Name: 適応性のある分子クローニングコースベースの学部研究経験による学生の成果の向上 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶGibson Assemblyを用いた分子クローニングCURE教育法。学生の実践的理解と自信向上、新規プラスミドのクローニング成功を実現するバイオテクノロジー教育の革新的アプローチを探索する。

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<meta charset="utf8"></head><body>分子生物学の教育とスキルを強化するためのGibson Assemblyの実装

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
</ol>

基本的な分子生物学の概念と実験技術について学部生を訓練することは、これらの方法論が学界や産業界を含むさまざまな研究環境で一般的であるため、彼らの科学的および専門的な開発にとって非常に重要です。そのため、カリフォルニア工科大学サンルイスオビスポ校(Cal Poly)の生物学(分子細胞生物学集中)および生化学専攻の学生は、これらのトピックを学び応用するために、上位の分子生物学実験室コースを受講する必要があります(CHEM/BIO 475)。このコースの基本カリキュラムは、学生がトポイソメラーゼベース(TOPO)クローニングを行い、酵母相補的DNA(cDNA)テンプレート1から調製されたアクチン含有プラスミドを組み立てるというものです。学生は、本物の研究仮説を模倣した問題に基づいて実験を設計し、実験室での実践と探究型学習への親しみを深めます。分子生物学の分野における継続的な進歩には、対応するカリキュラムが、労働力のための現代的な能力を持つ学生を準備するために適応する必要があります。特に、Gibson Assemblyの使用は、科学界でより支配的になっています。この方法はもともと人工染色体2を合成するために確立されましたが、このレポートの時点で5,000を超える出版物がGibsonらの元の研究を参照しています。Gibson Assemblyは、従来のクローニング法と比較して独特で、高度にカスタマイズ可能で、ジャンクションを生成するための制限部位を必要とせずに、複数の直鎖状DNAフラグメントを簡単にライゲーションできます。そこで、CHEM/BIO 475のカリキュラムを刷新し、最新の分子クローニング技術を取り入れ、探究型コースモデルを改善する機会を得ました。
学生の研究経験が、科学における概念的理解、スキル開発、および持続性の向上に貢献することが確立されていますが3、すべての学部生が研究室に直接参加する機会があるわけではありません。研究室での学生の能力が限られているという課題に対処するために、コースベースの学部研究体験(CURE)が開発され、採用され、教室での本格的な研究を通じて科学のアクセシビリティが向上しています。CUREはその実施方法によって異なりますが、科学研究の5つの信条に対応する共通の実践が確立されています。適切に設計されたCUREでは、学生は1)科学的実践を使用し、2)研究プロジェクトに協力し、3)新しい発見を試みる、4)教室の外で関連する仕事に貢献し、5)実験が失敗した場合に仮説と方法を再評価および修正します4。従来の学生の研究室での研究経験と同様に、CUREは、科学、科学スキル、プロジェクトのオーナーシップ、科学、技術、工学、数学(STEM)に対する学生の自信、プロジェクトのオーナーシップ、粘り強さを強化することが示されています5。分子クローニングを含む硬化は以前に報告されていますが、6,7,8,9,10,11,12,13 本ですが、本物の研究プラスミドのライブラリーを作成するための Gibson Assembly の適応性を強調するものは認識されていません。
ここでは、カリフォルニア州立工科大学サンルイスオビスポ校で現在行われている調査ベースのCHEM/BIO 475カリキュラムの拡張について報告します。Gibson Assemblyを使用した実践的な体験と、全米科学財団(NSF-1708919およびNSF-2300890)が資金提供する研究プロジェクトにオリジナルのプラスミドコンストラクトを提供したCUREへの学生の参加という2つの主要な改善が加えられています。このカリキュラムの3回の実施を通じて、学生はActinomycetotaによって生成される生理活性分子の天然物生合成に焦点を当てた2つの異なる研究プロジェクトに貢献しました。天然物には、抗生物質、抗真菌剤、および/または抗がん作用を持つファーマコフォアが含まれていることが多く、これらの小分子は創薬活動において重要であり、臨床的関連性の可能性を示しています14。この研究では、細菌の生合成酵素の機能と工学的可能性の両方を調べるために、プラスミドライブラリーの作製が必要です。このCUREでは、学生はこれらの研究プロジェクトに関連するユニークなプラスミドライブラリをクローニングするためのGibson Assembly実験を設計および実施しました(図1)。さらに、モジュールの形式とデザインは、他の研究プロジェクトで関心のあるプラスミドを生成するために容易に適応できるという点で特徴的です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
図1:当研究室におけるGibson Assemblyの役割の概要。 放線菌は、生合成酵素をコードする遺伝子クラスターを使用して、臨床的に関連する生物活性を持つ低分子天然物を生成します。私たちの研究では、生合成遺伝子を含むプラスミドをGibson Assemblyを介してアセンブルし、コードされた酵素の機能をダウンストリームで調べます。Biorender.com の科学アイコン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
研究室概要
分子生物学研究室は、分子生物学と細胞生物学を集中して学ぶ生化学専攻と生物学専攻に必要な上位課程です。前提条件を満たす他の学生は、上位部門の選択科目としてコースを受講することを歓迎します。このコースは、Cal Polyの化学および生化学部門と生物学部門の間で共同リストされています。両学部の教員が各学期(生物学2学期、化学と生化学4学期)に交代で授業を行います。
クラスは、週に2回、170分、週に1回、50分の講義で研究室で開催されます。ラボセクションには最大16人の学生が含まれ、四半期ごとに2〜3のラボセクションが提供されます。コースは10週間で、最終試験は10週目の最後の会議で実施されます。講義時間は、研究室で実施されている多くの実験技術の背後にある理論や、研究室でカバーされていない分子生物学の現在のトピックについて議論するのに費やされます。ラボのコアカリキュラムには、酵母1からアクチン遺伝子をクローニングするプロセスが含まれており、これには約7週間(13〜14回のラボミーティング)かかります。マイクロピペッティング、酵母RNA単離、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いた酵母遺伝子の増幅、TOPOクローニング、ブルーホワイトスクリーニング、プラスミド単離、制限酵素消化およびPCRによるインサートの検証、クローンの in silico 解析、DNA配列解析などの技術があります。コースの最後の3週間のカリキュラムはインストラクターの裁量に委ねられていますが、学生は未定義の結果を持つ「独立したプロジェクト」を完了する必要があります。
実験の概要
私たちの研究グループでは、放線菌の生合成経路に焦点を当てています。独立したプロジェクトを設計する際には、学生がGibson Assemblyを通じてプラスミドを作成し、天然物の生合成を研究する研究プロジェクトで使用することを想定していました。ここで評価するコースモジュールの反復は、生合成経路の操作を可能にするプラスミドに特有のものでしたが、Gibson Assemblyのワークフローは、他の分子クローニングプロジェクトにも非常に適応可能です(図2)。ワークフローは3つの異なる実験(A、B、C)に分割され、2つの講義期間と6つのラボ期間(合計3週間)で完了しました( 補足ファイル1 および 補足ファイル2を参照)。実験の前には、生徒の準備をサポートし、生徒の理解度を評価するためのワークシート(補足ファイル3、 補足ファイル4、 補足ファイル5)が行われました。ワークフローは、インストラクターのニーズと関心に柔軟に対応できる形式で提供されます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
図2:Gibson Assemblyモジュールのワークフロー。 1日目と4日目は講義期間で、 学生はin silico 配列解析と実験デザインを完成させます。2〜3日目と5〜8日目は研究室のミーティングで、Gibson Assemblyを介して新規プラスミドをクローニングする手順が行われ、その後、単離とスクリーニングが行われます。絵のフローチャートは、学生が実行する3つの実験(A、B、C)によってグループ化されています。より詳細な指示とプロトコルは、それぞれ 補足ファイル1 と補足 ファイル2 として提供されるインストラクターと生徒のマニュアルに記載されています。Biorender.com の科学アイコン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
Gibson Assemblyの独立プロジェクトモジュールは、2019年春四半期にCHEM/BIO 475で初めて試験運用されました。2020年と2021年には、SARS-CoV-2のパンデミックにより、コースはオンラインで教えられました。2022年と2023年の春に対面式の指導が再開されたとき、コース内の学生は、研究に関連するオリジナルのプラスミドをクローニングするGibson Assembly独立プロジェクトの学習成果を評価する研究に参加するよう招待されました。2019年、学生たちは 、Micromonospora echinospora ATCC 15837のゲノムから得られた遺伝子カセットをpKC1132にクローニングしたプラスミドのライブラリを作成しました(図3)。このプラスミドライブラリーは、天然物TLN-0522015の推定生合成遺伝子クラスターで目的の遺伝子を不活性化するために、私たちの研究室で利用されています。私たちの遺伝子不活性化研究を補完するために、2022年の学生は、推定TLN-05220遺伝子クラスターからpUC19に遺伝子の小さなライブラリをクローニングしました(Figure 3)。私たちの研究グループでは、これらのプラスミドを利用して、タンパク質の過剰発現と精製のために、pET28bを含む発現ベクターに遺伝子をサブクローニングしています。2023年のコホートの学生は、エポキソマイシン合成酵素16の生合成工学プロジェクトの進行中の研究に貢献しました。3〜4人のチームで、学生は非リボソームペプチドシンテターゼ17 モジュールの遺伝子操作ドメインをさまざまなタンパク質発現ベクターにクローニングし、私たちの研究室でこれらの酵素の過剰発現と精製を最適化しました(図3)。冗長性は、各コホートのクローニング計画に組み込まれていました。例えば、2019年のコホートには44人の学生が含まれ、クローニングのために15のプラスミドがクラスに割り当てられました。したがって、各プラスミドのクローニングを2回または3回試みました。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
図3:2019年、2022年、2023年の独立プロジェクト反復におけるプラスミドクローニングと学生参加者のまとめ。 Gibson Assemblyプロジェクトは3回展開されています。各オファリングでは、学生参加者は、生合成経路を探索する研究プロジェクトで利用するために、プラスミドの異なるライブラリをクローニングしました。2019年と2022年のプロジェクトは、2つのフラグメント(1つの遺伝子カセットまたは遺伝子とベクター)のギブソンアセンブリ反応を用いた天然物TLN-0522015 の進行中の研究を支援しました。2023年のプロジェクトでは、エポキソマイシン生合成に関与する非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)のモジュール1および2内のドメインスワッピングを行いました16。ハッチングされたフラグメントは、スワップされたドメインの2つの異なる変異体を表し、ソリッドカラーはスワップされなかったドメインを表します。合計で8つの異なる遺伝子フラグメント(モジュール1に4つ、モジュール2に4つ)が生成され、ギブソンアセンブリに適合するオーバーハングがありました。各モジュールについて、3つの遺伝子フラグメントの2つの異なる組み合わせを、2つの異なるベクター(pBAD33およびpET28、アセンブリあたり合計4つのフラグメント)のいずれかとアセンブルし、8つの遺伝子改変NRPSプラスミドを生成する可能性を秘めました。Biorender.com の科学アイコン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
評価の概要
Gibson Assemblyの独立プロジェクト開始の少なくとも1週間前に、2022年と2023年のコホートの学生は、Cal Poly18の生化学ラボコースの調査で実施された研究と同様に設計された学習成果調査に参加するよう招待されました。学生の参加者は、独立したプロジェクトの開始前にラボミーティングで多肢選択式の事前アンケートを完了し、最終ラボミーティング中(つまり、Gibson Assemblyモジュールを完了した後)に多肢選択式の事後アンケートを完了しました。事前アンケートと事後アンケートは、28の同一の質問で構成され、事後アンケートには2つの追加質問(合計30)が含まれていました。分子クローニングに関与する酵素とメカニズムに関する学生の知識を評価するために、10のコンテンツ問題が作成されました(例:ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]、ギブソンアセンブリ、形質転換、青白スクリーニング)。次の7つの質問では、分子クローニング用語(DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼなど)への精通度を自己評価するよう学生に求めました。次の10問では、分子クローニング技術(DNA配列解析、制限消化反応、アガロースゲル電気泳動など)を行う能力を自己評価することができました。また、学生は、分子クローニング技術に関する知識に基づいて、分子生物学のキャリアを追求することに抵抗がないかどうかも報告しました。事後アンケートには、学生がコースでの学習への取り組みと、コースが貴重な学習経験であったかどうかを自己評価するための2つの追加の質問が含まれていました(補足ファイル6 および 補足ファイル7)。2022年と2023年の学生のアンケート前後の回答から得られたすべてのデータは、分析のために組み合わせられ、 補足表S1で入手できます。

<table><tbody><tr><td>デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTPs, 10&nbsp; mM)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>FERR0191</td><td>自家製のマスターミックス成分</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>フィッシャーサイエンティ</td>フィック<td>FERR0861</td><td>自家製のマスターミックス成分</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0176S</td><td>1000ユニット</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドIsotemp微生物学的インキュベーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドイソテン</td>ピ<td>ュウォーターバスフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S28124</td><td></td></tr>ゲル<tr><td>レッド核酸ゲルステイン</td><td>ビオチウム</td><td>NC9594719</td><td>10,000XGeneJET</td></tr><tr><td>ゲル抽出およびDNAクリーンアップマイクロキット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>FERK0831</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA ラダー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FERSM0314</td><td>100 アプリケーション</td></tr><tr><td>LB ブロス、ミラー</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP214-500</td><td>自家製 MasterMix コンポーネント</td></tr><tr><td>マスターサイクラー ネクサス X2 グラジエント サーモサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージ 16 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>マイクロモノスポラ エキノスポラ バクテリア</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td></td><td>電子レンジ ゼネラル・エレクトリック&nbsp;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>分子生物学グレード アガロー</td>ス <td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>ナノドロップ 1 マイクロボリューム分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-α コンピテント大腸菌</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>C2987H</td><td>20 x 0.05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA アセンブリ マスターミックス</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>E2621S</td><td>10 反応</td></tr><tr><td>ニューブランズウィックInnova 40ベンチトップオービタルシェーカー</td><td>ニューブランズウィック</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP248450</td><td>50mL</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP233-100</td><td>Homemade' MasterMixコンポーネント</td></tr><tr><td>Phusion DNAポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Homemade' MasterMixコンポーネント</td></tr><tr><td>ポータブルバランス</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 vector</td><td>New England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 反応</td></tr><tr><td>T5 エキソヌクレアーゼ</td><td>エピセンター</td><td>T5E4111K</td><td>Homemade' MasterMix component</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Homemade' MasterMix component</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1137918</td><td>Homemade' MasterMix component</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>ThermoScientific</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Homemade' MasterMix component</td></tr></tbody></table>

適応性のある分子クローニングコースベースの学部研究経験による学生の成果の向上

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

improving-student-outcomes-with-an-adaptable-molecular-cloning-course

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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学ぶGibson Assemblyを用いた分子クローニングCURE教育法。学生の実践的理解と自信向上、新規プラスミドのクローニング成功を実現するバイオテクノロジー教育の革新的アプローチを探索する。

適応性のある分子クローニングコースベースの学部研究経験による学生の成果の向上

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