Name: 無傷の ショウジョウバエ 幼虫のレーザー細胞アブレーションにより、シナプスの競合が明らかになる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 学ぶレーザー細胞アブレーション法により、無傷のショウジョウバエ幼虫でシナプス競合を探索する。この手法は神経回路形成における競合メカニズムの理解と分子スクリーニングへの応用に貢献する。

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2光子顕微鏡での実験は、FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Coreで行われました。ジュピターライフサイエンス・イニシアティブの皆様には、多大なるご支援をいただき、誠にありがとうございます。

議定書に使用されたすべての動物は、 ショウジョウバエ・メラノガスターの種でした。本種の使用にまつわる倫理的な問題はありません。この作業を実行するために倫理的なクリアランスは必要ありませんでした。本研究で使用した ショウジョウバエ の種、試薬、機器の詳細は、 資料表に記載されています。
1. ショウジョウバエ の繁殖と正しい幼虫期の選択
<ol><li>アブレーションする細胞内の発現を駆動するGal4ドライバーラインを選択し、UAS-GFPレポーターラインと再結合または交差させます。25°Cの標準的なフライフードでフライを育てます。 注:ジャイアントファイバー(GF)アブレーションの場合、R91H05-Gal4またはA307-Gal4をUAS-GFPと再結合しました。ShakB(致死)-GAL4をUAS-GFPと再結合させてTTMnアブレーションに使用しました( 材料の表を参照)。</li>
	<li>食物から出始め、食物バイアルの側面を這い上がる幼虫を選択します。これらの幼虫は、GF細胞アブレーションを行うのに適した段階である放浪段階にあります。 注:アブレーションは、どの幼虫の段階でも行うことができます。GF細胞体は脳内で容易に同定できるため、GFSの発達を操作するためには最後の幼虫期が重要であったが、この段階ではGF軸索は標的との結合を行っていない。</li>
</ol>2. 3番目の 幼虫の準備
注:幼虫は、Burraらと同様の方法を使用して麻酔をかけました9。処置時間を短くするために、一度に1匹の幼虫のみを準備します。麻酔薬への短時間の曝露は、実験動物の生存率を高めます10。
<ol><li>フタがしっかり入ったガラス皿を用意します。皿にコットンボールを置き、ドラフトの下に約3〜5 mlのエチルエーテル(危険で可燃性の液体、白衣、手袋、ゴーグル)を追加します。皿に蓋をします。</li>
	<li>ハエのバイアルから個々の3番目の 幼虫を収集します。第3幼虫期 では、幼虫は食品培地を離れ、食品バイアル11の側面に沿って這い上がる。<ol><li>幼虫がまだ動いていて、蛹の形成を開始していないことを確認してください。静止していて体の短縮を示す幼虫は蛹化を開始しており、アブレーションには適していません。小さな絵筆で幼虫を拾います。 注:第 3幼虫期は、発育の72時間(産卵後)の2回目の脱皮後に始まり、25°Cで飼育されたハエの場合は120時間の蛹形成まで続きます。</li>
	</ol></li>
	<li>1匹の幼虫を小さな開いた容器に移します。容器をエチルエーテルを入れたガラス皿に入れ、皿をしっかりと閉じます。ガラス皿を開けるときは、煙が逃げるのを防ぐために、シュノーケルの下またはヒュームフードに入れてください。<ol><li>30秒間隔で、幼虫の入った蓋を皿から取り外し、解剖顕微鏡で幼虫の可動性を確認します。幼虫は通常1分以内に固定されます。マウスフックのけいれんが止まると、幼虫はマウントする準備が整います。3分後に完全に固定されていない幼虫は捨てます。 注:微量遠心チューブの逆さまの蓋の上部(チューブから蓋を取り外したもの)は、容器として使用できます。</li>
	</ol></li>
</ol>3.アブレーションのために幼虫をスライドに取り付ける
<ol><li>麻酔をかけた幼虫をガラス製の顕微鏡スライドに置きます。幼虫を昆虫の生理食塩水の滴に浸します。これにより、幼虫に付着する可能性のある食物の残骸の一部が洗い流されます。</li>
	<li>解剖顕微鏡下で、紙ティッシュペーパーでほとんどの生理食塩水を取り除きます。GFアブレーションの場合は幼虫の背側を上にして配置し、TTMnアブレーションの場合は腹側を上にして配置します。ガラスカバースリップを幼虫の上にゆっくりと下げます。カバースリップの側面に生理食塩水を追加して、スライドガラスとカバースリップの間のスペースを埋めます。</li>
	<li>GFアブレーションの場合は、解剖顕微鏡で高倍率下での脳の位置を確認します。脳が水平に横たわっていて、キューティクルを通して見えることを確認してください。多くの場合、脳は脂肪組織で覆われているため、視覚化や細胞のアブレーションが不可能になります。<ol><li>脳を覆っている脂肪組織を変位させるには、鉗子でカバーガラスにわずかな圧力をかけ、カバーガラスを左右に動かします。この方法で脂肪組織を脳から遠ざけることができない場合は、代わりに別の幼虫を使用してください。</li>
	</ol></li>
</ol>4. ターゲットセルの位置特定
注:この研究に使用した多光子システムは、正立顕微鏡に取り付けられました。システム固有のソフトウェアを使用して、取得とレーザー刺激の設定を制御しました。このシステムには、サンプルの位置を特定するための落射蛍光光源が装備されていました。対物レンズは、倍率25倍、作動距離が2mmと長く、NAが1.10の水浸レンズでした。
<ol><li>サンプルを多光子顕微鏡のステージに置き、GFPフィルターを使用してサンプルを落射蛍光モードで位置を特定します。GFアブレーションの場合、 図1A、C、Dに示すように、細胞体を脳内で識別できます。TTMn アブレーションの場合、 図 1A、B に示すように、腹側神経索 (VNC) の腹側から 4 つの細胞のクラスターを識別できます。ピントを合わせたら、セルを視野の中央に配置し、2光子モードに切り替えます。</li>
</ol>5. アブレーションパラメータの設定
<ol><li>レーザー設定と検出器のゲインを調整して、ガルバノスキャナーでGFP発現細胞を観察します。870nmの波長は、GFP信号を視覚化するのに最適です。セルを視野の中央に配置します。</li>
	<li>円形の関心領域(ROI)を使用して、アブレーションの領域を定義します。ROIがセルの表面の大部分をカバーしていることを確認します(図1E、G)。</li>
	<li>ソフトウェアでアブレーションプロトコルを設定します。1つの取得フレームを設定し、次に刺激を設定し、その後に別の取得フレームを設定します。</li>
	<li>刺激レーザー出力設定を低い値(10%-20%)で開始し、刺激プロトコルを実行します。アブレーションの成功は、ROIの位置にある細胞体の中心にある明確な円と、ROIを取り巻く蛍光の増加によって認識できます(図1F)。<ol><li>アブレーションが成功せず、単に細胞を漂白しただけの場合(図1H)、レーザー出力を5%ずつ増やすか、一度に1つのループ数を増やして、プロトコルを再度実行します。適用されたレーザー出力は、プロトコルで使用されたシステムで10%から40%の間でした。 注:アブレーションのレーザー出力設定は、細胞が組織内にどれだけ深く位置しているか、およびキューティクルの折り畳みなどの他の要因に大きく依存します。細胞が明るくはっきりと見える場合、レーザー出力は範囲の下限になります。レーザー出力は、レーザーのモデルとレーザーの年齢によって、システムごとに異なります。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig01.jpg"> 図1:無傷の ショウジョウバエ L3幼虫におけるレーザーアブレーション用ニューロンの同定 (A)脳内の巨大線維(GF)体細胞の位置と、腹側神経索(VNC)のターゴトロシャンテラル運動ニューロン(TTMn)を含む運動ニューロンのクラスターの概略図。(B)幼虫VNCにおけるGFPの発現を駆動するshakB(lethal)-Gal4の最大強度投影。正中線は点線で示されます。円は、レーザーアブレーションの対象となるTTMnを含むニューロンのクラスターを示しています。スケールバー:50μm.(C)A307-Gal4の制御下でGFPを発現する幼虫の脳の部分投影図。円はレーザーアブレーションの対象となるGF体細胞を示しています。スケールバー:50μm.(D)R91H05-Gal4がUAS-GFPを駆動する脳の最大強度投影。両方のGF(円)は、位置、形状、およびサイズによって識別できます。スケールバー:50μm.(E)レーザーアブレーション前のGF体細胞拡大図。マゼンタの円は、レーザーアブレーションのターゲット領域を示しています。スケールバー:10μm.(F)局所的なレーザー出力と成功したアブレーションの配信後のGF体拡大図。スケールバー:10μm.(G)レーザーアブレーション前のGF体細胞の拡大図。マゼンタの円は、レーザーアブレーションのターゲット領域を示しています。スケールバー:10μm.(H)局所的なレーザー出力とアブレーションの失敗(漂白)の配信後のGF体拡大図。スケールバー:10μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig01large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
6.幼虫の回復
<ol><li>細胞のアブレーションに成功したら、カバースリップをはがし、絵筆でスライドから幼虫をそっと拾います。幼虫をフードバイアルに入れます。幼虫は30分以内に再び這い回り始めます。 注:処置時間を短くすると、動物の生存率が向上します。経験を積めば、実験は10分未満で行うことができます。</li>
	<li>幼虫が蛹のケーシングから閉じるまで、標準的な状態で幼虫を飼育し続けます。</li>
</ol>7. 成虫のハエにおけるGFSの機能試験
注:次の手順は、Allan and Godenschwege12およびAugustin et al.13で詳細に説明されています。
<ol><li>テスト成虫は、卵閉後2〜5日でハエを飛ばします。麻酔はCO2 で飛んでいき、脚をワックスに押し込むことによって歯科用ワックスに取り付けます。翼を90°の角度で広げ、ワックスで所定の位置に固定します。テングをワックスに押し込んで頭を固定します。</li>
	<li>両目に刺激ワイヤーを、腹部にアースワイヤーを、両側のジャンプ筋(TTM)にガラス記録電極を配置します。</li>
	<li>単一の刺激でGF回路を刺激して、両方の筋肉の応答遅延を測定します。それぞれ100Hzと200Hzの一連の刺激で回路を刺激し、両方の筋肉の次の周波数を測定します。</li>
</ol>8. 共焦点イメージングのための巨大ファイバーシステムの解剖と標識
注:フライCNS解剖と色素注入については、BoernerおよびGodenschwege14に詳述されています。
<ol><li>鉗子でデンタルワックスからフライをそっと取り除き、解剖スコープの下でシリコンエラストマーで裏打ちされたペトリ皿に移します。</li>
	<li>ハサミで脚、翼、吻を取り除き、昆虫ピンを使用してハエの背側を上にしてエラストマーコーティングに固定します。</li>
	<li>中腹部から胸部全体、首まで正中線に沿って横方向に切開し、胸部と頭部を接続します。昆虫ピンでフライを開きます。神経系に損傷を与えることなく、ハエから臓器や腺を取り除きます。 注:この時点で、GF軸索に色素を注入して、GFおよび電気的に結合したニューロン13を標識することができる。</li>
	<li>ヘッドカプセルをヘッドから取り外して、脳を露出させます。</li>
</ol>9. 神経系の免疫組織化学
<ol><li>CNS解剖後、フライをPBS中の4%PFAに室温(RT)で45分間固定します。PBSでRTで20分間洗浄します(3回)。</li>
	<li>サンプルを室温で1時間、PBS中の3% BSA溶液中、0.5%界面活性剤溶液でブロッキングします。</li>
	<li>0.3%界面活性剤溶液およびウサギ抗GFP(1:500)を用いて、PBS中の3% BSA中4°Cで2〜3晩インキュベートします。RTでPBSで20分間洗浄します(6回)。</li>
	<li>PBSで抗ウサギ剤Alexa 488を用いて4°Cで一晩インキュベートします。RTでPBSで20分間洗浄します(6回)。</li>
	<li>上昇エタノールシリーズ(50%、70%、90%、100%エタノール)でサンプルを各ステップで10分間脱水します。ピンを取り外し、腹部と飛行筋を切り取ります。神経系を含む胸部の残りの部分をスライドに移し、サリチル酸メチルなどの封入剤で覆います。サンプルにカバースリップを置き、マニキュアで密封します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡で神経系を画像化し、GF終末の解剖学的構造を分析します。</li>
</ol>

神経系適応を研究するための ショウジョウバエ における単一ニューロンアブレーション

<ol><li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A+Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Bower, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+branching+has+conserved+needs+for+local+parasympathetic+innervation+but+not+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission.</a> BMC Biol. 12, 92(2014).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+Development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).</li>
<li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binocular+interaction+in+striate+cortex+of+kittens+reared+with+artificial+squint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).</li>
<li>Wiesel, T. N., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+unilateral+and+bilateral+eye+closure+on+cortical+unit+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+giant+fiber+neuron+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+%28GFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+d.+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster.</a> J Vis Exp. (47), e2412(2011).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+preparation+of+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord+for+giant+fiber+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection.</a> J Vis Exp. (52), e3080(2011).</li>
<li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutation+in+shaking-b+eliminates+electrical%2C+but+not+chemical%2C+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%3A+A+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study.</a> J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).</li>
<li>Kennedy, T., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+electrically+coupled+neurons+support+development+of+the+Drosophila+giant+fiber+model+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit.</a> eNeuro. 5 (6), 0346(2018).</li>
<li>Mcfarland, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+arrival+times+and+physical+occupancy+establish+visual+projection+neuron+integration+on+developing+dendrites+in+the+Drosophila+optic+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
</ol>

著者は何も開示していません。

2光子顕微鏡による細胞アブレーションは、 ショウジョウバエの神経回路発達を操作するための非常に成功した方法であることが証明されました。この方法は非侵襲的であるため、動物へのダメージは最小限に抑えられます。このデータは、既知の回路のこの細胞特異的な操作の有用性を裏付けています。
アブレーションを成功させるために重要だったのは、最も適切なGal4ドライバーを選択することでした。GFSは十分に研究されているため、多くの特定のGal4ドライバーラインが説明されています7。ほとんどのGal4ドライバーは非常に制限されていますが、それでも他の多くのニューロンで発現しています。課題の1つは、無傷の動物の標的細胞を確実に同定することでした。GFP標識がはっきりと見える動物の場合、アブレーションは低レーザー出力で実施でき、多くの場合、1回の試行で済みました。脂肪組織が脳を覆っている動物やGFP発現が弱い動物では、標的細胞の欠失にはより高いレーザー出力と複数回のレーザー照射ループが必要でした。GF細胞体は、脳の背側から約100μmの深さに位置していました。標的細胞がより深いところにある実験では、神経系が小さい幼虫の初期段階でアブレーションを行うことが有用かもしれません。
研究室での以前の実験では、細胞アブレーションのさまざまな方法が検討されました。UAS/Gal4システムを使用して毒素の発現を促進すると、特定のニューロンの欠失ももたらされました。しかし、単一細胞の欠失を制御し、オフターゲット効果を回避することははるかに困難です。もう1つの難しさは、セル欠失イベントの正確なタイミングを制御することです。レーザー細胞アブレーションにより、標的位置や欠失のタイミングを正確に制御することが可能になりましたが、この方法が完成し、成功率が80%を超える(動物の生存率と細胞アブレーションの成功率)に達するまでには、まだ克服すべき課題がいくつかありました。動物の生存率は、エチルエーテルへの長時間の曝露と長い処置時間によって悪影響を受けました。研究によると、L3 ショウジョウバエ の幼虫をエチルエーテル10に3.5分間曝露すると、蛹化(78%)および成虫への排泄(67%)までの高い生存率を達成できることが示されています。3.5分間の曝露により、動物は最大8時間動かなくなります。レーザー細胞アブレーションの場合、動物は30分以内に動かないようにする必要があります。したがって、エチルエーテルへの曝露時間は3.5分未満に抑えることができます。ほとんどの場合、幼虫は1分以内に完全に動かなくなりました。
レーザーアブレーションの結果は、GFをきれいにアブレーションでき、反対側の隣接するGFへの影響を簡単に評価できることを示しています。アブレーションの結果は明確で一貫性がありました。15回のシングルセルアブレーションのうち13回では、残りのGFパートナーは、対照動物では見られない両側末端を示しています。この左右対称の末端は容易に認識でき、異常な対側枝は正常な末端とサイズが類似しており、対側標的運動ニューロンに色素結合しています。両側末端は、両方の標的運動ニューロンに色素結合されており、ほとんどの標本でほぼ野生型として機能し、正常同側標的と対側標的運動ニューロンの両方を遅延と制御値に近い周波数で駆動します。
標的運動ニューロンの片側アブレーションである補完的な実験は、興味深い比較を提供します。残りの運動ニューロンは、しばしば反応性の樹状突起成長を示し、正中線を横切って、通常は欠失した隣接ニューロンが占める空間にプロセスを拡張します。この樹状突起は削除された樹状突起ほど大きくはありませんが、GFが両側の配偶者を失ったのと同様の反応を示します。対照的に、現在ターゲットのないGFは、存在しないターゲットに対してわずかに反応し、正中線を横切って残りの運動ニューロン樹状突起に沿ってマイナープロセスを拡張します。この控えめな応答は、正常な終端を補完して両側の終端を形成するために大きな対側終端が形成される、両側相同GFの欠落に対するGFの劇的な応答とは対照的です。
最近、脳内のGFへのシナプス前入力について並行アブレーション実験が行われ、シナプス空間に対する同様のタイプの「競争」が明らかになった17。GFタイルへの視覚入力は、視覚投影ニューロン(VPN)がGF樹状突起に到達する糸球体です。VPNの1つのグループを(この場合は遺伝的に)削除すると、残りのVPNが不在の隣人のシナプス空間の一部を引き継いで神経支配し、迫り来る刺激に対する視覚反応の代償的な生理学的回復を生み出すことが実証されています。最初に到着した求心性神経が削除されると、後から到着した求心性神経はスペースを占有し、占有されなくなります。本研究との主な現象学的類似性は、さまざまなインプット間のバランスを決定する上で物理的な占有が果たす明らかな役割である。2つのGFの出力端子は、物理的なシナプス空間をめぐって互いに競合しているように見えます。

レーザーアブレーションは、さまざまな生物の神経回路を解剖するための好ましいツールです。ミミズやハエなどのモデル遺伝システムで開発され、神経系の構造、機能、および発達を研究するために動物界全体に適用されています1,2,3。ここでは、ショウジョウバエの回路組み立て中にニューロンがどのように相互作用するかを調べるために、単一ニューロンアブレーションが使用されました。ハエの脱出システムは、成虫のハエで最大のニューロンと最大のシナプスを含んでおり、その回路は過去数十年で十分に特徴付けられてきたため、分析のお気に入りの回路です4。ジャイアントファイバー回路の組み立てにおいてニューロン間相互作用が果たす役割は、この研究の焦点です。
1960年代のヒューベルとヴィーゼルの研究以来、神経科学で焦点となってきた相互作用の1つのタイプは、「シナプス競争」5,6です。このプロトコルでは、レーザーアブレーションを使用して、ショウジョウバエの巨大繊維系(GFS)における単一細胞アブレーションによる競争の役割を再検討し、現象の分子基盤が発見される可能性が示唆されました。
発育中のハエのニューロンのアブレーションは、標的ニューロンの可視化、アブレーション法の精度、標本の生存など、さまざまな理由で困難でした。GFSにおけるこれらの問題を克服するために、UAS/Gal4システム7 を用いて対象ニューロンを標識し、2光子顕微鏡を用いてシナプス前巨大線維またはシナプス後ジャンプ運動ニューロン(TTMn)を除去した。
本研究では、GFSにおけるシナプス結合性とシナプス強度の調整において、隣接する両側性ニューロンが果たす役割を明らかにするために、両側性ニューロンのペアの1つ(シナプス前GFまたはシナプス後運動ニューロン)を蛹の発生直前に欠失させた。この発生段階では、GF軸索形成は完了していません8。次に、成人のシナプス回路のGF構造と機能を調べ、残りのGFの出力に特に注意を払いました。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jaxkson ImmunoResearch</td><td>111-545-003</td><td></td></tr><tr><td>抗緑色蛍光タンパク質、ウサギ</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>1:500 濃度</td></tr><tr><td>Apo LWD 25x/1.10W Objective</td><td>Nikon</td><td>MRD77220</td><td>水浸 長時間作動距離</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Σ</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Ball</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td></td></tr><tr><td>Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1817</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila saline</td><td></td><td></td><td>recipe from Gu and O'Dowd, 2006</td></tr><tr><td>Ethyl Ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-1</td><td>危険、可燃性液体</td></tr><tr><td>フライフードB(ブルーミントンレシピ)</td><td>LabExpress</td><td>7001-NV</td><td></td></tr><tr><td>サリチル酸メチル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O3695-500</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ1.5 mL</td>エ<td>ッペンドルフ</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバースリップ18x18#1.5</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>ニューロビオチントレーサー</td><td>ベクター研究所</td><td>SP-1120</td><td></td></tr><tr><td>ニコン A1R 多光子顕微鏡</td><td>直立した FN1 マイクロソープスタンド上の</td><td>ニコン</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Advanced Research</td><td>ニコン</td><td></td><td>取得およびデータ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (リン酸緩衝塩分)</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP2944-100</td><td>錠剤</td></tr><tr><td>R91H05-GA4</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストック センター</td><td>40594</td><td></td></tr><tr><td>shakB(致死)-GAl4</td><td>ブルーミントン ショウジョウバエ ストック</td><td>センター 51633</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト顕微鏡 ガラス スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>422355000</td><td>洗剤溶液</td></tr><tr><td>UAS-10xGFP</td><td>ブルーミントンショウジョウバエストック</td><td>センター32185</td><td></td></tr></tbody></table>

無傷の ショウジョウバエ 幼虫のレーザー細胞アブレーションにより、シナプスの競合が明らかになる

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ メラノガスター 幼虫の中枢神経系 (CNS) における 2 光子レーザー システムによる単一ニューロン アブレーションについて説明しています。この非侵襲的な方法を用いて、発生中の神経系を細胞特異的に操作することができる。ネットワーク内の個々のニューロンの発達を阻害することで、神経系がシナプス入力の喪失をどのように補うことができるかを研究することができます。 ショウジョウバエの巨大線維系では、シナプス前巨線維(GF)とシナプス後大転子運動ニューロン(TTMn)の2つのニューロンに焦点を当てて、個々のニューロンが特異的にアブレーションされました。GFは同側のTTMnとシナプスを形成し、これはエスケープ応答に重要です。GFが軸索成長を開始した直後に、第3インスター 脳のGFの1つを切除すると、CNSの発達中に細胞が永久に除去されます。残りのGFは不在の隣人に反応し、反対側のTTMnに対して異所性シナプス終末を形成します。この非定型の両側対称末端は、色素結合によって実証されるように両方のTTMnsを神経支配し、電気生理学的アッセイによって実証されるように両方の運動ニューロンを駆動します。要約すると、単一の介在ニューロンのアブレーションは、片側のニューロンの喪失を補い、エスケープ回路に対する正常な応答を回復できる両側のニューロンのペア間のシナプス競争を示しています。

この方法は、 ショウジョウバエの神経系における特定のニューロンネットワークの発達を操作するために使用できます。ここでの主な研究課題は、シナプス結合の形成でした。シナプス前GFまたはシナプス後TTMnのいずれかを取り除くことで、この中央シナプスでの反応性シナプス形成と、シナプスの機能と発達に重要な分子メカニズムの研究が可能になりました。プロトコルに記載されているように、GFの1つまたはTTMnsの1つのレーザー細胞アブレーションを行い、成虫のハエにおける蛹発生後のシナプスへの影響を分析した。
この手順が動物の生存に悪影響を及ぼさないようにするために、模擬アブレーションが並行して行われました。模擬アブレーションでは、動物は実験動物と同じように扱われましたが、レーザーパルスは0%のレーザー出力で照射されました。82.4%のケースで、模擬アブレーションの動物が成虫のハエに成長しました。模擬アブレーションされたハエのGFは、1ミリ秒未満の潜伏時間で応答し、刺激の79.3%で100Hzの刺激に従うことができました。GFの解剖学的構造は、未処理のハエと見分けがつかなかった。
各実験動物について、アブレーションを解剖学的に検証しました。GFアブレーション動物では、アブレーションされていないGFを色素注入し、画像化しました(下記参照)。頸部結合 (CvC) に 1 つの GF 軸索のみが見える場合、もう 1 つの GF のアブレーションが想定されました。アブレーションは、脳のアブレーション側にGFP標識体が存在しないことによっても確認できました(図2A、円)。TTMnアブレーションを評価するために、成体VNCのGFPシグナルを解析し、TTMn体細胞と樹状突起を容易に同定できるようにした。片側にTTMnがないことは、体細胞と樹状突起が欠落しているため、容易に認識できました(図2B、円)。
治療を受けたハエにおけるGFSの機能をテストするために、TTMnによって神経支配されるジャンプ筋12,13からのシナプス電位を記録した(図3A)。GFは、TTMn内側樹状突起15と混合電気化学シナプスを形成する。GF末端は分岐しておらず、シナプス領域でTTMn樹状突起とは対照的な典型的な横方向の屈曲を示しています(図3D、図4A矢印)。コントロールフライでは、各GFは同側の運動ニューロンを排他的に神経支配します。TTMファイバーからの記録では、1 Hz刺激での応答潜時と100 Hz刺激での追従周波数を分析することにより、接続の強度を評価しました(図3B、C)。対照バエは、平均応答潜時が1ミリ秒未満であり、刺激の78.1%で100Hzの刺激を追うことができました(図3B)。生理学的記録を行った後、標本を解剖して中枢神経系とGFを明らかにし、これらにTRITC-デキストランとニューロビオチンの混合物を色素注入しました。大きなデキストラン分子はGF軸索と末端を標識しますが、ギャップ結合は通過しません。ニューロビオチンはGFとTTMnの間のギャップ結合を横切ることができ、ニューロビオチンシグナルはシナプス後樹状突起で検出されました(図3E、F、矢印)。このニューロビオチン色素カップリングにより、2つのニューロン間の電気的カップリングが確認されました。ニューロビオチンは、ギャップ結合を介してGF16に接続されているVNC内の他の多くのニューロンでも検出できます(図3E、F)。
同じ生理学的および解剖学的試験を、1つのGFがL3で切除された後に実施されました。アブレーションフライの残りのGFのほとんど(13/15)の軸索は、末端が2つの枝に分割されていることを示しています:1つは通常の同側位置にあり、もう1つは正中線を横切って無傷のGFとは反対側の相同位置にあります(図3G、矢印)。各枝は、TTMn樹状突起の1つに染色結合されました(図3H、I、矢じり)。TTMからの生理学的記録は、1つのGFと両方のTTMnへのこのシナプス結合を確認しましたが、通常よりも弱かったです。TTM 応答レイテンシは両側で 1 ms を超え、100 Hz での次の周波数は、インタクト GF に対する TTMn 同側で 37.1 %、反対側 TTM で 28 % でした(図 3C)。
一方のGFをアブレーションすると、残りのGFが両方の標的ニューロンを神経支配するため、次の実験では、一方が正常な同側の標的運動ニューロンを欠いている場合の隣接するGFの応答を観察することを目的としていました。この実験では、シナプス後ニューロンの1つを削除し、残りのTTMnの解剖学的構造と機能、およびGF末端の形態を評価しました。成体対照動物のTTMnsとGFの両方を可視化したところ、シナプス接触と推定される領域がはっきりと見えました(図4A、矢印)。各TTMn内側樹状突起は、同側のGFシナプス前末端に付与されました。両側からのTTMn樹状突起の小さな突起が正中線に接触していました(図4C;挿入図)。ニューロビオチンとの色素カップリングは、両方のTTMnで顕著に見られました(図4D、矢印)。
1つのTTMnを切除すると、残りのTTMn内側樹状突起の形態が変化しました。これらの標本の内側樹状突起は、正中線を横切って長くて太い枝を伸ばしていました(図4I、K、黄色の矢印)。さらに、両方のGF端子に向かって細い突起が前方に伸びています(図4E、G、黄色の矢印)。GFはTTMnと同側で、TTMn樹状突起に沿って突出する末端で通常の解剖学的構造を示しました。
標的運動ニューロンを欠く「孤立した」GFの反応は、主な関心事でした。ほとんどの場合(動物の61.5%)、孤児となったGFは、一方の末端が同側にあり、もう一方の末端が正中線を横切って反対側のTTMn樹状突起に向かって突き出ている分割末端を示しました(図4J、矢印)。これらのGFの交差した枝は、隣接するGFがアブレーションされたときに相補的な実験で見られたものよりも常に小さかった(図3F)。同側端子は、正中線を横切って伸びるTTMn分岐に接触しました(図4I、黄色の矢印)。標本の23%で、孤立したGFは正中線を横切り(図4F、矢印)、TTMn前枝の1つに沿って突出し(図4E、黄色の矢印)、残りのTTMnに色素結合しました(図4H、矢印)。
さらに2つの表現型がTTMnアブレーションフライで観察されました(図4M)。13匹中1匹のフライでは、両方のGFが正常な曲がりをし、神経系のそれぞれの側に留まりました。別のケースでは、孤児となったGFは、孤立したGFが終末を作らず、通常は曲がる領域の前で停止するという無限の表現型を示しました。4 つの表現型すべてについて、無傷の TTMn 側の TTM 記録は野生型(WT)の生理機能と同等で、応答レイテンシは 1 ミリ秒未満、追従周波数は 100 Hz で 100% または 100% に近かった。1 つのターゲットを削除すると、両方の GF で残りのターゲット TTMn を共有できます。ほとんどの場合、両方の GF が残りの TTMn と接続します。一般的に、孤立したGFは両側端子を示します。コントロールフライでは、GFは正中線を横切ることはありません。しかし、TTMnアブレーションフライの約85%では、片方のGFが正中線を越えて反対側のTTMnに接触していました。1つのTTMnが2つのGFによって神経支配されることは、シナプス機能に悪影響を及ぼさなかった。
注目すべきは、隣接するGFの不在が、標的運動ニューロンの不在よりも大きな影響を与えることです。対側のGFがない場合に形成される両側の末端は、ターゲットが除去されたときの変化よりもはるかに大きく、より明らかに機能的です。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig02.jpg"> 図2:成体中枢神経系におけるアブレーションの成功例 (A)幼虫GFアブレーション後の成虫のハエ脳の最大強度投影。GFP(緑)はA307-GAL4で駆動します。円は、アブレーションされたGFが欠落している領域を示しています。矢印は、脳の反対側にGFPを発現する残りのGFを指しています。GFにはTRITC-Dextran(赤)が充填されていました。軸索はVNCに向かって後方に突き出ています。スケールバー:20μm.(B)L3で1つのTTMnが切除された成人VNCの最大強度投影。残りのTTMn(矢印)は、shakB(リーサル)ドライバーの下でGFPを表現しています。欠落しているTTMnの領域は円で示されます。スケールバー:20μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig02large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig03.jpg"> 図3:1つの巨大線維(GF)の幼虫によるアブレーションは、残りのGFのシナプス前末端の両側分岐を引き起こします。記録電極は、無傷の動物の脳を刺激したときの角転子筋(TTM)での出力である角転子運動ニューロン(TTMn)の潜伏と次の周波数を測定します。神経系の解剖に続いて、色素を頸部結合(CvC)のGF軸索に注入しました。(B,C)100 Hz での TTM 応答レイテンシと追従周波数のサンプル トレース (n は各シチュエーションから記録された TTM の数を表し、平均レイテンシと追従周波数が示されています)。(B)2つの無傷のGFを有する対照動物は、TTM遅延が1ミリ秒未満で、100Hzで100%に近い周波数が続くことを示す。(D-I)色素充填GFの共焦点画像スタックの最大強度投影 TRITC-デキストラン(赤のD、G、F、I)とニューロビオチン(灰色のE、H、F、I)を共注入しました。ニューロビオチンは、GFとTTMnの間のギャップ結合を交差させ、シナプス後ニューロンを標識することができます。点線は正中線を示します。(D)末端が曲がった対照動物の典型的なGF解剖学。(E,F)ニューロビオチンは、GFに電気的に結合した多くのシナプス後ニューロンを標識します。TTMn樹状突起とシナプス的にラベル付けされたトランスは、矢印で示されます。(G)アブレーション後、残りのGFは余分な末端(矢印)を成長させ、それが正中線を横切って反対側のTTMnを神経支配する。スケールバー:20μmこの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig03large.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig04v2.jpg"> 図 4.1つの三転子運動ニューロン(TTMn)の幼虫のアブレーションは、両方の巨線維(GF)によって残りのTTMnの神経支配を引き起こします。(A-L)GFP(緑)で標識したTTMnsの共焦点像スタックをshakB(lethal)-Gal4とGFsの制御下で最大強度投影し、TRITC-デキストラン(マゼンタ)とニューロビオチン(赤)を充填した。点線は神経系の正中線を示しています。(A-D)両方のTTMnsをそのままにして試験片をコントロールします。GFは、TTMn(A、B)に接触するために通常の端子を正中線から離れて曲げ、各GFは1つのTTMnに接触します。 TTMn樹状突起は正中線(C)で出会います。各GFは、そのTTMn(D、白い矢印)に染料が結合しています。(E-H)左のTTMnはアブレーションされました。残りのTTMnの内側樹状突起は、正中線を横切って突出しています(G、黄色の矢印)。孤児となったGFは、シナプス領域で正中線(白矢印)を横切り、反対側のTTMn樹状突起(E,F)に接触します。GFは、残りのTTMn(H、矢印)に色素結合されています。(I-L)左のTTMnが切除された別のGF表現型の例。残りのTTMnの内側樹状突起は、正中線を横切って突出しています(IとK、黄色の矢印)。左の孤立したGFは両側の端末を作ります。スケールバー:20 μm. (M) TTMnアブレーション動物で観察された4つの異なるGF表現型の概略図。nは各クラスの動物の数を示します。TTM応答レイテンシと、無傷のTTMnの側の100Hzでの追従周波数(FF)の標準誤差付き平均が示されています<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig04large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、無傷の ショウジョウバエ の幼虫の個々のニューロンのレーザー細胞アブレーションを示しています。この方法により、発達中の神経系におけるニューロン間の競争を減らす効果の研究が可能になります。

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