オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

私たちのチームは、劣性ジストロフィー性表皮水疱症などの現在不治の皮膚疾患に対する人工多能性幹細胞、iPS細胞療法の開発に取り組んでいます。私たちは、精密な遺伝子編集とiPS細胞の皮膚細胞への分化を組み合わせることで、これらの疾患に対する有効な治療選択肢を提供できるかどうかを判断することを目指しています。CRISPR-Cas9技術を用いた体細胞やiPS細胞の遺伝子編集は、遺伝性皮膚疾患を含む様々な疾患の個別化治療を可能にし、再生医療を変革しています。

遺伝子工学における現在の課題には、遺伝子エディターのオフターゲット効果が含まれます。この治療には、ゲノム内の他の場所を変更することなく、目的の遺伝子を正確に修正する遺伝子エディターが必要です。私たちの課題は、遺伝子編集者が標的遺伝子を超えて意図しない編集を導入しないことを示すことです。

CIRCLE-seqプロトコルは、他の同様の手法では見逃される可能性のある、正真正銘の潜在的なオフターゲット部位の特定を可能にします。これらのオフターゲット部位を包括的に解析することで、ゲノムエディターの活動に関する貴重な洞察が得られ、皮膚疾患に対するIPSCベースの治療を含む遺伝子治療の安全性が向上します。人工多能性幹細胞を5日間増殖させた後、遠心分離により細胞を回収し、10ミリリットルのPBSに再懸濁します。

細胞計数のために、6マイクロリットルの細胞懸濁液を6マイクロリットルのトリパンブルーに混合します。カウント後、チューブあたり7細胞の累乗で10の2倍を分注します。細胞を300Gで25°Cで3分間遠心分離し、上清を捨てます。

コントロールアームをホーミングして、集束超音波装置を準備します。リザーバーを精製された脱イオン水で満たします。Control Stationのラップトップで、水道にアクセスし、[充填]をクリックしてシステムの充填を開始します。

温度を摂氏4.5度に調整します。人工多能性幹細胞から単離した25マイクログラムのゲノムDNAをマイクロチューブに移します。チューブを総容量130マイクロリットルまでTEバッファーで満たします。

DNAを平均長300塩基対、持続時間を10秒、ピークパワーを70、デューティファクターパーセントを20、サイクルバーストを50にせん断する条件を設定します。剪断したゲノムDNAをそれぞれ65マイクロリットルの2つの部分に分割します。1.8倍の容量のXPビーズを使用してサンプルを精製し、続いて磁気ラック分離を行います。

上清を新しいPCRプレートに移し、分光光度計を使用してDNA量を測定します。最後に、言及されたせん断ゲノムDNAの1マイクロリットルをテープステーションで実行します。まず、oSQT1288 とヘアピンアダプターを TE バッファーの最終濃度 100 マイクロモルまで再懸濁します。

アダプターアニーリングには、40マイクロリットルのoSQT1288、10マイクロリットルの10X STE、および50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を混合して、総容量100マイクロリットルに到達します。アダプターアニーリング後、10マイクロリットルの5Xライゲーションバッファー、5マイクロリットルのDNAリガーゼ、および5マイクロリットルのアニールヘアピンアダプターを混合し、ピペット20マイクロリットルのアダプターライゲーションマスターミックスをビーズを含む溶出DNA試料ごとに混合します。サンプルを摂氏20度のサーモサイクラーに1時間置き、摂氏4度で無期限に保持します。

次に、50マイクロリットルのPEG/NaClスプレー溶液をアダプターライゲーションDNAに移します。XPビーズと磁気ラックセパレーションを使用してサンプルを精製します。30 μL の TE バッファー pH 8 でサンプルを溶出し、上清を新しいセミスカート PCR プレートにデカントします。

サンプルを組み合わせ、dsDNA BRアッセイを使用してDNAを定量します。環状化マスターミックスを調製するには、8マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、10マイクロリットルの10X TD4 DNAリガーゼバッファー、および2マイクロリットルのT4 DNAリガーゼを組み合わせ、総容量20マイクロリットルにします。ピペット 20マイクロリットルの循環化マスターミックスを、ユーザーPNKで処理したDNAの500ナノグラムの80マイクロリットルに混合します。

サンプルをサーモサイクラーで摂氏16度で16時間インキュベートします。翌日、100マイクロリットルのXPビーズを環状DNAに加え、前に示したようにサンプルを精製します。38 μL の TE バッファーでサンプルを溶出し、上清を新しいセミスカート PCR プレートにデカントします。

精製された環状化ゲノムDNAを切断するには、5マイクロリットルの10X Cas9バッファー、4.5マイクロリットルの化膿連鎖球菌Cas9、および1.5マイクロリットルのゲノムRNAを組み合わせて、合計11マイクロリットルの切断マスターミックスを調製します。切断マスターミックスを室温で10分間インキュベートします。Cas9 gRNA RNP複合体を形成するため。

プラスミドセーフDNase処理ゲノムDNA125ナノグラムを、ヌクレアーゼフリー水で最終容量39マイクロリットルに希釈します。次に、11マイクロリットルの切断マスターミックスを39マイクロリットルのDNAに加えて、合計50マイクロリットルにします。混合物をサーモサイクラーで摂氏37度で1時間インキュベートし、摂氏4度で無期限に維持します。

インキュベーション後、in vitroで切断したDNAに50マイクロリットルのXPビーズを加え、磁気ラック上でDNAを精製します。精製したDNAを42マイクロリットルのTEバッファーで溶出します。次世代シーケンシングデータの解析には、Pythonバージョン2.7、Burrows-Wheeler Aligner、SAMtoolsをインストールしてください。

参照ゲノムは、所定のウェブサイトからダウンロードしてください。参照ゲノムFASTAファイル、解析の出力ディレクトリ、BWAコマンドとSAMtoolsコマンドへのパスを定義します。ヌクレアーゼ切断サンプルとコントロールサンプルの両方について、ターゲット配列と逆多重化したFASTQファイルへのパスを指定します。

次のコマンドを使用して、標準の参照ベースの解析を実行します。完全なパイプラインを実行する場合は、各ステップの出力結果を、その特定のステップに指定された個別の出力フォルダーに配置します。