).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+lipid-based+nanoparticles%3A+An+efficient+delivery+system+for+nucleic+acid-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy.</a> Molecules. 27 (6), 1943(2022).</li>
<li>Kulkarni, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion-dependent+formation+of+lipid+nanoparticles+containing+macromolecular+payloads%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads.</a> Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).</li>
<li>El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+in+vitro+and+in+vivo+efficiency+of+mRNA-lipid+nanoparticles+formulated+by+microfluidic+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing.</a> J Vis Exp. (191), e64810(2023).</li>
<li>Scalzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizable+lipid+nanoparticle-mediated+delivery+of+plasmid+DNA+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes.</a> Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).</li>
<li>Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+formulation+of+nanoparticle+therapeutics+from+laboratory+discovery+to+clinical+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale.</a> J Transl Med. 17 (1), 200(2019).</li>
<li>Kazemian, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-nanoparticle-based+delivery+of+CRISPR%2Fcas9+genome-editing+components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components.</a> Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).</li>
<li>Pinkerton, N. M. Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Princeton+University%22">Princeton University</a>. , PhD thesis, http://arks.princeton.edu/ark:/88435/dsp01h128nd846 (2014).</li>
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著者には、開示すべき利益相反はありません。

2つの閉じ込められたインピンギングジェット乱流ミキサーを使用した核酸ポリマーを含むLNPの合成が発表されました。適切な速度で実施すると、CIJ乱流ミキサーは、混合の時間スケールがLNPアセンブリ時間よりも短くなることを保証し、狭いサイズ分布21の小さなLNPを形成するための均質な過飽和条件を生成します。その結果、異なるタービュレントミキサー形状(2ジェットCIJおよび4ジェットMIVMミキサー)を使用して同じ化学的性質で製造されたLNPは、同様の物理化学的特性を示し、良好なトランスフェクション効率を示します(図5 および 図6)。対照的に、ピペッティングを使用して作製したLNPは、混合が不十分であるため、トランスフェクション効率が低く、より大きく、より多分散したLNPが得られます(図5A)。混合と組み立ての動力学がLNP処理において重要な役割を果たすことは長い間理解されてきました。Cullisらは、エタノールとバッファーの急速な対流拡散混合は、狭いサイズ分布の小さな粒子の形成をもたらすが、一方、ゆっくりとした拡散混合は、広いサイズ分布のより大きな粒子をもたらすことを指摘した9。CIJ乱流ミキサーにおける混合の時間スケールは、ミキサー27へのストリームの入口流量に比例して減少する。これは、慣性力と粘性力の比を測定する無次元レイノルズ数(Re)によって定量化されます。CIJとMIVMのミキシングチャンバー内の乱流は、十分に高いReで発生するため、乱流の渦の伸びにより長さが小さくなり、拡散による溶媒/抗溶媒の混合が急速に行われます。乱流の長さスケールは、ミキシングデバイスの特定の形状ではなく、Reに依存します。そのため、CIJまたはMIVMのいずれかが同じLNP粒子を作成し、さまざまなサイズのMIVMミキサーが同じNPサイズ27を作成する理由です。高いReでは、高い入口速度に対応して、LNPをバッチ間のばらつきなしに再現性よく作製できます(図3B)。
このプロトコールでは、乱流CIJミキサーを使用して、異なる物理化学的特性を持つさまざまなmRNA、DNA、またはsiRNA LNPを製剤化することができます。この手法は、組成と濃度の多様性を可能にするだけでなく、ベンチセールで処方を迅速にスクリーニングし(数ミリグラム)、リード製剤を5 L/minの生産速度でより大きな工業用バッチサイズにスケールアップするための明確な道筋を提供します36。これは、バルクミキシングやマイクロ流体工学など、他のいくつかの技術にとって大きなハードルとなっています。例えば、バルク処理技術では、数ミリリットルのスケールでもLNPを一貫して再現性よく製造することはできません。マイクロ流体技術は、バルク混合技術よりも大幅に改善され、均一で再現性のあるLNPの製造を可能にします。ただし、ミリグラムの範囲にすぎません29。冒頭で詳述したように、マイクロ流体デバイスの並列化は、生産規模へのスケーリングの試みを提供しますが、ファウリングの問題を排除するわけではなく、閉じ込められた衝突ジェット技術に基づくミキサーほどうまくスケーリングすることはできません。
これらの利点以外にも、CIJミキサーは、ターゲティング機能を発揮したり、遺伝子編集を行ったりする次世代LNPの製造に役立ちます。現在のLNP製剤は、脂質と核酸が同様の拡散性を持つため、ベンチスケールではわずかに混合が不十分でも作ることができます。しかし、遺伝子編集アプローチでは、CAS9タンパク質をコードするために、小さなガイドRNA分子や大きなmRNA転写産物など、分子量が大きく異なる核酸種をカプセル化する必要があるかもしれない37。これらの異なる種の拡散時間スケールは非常に異なるため、化学量論的比率での均一なカプセル化は困難です。この均一なカプセル化の問題は、混合効率が悪くなるほど顕著になります。同様に、非肝細胞を標的とするためには、強く結合したゆっくりと拡散する安定剤(標的化リガンドを持つ高分子量のブロック共重合体など)を組み込む必要があるかもしれません。14 kDaまでのリガンドを標的とすることで、ナノ粒子の集合前に共重合体をブロックすることができ、CIJミキシング38を用いてNPに均一に組み込むことができます。CIJ乱流ミキサーは、異なる拡散率を持つ成分で作られたLNPを製造するための便利なツールです。
CIJ乱流ミキサーは、LNPの定式化において他のミキサーに比べていくつかの利点がありますが、各形状に関連する制限に注意することが重要です。2ジェットCIJミキサーでは、チャンバー内で均一な乱流マイクロミキシングを達成するために、両方の入口流(エタノールと水)が等しい運動量(10%〜30%以内)を持つ必要があります。出口ストリームが50:50の溶媒/抗溶媒からなるという事実は、沈殿が発生する混合キャビティ内の過飽和のレベルを制限する29。この欠点は、4ジェットMIVMミキサーによって対処され、不等モーメントの4つのジェットを利用して、ミキシングチャンバー内で高い過飽和状態を達成できます。さらに、どちらのミキサーも総質量のミリグラムオーダーである必要があるため、多くの異なるLNP製剤のハイスループットスクリーニングには理想的ではありません。単純なLNP製剤の場合、スクリーニングはマイクロ流体またはマイクログラムスケールのピペッティング戦略で行うのが最善であり、いくつかのリード製剤が同定されたら、閉じ込められたインポンピングジェット技術に移すのが最適です。ミキサーのデッドボリュームを考慮することも重要です。CIJでは、2つのジェットミキサー、ホールドアップ容量は50〜100マイクロリットルです。この材料量は、プロセスからの回収を計算するときに、クエンチバスで捕捉された量から差し引く必要があります。これらの損失は、大規模に操作する場合は重要ではありませんが、ここに示すように、合計容量が5 mLになると10%の損失になります。インピンギングジェット乱流ミキサーは、FDAが承認した2つのCOVID-19ワクチンが証明しているように、GMPスケールでLNPを製造するための貴重なツールです。

mRNAベースの治療薬は、感染症、遺伝性疾患、がんなど、幅広い疾患の治療と予防に大きな可能性を秘めています1。細胞膜全体に受動的に拡散する低分子治療薬とは異なり、細胞内送達のためには核酸をカプセル化する必要があります2。カプセル化は、mRNAに構造と安定性の両方を提供し、エンドサイトーシス経路を介した細胞内送達を促進するとともに、ヌクレアーゼ3などの細胞内および細胞外成分からの分解を防ぎます。mRNAのカプセル化と送達のために、無機ナノ粒子、ポリマー、脂質、脂質様材料1など、多くの材料やナノキャリアが開発されています。その中でも、LNPはmRNAベースの治療薬の最も一般的な送達プラットフォームとして浮上しています4。
LNPは、イオン化可能脂質、コレステロール、双性イオン性脂質、PEG-脂質安定剤5の4つの脂質成分で構成されています。mRNA導入に適したイオン化可能な脂質は、脂質の疎水性と三元アミン基6の解離定数(pKa)との間に慎重なバランスを示します。イオン化脂質pKaは、KC-2(DLin-KC2-DMA)、MC-3(DLin-MC3-DMA)、ALC-03157など、通常、pHが6.0〜6.7です。イオン化可能な脂質に対するこのpKa制限により、核酸ポリマーの疎水性脂質塩としてのカプセル化と、「エンドソームエスケープ」プロセスによる細胞内送達の両方が可能になります。LNPは、pH 7.4からpH ~58までのエンドソームの酸性化を伴う(さまざまな)エンドサイトーシス経路を通じて標的細胞に侵入します。イオン化可能な脂質pKaは、LNPが生理学的条件下ではほぼ中性の表面を持つことを保証しますが、酸性化エンドソーム9ではカチオン性になります。このpH応答により、エンドソーム膜のみを選択的に破壊し、カプセル化された核酸ポリマーを放出し、リポフェクタミンなどのトランスフェクションシステムで使用される永久カチオン性脂質とは異なり、細胞の生存率を維持します。コレステロールは、LNP構造内の疎水性の間質分子であり、脂質の流動性を改善します。双性イオン脂質は構造的な役割を果たし、LNP表面上に二重層を形成します。ポリ(エチレングリコール)-脂質(PEG-脂質)は、LNPの表面に高分子立体安定剤を付与することによりLNPの安定性を高めるコロイド状安定剤であり、これによりLNPの凝集に抵抗します。これにより、特にpHが変化すると、疎水性油のように振る舞うイオン化可能な脂質の遊離塩基型が再生されます。Onpattro(パティシラン)レシピ(以下、LNP製剤と呼ぶ)は、イオン化可能な脂質MC3、コレステロール、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、およびPEG2000-DMGをエタノールに溶解し、RNA10の水溶液に混合したLNP製剤の出発点としてよく使用されます。
核酸ポリマーをカプセル化するLNPを製造するためにいくつかの技術を使用することができ、それらのほとんどは、脂質を含むエタノールストリームと目的の核酸(siRNA、mRNA、またはDNA)を組み込んだ水性ストリームを迅速に混合するという共通のテーマに依存しています9,11,12,13,14 .この点で、ピペットミキシングやボルテックスミキシングなどのバルクミキシングプロセスは、高度な機器を使用する必要性を排除するLNPを形成するための簡単な戦略を提供します12。しかし、バルクミキシングでは成分の均一な分布が得られないため、LNPサイズ分布が最適ではなく、バッチ間のばらつきも大きくなります15。
ラボでは、マイクロ流体混合技術を日常的に使用して、混合条件12,13,16のより正確な制御を達成することにより、再現性のあるLNPを取得しています。しかし、マイクロ流体デバイスの層流条件は、マイクロ流体チャンバー内の長さスケールが小さく、速度が遅いため、比較的遅い溶媒/抗溶媒混合をもたらします17。チャンバーの寸法が小さいため、LNPのGMP生産に必要なスループットとスケーラビリティが大幅に制限されますが、研究者はマイクロ流体チャンバーを並列化して生産量の規模を拡大しようとしています15。並列化されたマイクロ流体形状は、一般に混合装置の「ファウリング」と呼ばれる問題である大量処理中の表面への脂質吸着の問題を排除するものではなく、マイクロ流体工学のスケールアップを工業規模の生産に困難にする流れの均一性と安定性の問題があります18,19.製薬会社が乱流インピンギングジェットミキサーを使用してCOVID-19ワクチン接種mRNA-LNPを製造したことは驚くことではありません20。
RNAをロードしたLNPの製造プロセスでは、RNAペイロードを含む水性バッファーストリームと、4つの異なる脂質成分を含むエタノールストリームをブレンドする必要があります。これらの製剤は、pH 4.0 以下の酸性緩衝液を利用しており、水性とエタノールの流れが混ざり合うときにイオン化可能な脂質を帯電させます。正に帯電したイオン化脂質は、負に帯電したRNAと静電的に相互作用し、疎水性のRNA-脂質塩を形成します。RNA-脂質塩を含む疎水性脂質種は、混合溶媒中に沈殿し、疎水性核を形成します。これらの核は、双性イオン性脂質とコレステロールの沈殿を通じて成長し、十分なペグ化脂質がLNPの表面に吸着する臨界点に達するまで成長し、さらなる成長-核形成と成長メカニズム21,22,23を停止します。脂質が沈殿し、LNPが形成される程度まで、脂質溶液への水緩衝液の添加は、溶媒-抗溶媒混合期間τ混合期間と核成長期間τ凝集の2つの異なる時間スケールに依存します。無次元のダムケーラー数は、Da = τmix/τagg として定義され、これらの時間スケール24 の間の相互作用を捉えています。低速混合(Da > 1)の場合、LNPの最終サイズは輸送制御され、混合時間によって変化します。逆に、高速混合(Da < 1)では、流体はコルモグロフ長の縞模様または層に断片化され、LNP形成は各成分の分子拡散によってのみ支配され、LNP形成の均一な速度論がもたらされます。後者のシナリオを達成するには、脂質濃度が臨界閾値を超え、均一で均一な核形成を助長する過飽和状態を確立する必要があります。
τagg は数十から数百ミリ秒の範囲であると推定されます25。最も基本的な構成では、脂質を含むエタノールを含むストリームとRNAカーゴを含む水性バッファーを含むストリームの2つのストリームは、「閉じ込められた衝突ジェット」(CIJ)ミキサーと呼ばれるチャンバーに注入されます。乱流渦は、適切な速度で操作すると、1.5 ms以内で1 μmの溶媒/抗溶媒縞長スケールを生成します。流れの速度と混合ジオメトリは、線形運動量が流れを混合する乱流渦への変換を決定します。これは、無次元数であるレイノルズ数(Re)によってパラメータ化され、流れの速度に線形に比例します。Reは、Re = Σ(ViDi/vi)から計算され、ここで、Viは各蒸気の流速、viは各流の動粘度、Diは2ジェットCIJ装置26の流入口直径、または4ジェットMIVM27のチャンバー直径である。注: CIJ の一部の参照では、Re28 を定義するために 1 つのジェット直径と速度のみを使用しています。Reはマイクロ流体デバイスでは1〜100の範囲ですが、CIJデバイスでは125,000のReを達成できます。CIJミキサーでは、同じ運動量を持つストリームが衝突し、衝撃時にその運動量が乱流混合として散逸し、小さなコルモゴロフマイクロスケールと小さなダムケーラー数により効率的なマイクロミキシングにつながります。別のタイプのミキサーは、「マルチインレットボルテックスミキサー」(MIVM)で、4つのストリームが中央のチャンバーに導かれます。このセットアップでは、閉じ込められたミキシングチャンバーへの連続的な流れにより、明確に定義されたミキシングタイムスケールが保証されます。すべての流体要素は、両方のタイプのミキサーで高エネルギー混合ゾーンを通過します。対照的に、T字路のような単純な混合装置には、混合ゾーンを提供するチャンバーが含まれていないため、流入するストリームの勢いが乱流渦の発生ではなく出口方向に大きく偏向されるため、2つのストリームの混合が少なくなります。CIJミキサーとMIVMミキサーはどちらもバッチモードまたは連続モードで操作できるため、さまざまなスケールでのLNP生産に柔軟性があります。
このプロトコルでは、2ジェットCIJと4ジェットMIVMミキサーの2つの閉じ込めインポンピングジェット技術を使用して、最適なLNP製剤を作成する方法について説明します。CIJおよびMIVMミキサーの操作は、疎水性コア材料29を用いたNPの調製について以前に実証されている。その記事とビデオは、これらのミキサーによるNPの形成に関する追加のリソースとして参照する必要があります。今回のアップデートでは、脂質ベースのNP形成に焦点を当てています。マイクロミキシング条件を変えることでLNPのサイズを調整する能力が実証されています。さらに、CIJテクノロジーは、低ピペット混合を使用して作製したLNPと比較して、HeLa細胞の in vitro トランスフェクション効率が向上した安定した単分散LNPを形成することの有用性を示しています。さらに、各CIJミキシングジオメトリの長所と短所、およびこれらのミキサーのスケールアップに必要な適切な条件について説明します。

<table><tbody><tr><td>18:0 PC (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365P</td><td>ヘルパー脂質</td></tr><tr><td>21 G x 1-1/2 in.BD PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Black Wall Black Bottom Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>ALC-0315</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890900</td><td>イオン化可能な脂質</td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter、100 kDa MWCO、15 mL</td><td>Millipore</td><td>Sigma UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter、100 kDa MWCO、4 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Glo Luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2620</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA (5 moU)</td><td>Trilinkバイオテクノロジー</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>コンファインド インピンギング ジェット ミキサー</td><td>オランダ アプライド テクノロジーズ、ヘリックス バイオテック、ダイヤモンド ツール アンド ダイ (DTD)</td><td>該当なし</td><td>カスタム オーダーの場合はオランダまたは DTD に連絡し、ヘリックス バイオテック システムは Nova BT です。 新しいミキサー検証のためのテキストのレビュー</td></tr><tr><td>D-Lin-MC3-DMA </td><td>MedChemExpress</td><td>HY-112251 </td><td>イオン化可能な脂質</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、ピルビン酸</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>DMG-PEG 2000</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880151P</td><td>PEG-lipid</td></tr><tr><td>DODMA</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890899P</td><td>Ionizable lipid</td></tr><tr><td>Ethanol 200 Proof</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL コニカル遠心分離チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 mL 高透明度コニカル遠心分離チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、米国</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、遊離酸</td><td>IBIScientific</td><td>IB01130</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT 2部構成 1 mL Luer</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT 2部構成 5 mL (6 mL) Luer Lock</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4050.X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Idex 1648 ETFE チューブ <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67047/67047eq02.jpg" style="margin: auto;">”外径 0.093インチID</td><td>:イデックスヘルス&amp;サイエンス</td><td>1648</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-678 ¼"-28 ルアーフィッティング</td><td>Idex Health &amp;ETFE</td>チューブ用サイエンス<td>P-678</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-940フェルール</td><td>Idex Health &amp;科学</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>ルアーフィッティング</td><td>Idex Health &amp;サイエンス</td><td>P-604</td><td>CIJまたはMIVMミキサーインレットに、対応するスレッドで組み立てます。Idexの部品は、VWRや他の多くのサプライヤーを通じても入手可能</td></tr><tr><td>です ミキサースタンド</td><td>オランダ アプライドテクノロジー</td><td>ズ N/A</td><td>Markwalter&amp;を参照してください。 Prud'homme for design.26 購入についてはオランダにお問い合わせください</td></tr><tr><td>マルチインレットボルテックスミキサー</td><td>オランダ応用技術とダイヤモンドツールアンドダイ (DTD)</td><td>N/A</td><td>カスタムオーダーについてはオランダまたはDTDにお問い合わせください。新しいミキサー検証</td></tr><tr><td>O リング (MIVM)</td> <td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>オーダー バルク - 消耗部品についてテキストを確認します。別のソースを使用する場合は、溶剤の互換性を確認してください。</td></tr><tr><td>コンセントフェルール - CIJ</td><td>Idex Health &amp;Science</td><td>P-200</td><td>アウトレットフィッティング付き組み立て (ラージエンド フラッシュ チューブ付き)</td></tr><tr><td>アウトレットフィッティング - CIJ</td><td>Idex Health &amp;サイエンス</td><td>P-205CIJ</td><td>チャンバーアウトレットにフェルールとチューブで組み立て</td></tr>る<tr><td>アウトレットフィッティング - MIVM</td><td>Idex Health &amp;Science</td><td>P-942</td><td>フェルール</td></tr><tr><td>アウトレット チューブとの組み合わせ - CIJ</td><td>Idex Health &amp;Science</td><td>1517</td><td>端をきれいにするためにチューブカッターを使用してください。余分なチューブがミキシングチャンバーに突き出ないようにしてください</td></tr><tr><td>アウトレットチューブ - MIVM</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>フェルールIDに適合。</td></tr><tr><td>PBS - リン酸緩衝生理食塩水 (10x) pH 7.4、RNase フリー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエン</td>ティフィック 15140122 <td></td></tr><tr><td>PHD 2000 プログラマブルシリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック 2 ピースシリンジ 1 mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>プラグフィッティング</td><td>イデックスヘルス&amp;Science</td><td>P-309</td><td>CIJ ミキサー側に組み立てる (穴あけからのアクセスポイントをシールする)</td></tr><tr><td>Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher</td><td>Scientific R11491</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin, Sodium Salt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Surface Decontaminant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>SGE ガスタイトシリンジ、ルアーロック、100 mL</td><td>SGE</td><td>100MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>SGE ガスタイトシリンジ、ルアーロック、50 mL</td><td>SGE</td><td>50MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析カセット、20 K MWCO</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>66012</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>32319-500G-R</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ミリポア Σ</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター、滅菌済み</td><td>ジェネッセ・サイエンティフィック</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>ミリポア シグマ</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td> サイエンティフィ<td>ック 25200056</td><td></td></tr><tr><td>水、エンドトキシンフリー</td><td>、高品質、生物学的</td><td>118-325-131</td><td>RNAse および DNAse フリー</td></tr><tr><td>酵母 RNA (10 mg/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM7118</td><td></td></tr></tbody></table>

閉じ込めインピンギングジェットミキサーにおける乱流による脂質ナノ粒子の合成

Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

脂質ナノ粒子(LNP)は、2種類のCOVID-19メッセンジャーRNA(mRNA)ワクチンが承認され、世界中で使用されていることからも明らかなように、治療送達担体として大きな可能性を秘めています。小規模では、LNPは多くの場合、マイクロ流体工学を使用して製造されます。ただし、これらのデバイスには制限があるため、大規模に使用することはできません。COVID-19ワクチンは、CIJ(Exclusiveed Impinging Jet)乱流ミキサーを使用して大量に製造されています。CIJの技術は、生産量まで拡張できるという自信を持って、実験室規模での生産を可能にします。CIJミキシングの重要な概念は、ミキシングの長さと時間スケールがミキシングキャビティ内の乱流強度によって決定され、ナノ粒子の形成が壁から離れて発生するため、表面への堆積や汚れの問題が解消されることです。この研究では、2ジェットCIJと4ジェットマルチインレットボルテックスミキサー(MIVM)の2つの形状の閉じ込めインピンギングジェットミキサー技術を使用してLNPを作成するプロセスを実証しています。各ミキシングジオメトリの長所と短所について説明します。これらの形状では、LNPは、有機溶媒ストリーム(通常はイオン化可能な脂質、共脂質、および安定化PEG脂質を含むエタノール)と水性抗溶媒ストリーム(RNAまたはDNAを含む水性緩衝液)とを迅速に混合することによって形成されます。CIJミキサーとMIVMミキサーの操作パラメータを示し、サイズ、ゼータ電位、安定性、トランスフェクション効果が制御された再現性のあるLNPを調製します。また、混合不良(ピペッティング溶液)で製造されたLNPとCIJ混合の違いについても説明します。

2ジェットCIJおよび4ジェットマルチインレットボルテックスミキサー(μMIVM)を含む閉じ込め衝突ジェット(CIJ)ミキサー技術を使用して脂質ナノ粒子(LNP)を合成するための詳細なプロトコルが実証されています。CIJミキサーは、再現性のある乱流マイクロミキシング環境を生成し、単分散LNPを生成します。

Lipid nanoparticles (LNPs) have demonstrated their enormous potential as therapeutic delivery vehicles, as evidenced by the approval and global usage of ...

synthesizing-lipid-nanoparticles-turbulent-flow-confined-impinging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。...

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

ナノ材料基礎科学と並進アプリケーション制御治療薬デリバリーの汎用性の高いメカニズムを提供するが、頻繁に彼らの作製最も生物医学研究所で利用されていない専門知識が必要があります。ここでは、スケーラブルな製造およびフラッシュ nanoprecipitation を使用して多様な片岡の治療読み込み用のプロトコルを提案する.

高速でスケーラブルなアセンブリおよびフラッシュ Nanoprecipitation を介して多様な合成ナノキャリアへ生理活性タンパク質や生理の読み込み

フラッシュ NanoPrecipitation (FNP)...

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

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ここでは、ホタルルシフェラーゼをコードするmRNAをカプセル化する脂質ナノ粒子(LNP)を製剤化するためのプロトコルが提示されます。これらのLNPは、in vitro でHepG2細胞で、in vivo...

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設計された混合プロセス実験と自己検証アンサンブルモデル(SVEM)を使用した脂質ナノ粒子(LNP)製剤最適化のワークフロー

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ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

学ぼう、閉じ込めインピンギングジェットミキサーを用いた乱流混合による脂質ナノ粒子の再現性のある合成方法。スケーラビリティと均一性を向上させ、創薬研究におけるナノ粒子製造の課題を解決します。

閉じ込めインピンギングジェットミキサーにおける乱流による脂質ナノ粒子の合成

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