Name: DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶDNA損傷応答におけるタンパク質相互作用の検出法。近接リガンドアッセイとγ-H2AX染色を組み合わせ、U2OS細胞を用いてDNA損傷部位でのタンパク質局在化を可視化する手法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>DNA損傷におけるタンパク質相互作用と局在の評価

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
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<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>黒色 384-well plates</td><td>Perkin Elmer Cell carrier plates</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey&nbsp; anti- Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link Donkey anti Mouse Minus</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink 抗体希釈剤</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Duolink ブロッキング溶液 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Duolink検出試薬 遠赤色</td><td>シグマ</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink ドンキー 抗ヤギ プラス</td><td>シグマ</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink ドンキー 抗ウサギ プラス</td><td>シグマ</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>エトポシド</td><td>Σ</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗 Nek4</td><td>サンタ クルス バイオテクノロジー</td><td>SC-5517</td><td>ヤギ 抗 Nek4 を 1:50 希釈で使用しました</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0.6 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>ライカ DMI 顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗 Ku70</td><td>Thermo</td><td>MA5-13110</td><td>マウス 抗 Ku70 を 1:100 希釈で使用しました</td></tr><tr><td>マウス 抗 TOPII&β;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Rabbit anti Nek5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Rabbit anti Y H2AX</td><td>Cell Signalling</td><td>9718S</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>U2OS cell line</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

dna損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

エトポシド処理をしていない状態でNek4-Ku70の相互作用が観察されています。ただし、この相互作用は原子核の外側で発生する可能性があります(図1A)。Nek4-Ku70相互作用はDNA損傷後に増加し、核に集中します(図1A)。Nek5-トポイソメラーゼII β(TOPIIβ)相互作用の場合、文献結果18に基づくポジティブコントロールとしてこのアッセイで使用され、相互作用はエトポシド処理によって大幅に増加する(図1B)。
エトポシド処理は、ほぼ 40% の増加を促進します (ビヒクル処理された細胞の平均 9 ドット/核に対して、エトポシド処理された細胞では 12 - 14 ドット/核)。Nek4とKu70の相互作用は、DNA損傷条件に限定されません。実際、Nguyenら12 は、これらのタンパク質が細胞損傷の不在下で相互作用し、DNAに依存しないことを示しました。これは、相互作用が必ずしもDNA損傷部位にあるとは限らないことを意味します。
γ-H2AX染色は、コントロール条件下では見られませんが、エトポシド処理の20分後に増加し、処理の3時間まで持続します(図1C)。相互作用ドットの一部は、γ-H2AX染色に近いです(図1C)。1時間の処理後、Nek4-Ku70相互作用ドットの大部分はDNA損傷病巣に集中します(図1C)。
Nek4のノックダウンは約70%(データは示されていません)であり、信号が完全に除去されるわけではありません。私たちは、ドット/核の数の違いはタンパク質の枯渇と同等ではないと考えています。なぜなら、回想タンパク質はDNA損傷応答に専念し、その後Ku70と相互作用するからです。エトポシドで3時間処理したNek4ノックダウン細胞に見られるドット/核の平均は10であり、同じ条件の対照PLKO細胞と比較して約30%減少することを意味します。エトポシドがビヒクル処理細胞に関連してNek4-Ku相互作用を40%増加させ、Nek4ノックダウンが70%あると考えると、ノックダウン細胞は約10ドット/核を示します。Nek4とKu70の相互作用はDNA損傷応答に限らず、DNA損傷後に増加するものの、大きな変化は相互作用の局在化にあります。
ここで示す結果は、DNA損傷応答の文脈でタンパク質の相互作用を局在化するための重要なツールを示しています。Nek4とKu70はすでにDDRに関与しており、Nek4はKu70/Ku80のDNA損傷病巣12へのリクルートにとって重要であるように思われる。しかし、この相互作用の空間的および時間的特性は、PLAとγ-H2AX染色を併用することで調査することができます。
共免疫沈降法や免疫蛍光法などの他の手法でも、同様の情報を提供できますが、個別に得られます。γ-H2AXマーカーを参照として使用すると、相互作用の時間的および空間的なモニタリングが可能になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> 図1:DNA損傷条件におけるNek4-Ku70相互作用。 (A)U2OS細胞をエトポシド(25μM)と20分間、1時間および3時間インキュベートし、DMSO(0.05%、3時間)をビヒクルとして使用した。処理後、細胞を氷冷メタノールで固定し、ヤギ抗Nek4とマウス抗Ku70を一次抗体としてPLAを行いました。核はHoechst 33342で染色され、青色で示されています。PLAドットは赤で示されます。コントロール細胞をエトポシドで1時間処理した細胞を、1つの一次抗体(ヤギ抗Nek4)と両方の二次抗体のみでインキュベートしました。生物学的防除は、Nek4ノックダウン細胞(shRNA Nek4)をエトポシドで3時間処理した。(B)文献結果に基づくアッセイのポジティブコントロール:U2OS細胞を25μMのエトポシドと1時間インキュベートし、PLAをマウス抗Nek5およびウサギ抗TOPIIβで行いました。このグラフは 1 つの実験を表しており、少なくとも 4 つの異なるフィールド (制御用に少なくとも 35 個のセル、他のすべての条件用に 50 個のセル) に含まれるすべてのセルからの平均と標準誤差平均 (SEM) を表しています。有意性は、t検定と*:p&lt;0.05、**p&lt;0,01、および***p&lt;0,001を使用してDMSO車両と比較して取得されました。(C)PLA後、(A)に提示された細胞をPBSで洗浄し、ウサギ抗γ-H2AX抗体とインキュベートした。インキュベーションの1時間後、ウサギに対する二次抗体をDNA損傷病巣検出に使用し、緑色で示しました。PLAとγ-H2AXの共染色を含む領域を拡大します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:フォルダ構造。 Nucleus と PLA の画像は、次に示すように、異なるフォルダーに配置する必要があります。ファイル名は特定のプレフィックス(DAPI、PLAなど)で始まり、各フォルダに対応する画像(DAPI_control1.tifやPLA_control1.tifなど)を含める必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:マクロパラメータウィンドウ。 ImageJ/FIJIでマクロを開いたり実行したりした後、ユーザーはデータフォルダを選択してパラメータを入力するように求められます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
Supplementary Coding File 1: ImageJ用に作成したマクロファイルです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

DNA損傷部位におけるタンパク質の局在化のための近接リガンドアッセイ

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