Name: 植物様キナーゼの低形対立遺伝子を保有する突然変異型マラリア原虫における代償経路の発達の理解 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶマラリア原虫の植物様キナーゼ低形対立遺伝子における代償経路の発達。CRISPR-Cas9を用いた遺伝子編集により、薬剤耐性を回避するためのデュアルキナーゼ標的化戦略の可能性を探索する。

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<meta charset="utf8"></head><body>マラリア原虫におけるキナーゼ再配線の同定:化学遺伝学アプローチ

<table><tbody><tr><td>1x リン酸阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>抗 GST 抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge ( 細菌細胞のペレット化用)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge ( 寄生虫のペレット化/処理用)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) pLysS コンピテントセル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a コンピテントセル</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット、0.2 cm ギャップ</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Xcell</td><td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP 化学発光試薬</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>ギムサ染色</td><td>Himedia</td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>グルタチオン セファロース 4B</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17075601</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 遊離酸</td><td>メルク</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>ヒポキサンチン</td><td>メルク</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>インフュージョンHDクローニングキット</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP、脱リン酸化</td><td>&nbsp;メルク</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオボンド エクストラ マキシ EF&nbsp;&nbsp;</td><td>タカラバイオ</td><td>740424</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ゲルとPCRクリーンアップ ミニキット</td><td>タカラバイオ</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>p-ニトロベンジルメシル酸塩 (PNBM)</td><td>アブカム</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max DNA ポリメラーゼ</td><td>タカラバイオ</td><td>R045A</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Qiaprep Spin Miniprep キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL 部位特異的突然変異導入キット</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini キット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Σ-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Thiophosphate ester antibody</td><td></td><td>Abcam Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

植物様キナーゼの低形対立遺伝子を保有する突然変異型マラリア原虫における代償経路の発達の理解

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

組換えWT CDPK1は、N末端グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグを持つ融合タンパク質として発現し、GSTアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製します。精製したCDPK1タンパク質は、抗CDPK1抗体および抗GST抗体を用いたウェスタンブロットにより検出しました(図1)。WT CDPK1のスレオニンゲートキーパー残基(T145)をMetおよびSerに置換し、部位特異的突然変異導入により、それぞれCDPK1T145MおよびCDPK1T145S変異組換えタンパク質を生成しました(図2)。 In vitro キナーゼアッセイは、すべての組換えCDPK1タンパク質のキナーゼ活性を評価するために行われました。キナーゼ活性は、ウェスタンブロットフォーマットの特異的抗体を用いてチオリン酸エステル基を検出することにより、半合成エピトープ標識アプローチ34 を用いて試験した(図3)。CDPK1の自己リン酸化活性およびCDPK1の外因性基質として使用されるMBPのトランスリン酸化に対するゲートキーパー置換の影響を、それぞれの自己リン酸化およびトランスリン酸化バンドの強度を定量化することによって評価しました。メチオニンゲートキーパーを持つ変異型CDPK1は~53%のトランスリン酸化活性を保持し、ゲートキーパー位置にセリンが存在すると、基質のトランスリン酸化が完全に廃止されました(図3)。ThrからMetへのゲートキーパー置換につながるSNP(T145M)は、2プラスミドシステムを使用して、CRISPR-Cas9を介して内因性 cdpk1 遺伝子座で操作されました(図4 および 図5)。T145S置換を持つ変異寄生虫は、おそらくSerゲートキーパーがCDPK1活性に及ぼす致死的な影響のために生成できませんでした。CDPK1T145M変異体寄生虫は、限界希釈法を用いてサブクローニングし、ゲートキーパー置換をサンガーシーケンシングにより確認し、CDPK1T145M変異体寄生虫の生成を確認しました。CDPKファミリーの7つのメンバーと、寄生虫の統合失調後期の発症に関与する他の4つのキナーゼを含む11の異なるキナーゼの転写レベルを、リアルタイムPCRを使用してテストしました(図6)。11種類のキナーゼの発現レベルを、CDPK1T145M変異型寄生虫と野生型(WT)寄生虫の間で比較し、ハウスキーピング遺伝子に正規化しました。CDPKファミリーメンバーの転写産物発現は、WT寄生虫と比較して、CDPK1T145M変異体で変化しました(図6)。CDPK1T145M変異体でより高い発現を示す転写産物は、CDPK1T145M変異体寄生虫におけるCDPK1の機能を補っている可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> 図1:完全長組換え野生型(WT)PfCDPK1の特性評価。 N末端グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)タグと融合した完全長WT CDPK1タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーで精製し、10% SDS-PAGE上で分離しました。CDPK1は、Coomassie Brilliant Blue R-250染色ポリアクリルアミドゲルに示されているように、予測分子量~87 kDaに移行しました。SDS-PAGE上で分離した組換えタンパク質をPVDFメンブレンに移し、抗CDPK1抗体および抗GST抗体を用いたウェスタンブロット解析に用いました。SDS-PAGE上の完全長組換えCDPK1に対応するバンドが両抗体で検出され、タンパク質の同一性が確認されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> 図2:精製された組換えCDPK1ゲートキーパー変異タンパク質の特性評価(A)TgCDPK1およびPfCDPK1の一次アミノ酸配列のアラインメント(Plasmodb accession no.PF3D7_0217500)。PfCDPK1の145位のスレオニンは、TgCDPK1のゲートキーパー位置であるグリシン128(赤で強調表示)に対応する。(B)WT CDPK1のトリプレットコドンACC(黒円)によってコードされたThrゲートキーパー残基(赤で強調表示)の漫画家表現。ゲートキーパー残基を部位特異的突然変異導入で置換し、CDPKT145MにMet(黄色)、CDPKT145SにSer(青色)の組換え変異CDPK1タンパク質を作製します。(C)CDPK1の組換えWTおよび変異タンパク質のSDS-PAGEプロファイル。組換えWTおよびゲートキーパー変異タンパク質をGSTアフィニティークロマトグラフィーで精製し、SDS-PAGE上で分離しました。すべての組換えタンパク質は、予想される分子量である~87 kDaに適合します。M-分子量ラダー。(D)ウェスタンブロッティングによる組換えCDPK1 WTおよび変異タンパク質の特性評価。CDPK1の組換えWTおよびゲートキーパー変異タンパク質をSDS-PAGE上で分離し、PVDFメンブレンに転写してウェスタンブロッティングを行いました。SDS-PAGE上の完全長組換えWTおよび変異型CDPK1タンパク質に対応するバンドを抗CDPK1抗体および抗GST抗体で検出し、すべての組換えタンパク質の同一性を確認しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> 図3:CDPK1のゲートキーパー置換は、変異酵素のキナーゼ活性の低下につながります。(A) CDPK1タンパク質のキナーゼ活性を検出するための半合成エピトープタグ付けアプローチの漫画家の表現。ここでは、トランスリン酸化活性のみが描かれています。CDPK1タンパク質は、移動可能な末端チオリン酸基の供給源であるATPγS(黄色の三角形の三角形)の存在下で、外因性基質(S、緑色の四角形)をチオリン酸化します。チオリン酸化残基は、p-ニトロベンジルメシル酸塩(PNBM)による処理によってアルキル化され、チオリン酸エステルを形成します。これにより、アルキル化チオリン酸付加体を特異的に認識する抗体で検出されます。(B)半合成エピトープタギングアプローチを用いた In vitro キナーゼ活性アッセイを用いて、組換えCDPK1変異タンパク質の自己リン酸化およびトランスリン酸化能に対するゲートキーパー置換の影響を試験しました。すべての組換えタンパク質は、カルシウム依存性キナーゼ活性を示します。CDPK1の自己リン酸化と外因性基質であるミエリン塩基性タンパク質(MBP)のトランスリン酸化は、塩化カルシウム(Ca2+)の存在下でのみ明らかであり、Ca2+ イオンの特異的キレート剤であるEGTAの存在下ではリン酸化は検出されませんでした。ゲートキーパー変異体は自己リン酸化活性の低下を示しますが、MBPのトランスリン酸化はCDPK1T145Sで完全に停止しました。CDPK1T145M、以前に報告されたように、トランスリン酸化電位(~53%)を保持しています32。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> 図4:CRISPR-Cas9を用いた cdpk1 遺伝子座のゲートキーパー位置にSNPを導入するためのプラスミドの構築。 432〜451 bpに対応する20ヌクレオチドのガイド配列をpL6eGFPプラスミドのBtgZI制限部位にクローニングして、pL6CK1Gを作製しました。所望のSNP(T145MまたはT145S、対応するコドンは緑色)を組み込んだ相同性アーム(421 bp)とシールド変異(赤色で表示)をpL6CK1Gにクローニングし、AflIIおよびSpeI制限酵素部位内のpL6CK1Gにクローニングして、それぞれpL6CK1GT145M およびpL6CK1GT145Mを産生した。シールド変異は、所望の編集後に修正された遺伝子座の再切断を防止する。第2のプラスミドであるpUF1にコードされたCas9エンドヌクレアーゼは、pL6CK1GT145M/S プラスミドから発現するガイドRNAの助けを借りて、cdpk1遺伝子座内の標的部位に向けられます。Cas9は、PAM配列の5'側に向かって標的部位に二本鎖切断を導入します。DSBは、pL6CK1GT145M/S プラスミドのホモロジーアームを使用して修復されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> 図5:Pの概略図。cdpk1遺伝子座におけるゲートキーパー変異(T145M)の導入のためのCRISPRプラスミドによる熱帯熱マラリアトランスフェクション。i) 非同期 P.熱帯熱マラリアの培養物は、同期したリングステージの寄生虫を得るためにソルビトール処理されます。ii) 同期リングステージ寄生虫を、pL6CK1G、T145M/S、pUF1プラスミドを緩衝液に再懸濁したエレクトロポレーションキュベットで採取します。iii)寄生虫は、310ボルト、950μF、および無限の抵抗でエレクトロポレーションされます。iv)トランスフェクション後、寄生虫を新鮮な完全RPMI培地(cRPMI)が入ったT25フラスコに移し、48時間培養します。48時間後、トランスフェクトされた寄生虫は、薬物WR99210およびDSM267を補充したcRPMIに切り替えられ、T75フラスコで増殖します。v) 14日目に、スライドを調製し、ギムザ染色剤を用いて染色します。vi)続いて、血液塗抹標本を光学顕微鏡で可視化し、寄生したRBCの存在を評価する。続いて、寄生虫をプロセシングして、標的cdpk1遺伝子座の所望の修飾を検証するためのPCRおよびDNAシーケンシング用のテンプレートを得る。viii)検証に続いて、クローン性トランスジェニック寄生虫は、96ウェルプレートで限界希釈を設定することにより得られます。ix)陽性ウェルからのクローン性トランスジェニック寄生虫をT25フラスコに移し、増殖させます。x)クローントランスジェニック寄生虫は、PCRおよびDNAシーケンシングおよびクロマトグラムの分析を通じてゲートキーパー位置での目的のSNPの存在によってさらに検証されます。図は32から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> 図6:リアルタイムPCR(RT-PCR)による標的遺伝子の転写産物解析に用いたステップの概略図。 主に成熟したシゾント期の寄生虫を持つ熱帯熱の培養物は、同じサイクルでソルビトール処理によって得られます。ii)寄生虫は、成熟したシゾント期の寄生虫を濃縮するために、15mLの円錐管内で70/40 Percoll/ソルビトールの勾配に穏やかに層状にされます。iii)40%および70%のパーソナル/ソルビトールの中間期にある黒色のリングを新鮮な50mLチューブに移し、処理し、cRPMIに再懸濁します。シゾント期に濃縮された寄生虫は、侵入のために37°Cで事前にインキュベートされた新鮮な赤血球とインキュベートされます。iv)寄生虫を4時間培養した後、5%ソルビトールで処理して、高度に同期した0-4時間のリングステージ寄生虫を取得します。v)寄生虫をさらに培養してソルビトール処理後44時間後にさらに培養し、高度に同期した44〜48時間のシゾント期寄生虫を得る。vi)同期寄生虫をサポニンで処理して赤血球から放出し、RNA抽出試薬に保存します。全RNAは、RNA抽出再懸濁寄生虫から単離されます。vii) cDNAは、単離されたRNAから調製されます。viii) cDNAテンプレートを用いてリアルタイムPCR実験を行い、遺伝子特異的プライマーを用いて標的遺伝子を増幅します。プレートはリアルタイムPCRシステムで実行されます。ix) 転写産物の発現データを解析ソフトウェアを用いて解析します。このグラフは、CDPK1 T145M寄生虫における11のキナーゼの転写産物発現差を野生型(WT)と比較したものです。この数値は32から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>遺伝子名</td>
			<td colspan="4">プライマー配列</td>
		</tr><tr><td>PK1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGTGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>PK1RPGEXの</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGGGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTTTTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTTTTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGGTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>ck1ガイドREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCTTTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>CK1F1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>CK1R3重量トン</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>表1:研究で使用されたプライマーのリスト。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>遺伝子名</td>
			<td colspan="2">フォワードプライマー</td>
			<td colspan="2">リバースプライマー</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATCの</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTTの GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAAGAATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">アグトッキャタアアアアガタタ TAAAGAACTAGGTAGTAGタグ</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr><tr><td>PKAの (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>パッケージ (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAATGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">ガガグカアッタグカタット</td>
		</tr><tr><td>PI3K(PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTTTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT アタットキャットカットットット</td>
		</tr><tr><td>ガプド (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAGタグ</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>表2:標的遺伝子のリスト(PlasmoDB識別番号)とリアルタイムPCR分析に使用したプライマーの配列。

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