Name: 内皮細胞応答を研究するための基質の剛性と流れを統合するin vitroモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学ぼう、基質の剛性と流れを統合したin vitroモデルを用いて内皮細胞の応答を研究する方法。この革新的なアプローチは、血管環境をより正確にシミュレートし、動脈硬化症や高血圧などの血管疾患のメカニズム解明に貢献します。

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著者らは、フローチャンバーの製作に協力してくれたロバート・イーガンに感謝の意を表します。著者らは、実験中に助けてくれたルーカス・マッコーリーに感謝しています。さらに、ノースイースタン大学のInstitute for Chemical Imaging of Living Systems(CILS)の中核施設が共焦点顕微鏡へのアクセスを許可したことに感謝します。著者らは、国立衛生研究所(NIH 1R01EB027705、SBに授与)と国立科学財団(NSF CAREER Awards:DMR 1847843 to SBおよびCMMI 1846962 to EE)から提供された資金援助に感謝しています。

内皮細胞に対する組織剛性とせん断応力の影響の研究

<ol><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction.</a> Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).</li>
<li>Suowen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction+in+atherosclerotic+cardiovascular+diseases+and+beyond%3A+From+mechanism+to+oharmacotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction in atherosclerotic cardiovascular diseases and beyond: From mechanism to oharmacotherapies.</a> Pharmacol Rev. 73 (3), 924(2021).</li>
<li>Jansen, K. A., Atherton, P., Ballestrem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+at+the+cell-matrix+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cel+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction at the cell-matrix interface.</a> Sem Cel Dev Biol. 71, 75-83 (2017).</li>
<li>Tarbell, J. M., Pahakis, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the glycocalyx.</a> J Int Med. 259 (4), 339-350 (2006).</li>
<li>Topper, J. N., Cai, J., Falb, D., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+vascular+endothelial+genes+differentially+responsive+to+fluid+mechanical+stimuli%3A+cyclooxygenase-2%2C+manganese+superoxide+dismutase%2C+and+endothelial+cell+nitric+oxide+synthase+are+selectively+up-regulated+by+steady+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of vascular endothelial genes differentially responsive to fluid mechanical stimuli: cyclooxygenase-2, manganese superoxide dismutase, and endothelial cell nitric oxide synthase are selectively up-regulated by steady laminar shear stress.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (19), 10417-10422 (1996).</li>
<li>Mitchell, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+and+cardiovascular+events%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness and cardiovascular events.</a> Circulation. 121 (4), 505-511 (2010).</li>
<li>Bonetti, P. O., Lerman, L. O., Lerman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial dysfunction.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (2), 168-175 (2003).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+sensitivity+to+chemical+and+mechanical+sub-endothelial+substrate+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).</li>
<li>Mensah, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-regulated+endothelial+glycocalyx+determines+metastatic+cancer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Flow-regulated endothelial glycocalyx determines metastatic cancer cell activity.</a> FASEB J. 34 (5), 6166-6184 (2020).</li>
<li>Russell-Puleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+upregulation+of+COX-2+and+PGI2+release+in+endothelial+cells+via+a+pathway+involving+PECAM-1%2C+PI3K%2C+FAK%2C+and+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+Cir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38.</a> Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+endothelial+mechanotransduction%3A+current+knowledge+and+models+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+methacryloyl+and+its+hydrogels+with+an+exceptional+degree+of+controllability+and+batch-to-batch+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gelatin methacryloyl and its hydrogels with an exceptional degree of controllability and batch-to-batch consistency.</a> Sci Rep. 9 (1), 6863(2019).</li>
<li>Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-friendly+inverse+opal-like+hydrogels+for+a+spatially+separated+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system.</a> Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).</li>
<li>Orr, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subendothelial+extracellular+matrix+modulates+NF-kappaB+activation+by+flow%3A+a+potential+role+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subendothelial extracellular matrix modulates NF-kappaB activation by flow: a potential role in atherosclerosis.</a> J Cell Biol. 169 (1), 191-202 (2005).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Baumann, H. J., Pukale, D. D., Shriver, L. P., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mechanisms+of+subcutaneous+preconditioning+incubation+for+neural+stem+cell+embedded+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Investigating mechanisms of subcutaneous preconditioning incubation for neural stem cell embedded hydrogels.</a> ACS Appl Bio Mater. 5 (5), 2176-2184 (2022).</li>
<li>Rezaeeyazdi, M., Colombani, T., Memic, A., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hyaluronic+acid-co-gelatin+cryogels+for+tissue-engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable hyaluronic acid-co-gelatin cryogels for tissue-engineering applications.</a> Materials. 11 (8), 1374(2018).</li>
<li>Belvitch, P., Htwe, Y. M., Brown, M. E., Dudek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+dynamics+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Cortical actin dynamics in endothelial permeability.</a> Curr Top Membr. 82, 141-195 (2018).</li>
<li>Krishnamoorthy, S., Noorani, B., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+encapsulated+cells+on+the+physical-mechanical+properties+and+microstructure+of+gelatin+methacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of encapsulated cells on the physical-mechanical properties and microstructure of gelatin methacrylate hydrogels.</a> Int J Mol Sci. 20 (20), 5061(2019).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+small-diameter+vascular+vessel+with+endothelium+and+smooth+muscle+by+the+approach+of+two-step+crosslinking+process%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Bioprinting small-diameter vascular vessel with endothelium and smooth muscle by the approach of two-step crosslinking process.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (6), 1673-1684 (2022).</li>
<li>Villard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoclavable+and+injectable+cryogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Autoclavable and injectable cryogels for biomedical applications.</a> Adv Healthcare Mater. 8 (17), 1900679(2019).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cross-linker+chemistry+on+release+kinetics+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).</li>
<li>Rogers, Z. J., Zeevi, M. P., Koppes, R., Bencherif, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroconductive+hydrogels+for+tissue+engineering%3A+Current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectricity%22%5BJournal%5D)">Electroconductive hydrogels for tissue engineering: Current status and future perspectives.</a> Bioelectricity. 2 (3), 279-292 (2020).</li>
<li>James, B. D., Allen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+cell+behavior+in+complex+mechanical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial cell behavior in complex mechanical microenvironments.</a> ACS Biomater Sci Eng. 4 (11), 3818-3842 (2018).</li>
<li>Yeh, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+regulates+endothelial+cell+proliferation+through+septin+9%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness regulates endothelial cell proliferation through septin 9.</a> PLoS One. 7 (10), e4688(2012).</li>
<li>Fioretta, E. S., Fledderus, J. O., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+substrate+stiffness+on+circulating+progenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Influence of substrate stiffness on circulating progenitor cell fate.</a> J Biomech. 45 (5), 736-744 (2012).</li>
<li>Geemen, D. v, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-Actin-anchored+focal+adhesions+distinguish+endothelial+phenotypes+of+human+arteries+and+veins%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">F-Actin-anchored focal adhesions distinguish endothelial phenotypes of human arteries and veins.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (9), 2059-2067 (2014).</li>
<li>Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+substrate-+and+flow-derived+stresses+in+endothelial+cell+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology.</a> Comm Biol. 4 (1), 764(2021).</li>
<li>Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+endothelial+cell+culture+model+to+replicate+disturbed+flow+conditions+seen+in+atherosclerosis+susceptible+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).</li>
<li>Inglebert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+stress+reduction+on+endothelial+cells%3A+A+microfluidic+study+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).</li>
<li>Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+reorientation+of+stress+fibers+drives+morphological+changes+to+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress.</a> Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).</li>
<li>Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Yin+and+Yang%27+of+cancer+cell+growth+and+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing.</a> Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).</li>
</ol>

著者らは、仮特許出願(第63/634,853号)が「Flow Chamber with a Mechanically Tunable Substrate」というタイトルで提出されており、他に競合する利益は存在しないことを宣言します。

血管系は、さまざまな力が細胞の挙動に大きな影響を与えるダイナミックな環境です。これらの力を考慮せずに心血管疾患の生物学的事象を研究することは不正確です。したがって、血管の機械的環境をエミュレートできる細胞モデルが重要です。研究者たちは、これらの力が細胞の行動に及ぼす影響を強調することで、すでに大きな進歩を遂げています11。しかし、人体の病理学的および生理学的条件下での細胞の挙動を理解するためには、血管の環境により近い、より精密なモデルを開発することが不可欠です。そこで、アクセスのしやすさや使い勝手の良さを保ちつつ、より正確に血管環境を再現するシステムの開発を目指しました。
このモデルは、制御された流れから導き出されたせん断応力を、さまざまな剛性レベルの基板上のヒト細胞に適用でき、既存のモデルと比較して生理学的現実に近い条件を作り出します。このモデルでは、1)調整可能な機械的特性、2)非腫脹挙動、3)細胞適合性と接着性、4)血管細胞を埋め込みて血管をより正確にモデル化する能力を満たすために、GelMAが合成され、このモデルで利用されまし...

血管の内面を覆う内皮は、血管の健康を維持する上で極めて重要な役割を果たしています。内皮細胞(EC)は、血管の緊張制御、選択的透過性、止血、メカノトランスダクションなど、さまざまな心血管機能の調節の中心です1,2。研究は、EC機能障害をアテローム性動脈硬化症の発症における主要な役割にしっかりと関連付けています。特に、ECは、血流およびその下にある血管組織と相互作用する界面で多様な機械的力に遭遇する3,4。いくつかの研究は、ECの機能障害を血管環境内の機械的要因の異常な変化と関連付けています。たとえば、血流による流体せん断応力や組織の硬直性5,6,7。
しかし、これまでの研究では、組織の剛性とせん断応力がEC機能に及ぼす複合的な影響を理解するために、あまり注目されていませんでした。研究成果をアテローム性動脈硬化症やその他の心血管疾患の効果的な治療法に変換する能力を高めるためには、この分野で使用される細胞モデルを改善することが不可欠です。ヒトECを使用し、それらをせん断応力またはさまざまな剛性レベルの基質にさらすことにより、細胞モデルのヒト化において大きな進歩が見られました8,9,10。しかし、動的な流動環境と調整可能な剛性特性を持つEC基板を統合したセルラーモデルの採用と改良は、徐々に進んでいます。課題は、流路内のフローパラメータの変化を防ぎながら、無傷で密着性のあるEC単分子膜の培養を容易にするために、膨潤しないEC基質を考案することにあります。これらの障害を克服できるin vitroモデルは、高血圧、老化、および血流状態がECメカノトランスダクション、血管の健康、そして最終的にはアテローム性動脈硬化症の発症にどのように共同で影響するかについてのより効果的な研究を促進する可能性があります。基板の剛性を制御しながら細胞にせん断応力を加えるために、回転プレートやマイクロ流体デバイスなど、さまざまな方法が開発されています。回転プレート法では、2枚のプレートの間にセルを配置し、プレートの回転運動によってせん断応力が加えられます。この方法はそれほど複雑ではなく、迅速なモデルを提供します。ただし、空間的なせん断応力の変動に悩まされ、中心でせん断応力がゼロ、周辺11 で最大せん断応力が大きくなります。
一方、マイクロ流体デバイスは、基板の剛性と流動条件を制御する能力を備えた新世代のツールを表しています。これらのシステムは、層流条件下での微小血管系の模倣に適しています。しかし、このような装置を用いてアテローム性動脈硬化症を研究することは、アテローム性動脈硬化症が流れが乱れた大きな血管で起こるため、非現実的である11。この論文は、さまざまな流動条件下でEC基板のさまざまな剛性レベルの影響を調べることができる費用対効果の高いシステムを提示することにより、EC研究の重要な研究領域に貢献することを目的としています。このシステムは、異なる剛性を持つ基質を統合して、病理学的および生理学的血管をエミュレートします。このプロトコルは、生理学的および病理学的剛性をそれぞれ表す、5kPaおよび10kPaの膨潤および剛性レベルがないゼラチンベースのヒドロゲルを作成する方法を概説しています。さらに、これらの基板を統合できるパラレルプレートフローチャンバーの構造も詳細に説明されています。数値流体力学(CFD)を使用して、せん断応力と流動条件を評価しました。EC培養用のハイドロゲルの調製と6時間フロー実験の実施について説明し、続いて実験後の免疫染色について説明します。

<table><tbody><tr><td>(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート, テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>ハイドロゲル製造</td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>ガラス塩類化</td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) 含有封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A18-4</td><td>GelMA 合成</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 ファロイジン&nbsp;</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>8953S</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (APS)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610700</td><td>ハイドロゲル製造</td></tr><tr><td>クリアスクラッチおよび耐紫外線キャストアクリルシート (45/64インチ)</td><td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td><td>フローチャンバー製造</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス Meditex AG</td><td>ツァイス LSM 800</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>Covidien Monoject リジッドパック 60 mL シリンジ 針なし</td><td>フィッシャー&nbsp;&nbsp;</td><td>22-031-375</td><td>フローエクスペリメント</td></tr><tr><td>ECグロースキット&nbsp;</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)</td><td>PCS-100-041</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ</td><td>デコンラボ</td><td>2701</td><td>ガラス塩類化</td></tr><tr><td>ゼラチンタイプA(300ブルーム)豚皮から</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA合成</td></tr><tr><td>氷河酢酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>9526-33</td><td>ガラス塩類</td></tr>化<tr><td>高純度高温シリコーンラバーシート</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K74</td><td>フローチャンバー製造</td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)</td><td>PSC-100-010</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>M3x30mm小ネジ六角穴丸頭ネジ304ステンレス鋼ファスナーボルト20pcsUxcell</td><td></td><td>B07Q5RM2TP</td><td>フローチャンバー製造</td></tr><tr><td>Masterflex L / Sデジタルドライブ(イージーロード付き)&reg;精密チューブ用3ポンプヘッド。115/230 VAC</td><td>VWR</td> <td>#MFLX77921-65</td><td>フロー実験&nbsp;</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 精密ポンプチューブ、プリフレックス、L/S 25; 25 フィート</td><td>VWR</td> <td>#MFLX96419-25</td><td>フロー実験&nbsp;</td></tr><tr><td>メタクリル酸無水物 (MAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td>General</td></tr><tr><td>Na-Dium Bicarbonate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>Nadium</td><td>Carbonate Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr><td>SOLIDWORKS 教育版</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLIDWORKS Student Edition Desktop, 2023</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>フローチャンバーデザイン</td></tr><tr><td>血管基礎媒体</td><td>アメリカンタイプ培養コレクション (ATCC)</td><td>PCS-100-030</td><td>細胞培養</td></tr></tbody></table>

内皮細胞応答を研究するための基質の剛性と流れを統合するin vitroモデル

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

私たちは、血管の健康やアテローム性動脈硬化症などの疾患の発症を理解するために重要な、組織の硬直性とせん断応力が内皮細胞(EC)機能に及ぼす複合的な影響を調査することを目的とした革新的な in vitro モデルを提示します。従来、研究では、せん断応力と基板剛性がECに与える影響を独立して調査してきました。しかし、この統合システムは、これらの要素を組み合わせて、血管系の機械的環境をより正確にシミュレーションすることができます。目的は、ヒトECを使用して、さまざまな組織剛性レベルと流動条件にわたるECメカノトランスダクションを調べることです。ゼラチンメタクリレート(GelMA)ハイドロゲルを調整可能な剛性で合成し、ECを播種してコンフルエンシーを達成するためのプロトコルについて詳しく説明します。さらに、層流と適切なせん断応力レベルによって特徴付けられる生理学的流れ条件を生成するために、計算流体力学シミュレーションによって補完された、費用対効果の高いフローチャンバーの設計と組み立てについて説明します。このプロトコールには、共焦点顕微鏡用の蛍光標識も組み込まれており、組織のコンプライアンスと流動条件の両方に対するECの反応の評価を可能にします。このモデルは、培養したECに複数の統合された機械的刺激を与えることにより、高血圧や老化などの要因がEC機能やEC介在性血管疾患にどのように影響するかを包括的に調べることができます。これらの研究から得られた知見は、血管疾患の根底にあるメカニズムの解明や効果的な治療戦略の開発に役立ちます。

図1 は、メタクリル化反応によるGelMA合成のプロセスの概要を示す実験セットアップを示しています。次に、得られた生成物を使用してヒドロゲル基質を作製し、その上にECを播種しました。続いて、細胞をフローチャンバーに導入し、12 dyne/cm2 で 6 時間のフロー実験を行いました。
1H NMR分光法を使用して、メタクリル化反応の成功を評価しました(図2A)。GelMAには1.9 ppmのメチル基と5.4〜5.6 ppmのビニルピークの存在により、メタクリル化の成功が確認されました。さらに、GelMAの3 ppmでのリジンピークの減少は、リジン残基の消費を示しており、リジン残基はメタクリレート残基12,13,16に置き換えられています。<sup c...

私たちは、関連する血管流条件下で血管内皮細胞(EC)を培養するための調整可能なゼラチンベースの基質を合成し、特徴付けました。この生体模倣表面は、生理学的条件と病理学的条件の両方を再現し、ECの挙動に対する機械的な力の研究を可能にし、血管の健康と疾患のメカニズムの理解を深めます。

We present an innovative in vitro model aimed at investigating the combined effects of tissue rigidity and shear stress on endothelial cell (EC) function, ...

本研究では、動脈硬化および高血圧に関連するメカノバイオロジーに焦点を当てています。私たちが解決を目指す主な課題は、第一に、生理的条件および病理的条件の両方における血管環境を、より正確に再現するにはどうすればよいかという点です。第二に、これらの機械的刺激に同時にさらされた際の血管内皮細胞の細胞応答はどうなるかという点です。本研究の目的は、基質の剛性と血流条件を単一のシステムに統合することで、血管環境をより正確にシミュレートすることである。従来のin vitroモデルでは、静的な条件下で基質の剛性を検討するか、あるいは硬い基質上で培養した内皮細胞（ECs）に対する血流の影響を検討するかのいずれかであり、どちらも生理学的に不適切である。まず、豚皮由来のtype A、300 bloom gelatin 10 gを、100 mLの炭酸水素ナトリウム緩衝液に加える。マグネチックスターラーを用いて溶液を700 RPMで撹拌しながら、55 °Cの水槽でゼラチンを溶解させます。完全に溶解した後、0.1 Mの水酸化ナトリウムを用いて、ゼラチン溶液のpHを9.5に調整します。メタクリロイル化を開始させるため、938 µLのメタクリル酸無水物を溶液に滴下します。次に、遮光するため、反応容器をアルミホイルで包みます。55 °Cに保持し、溶液を500 RPMで1時間攪拌して反応を完結させます。続いて、2 Lのビーカーに1.8 Lのアセトンを、0.6 Lのビーカーに0.3 Lのアセトンを準備します。得られたGelMA溶液を、200 RPMで攪拌しながら2リットルのビーカーに滴下し、沈殿を誘発させます。沈殿物を大きいビーカーから小さいビーカーに移し、10分間静置します。製品を吸収紙で回収し、真空乾燥機を用いて室温で乾燥させます。最終的な基板を成形するため、適切な深さと10 square millimetersの開口窓を持つ2ピースのポリテトラフルオロエチレン製モールドを組み立てます。漏れを防ぐため、モールドが平坦であり、底板と上板がしっかりと固定されていることを確認してください。次に、スペーサーが取り付けられている面と同じ面にあるカバーガラスの長辺に、細胞適合性のあるシーリンググリースの薄い層を塗布します。修飾したガラススライドを、2つのスペーサーの間にカバーガラスで固定します。次に、スペーサーが型の上に乗り、修飾ガラスが型の中に伸びるように、カバーガラスを型の上に配置します。GelMAが脱イオン水に溶解したら、その溶液を45 °Cの恒温水槽に入れます。ポリマー溶液にTEMEDとAPSを順に添加し、十分に混ぜ合わせます。15分後、鋭利な器具を用いて基板をモールドから剥がし、カバーガラスから滑らせて分離させ、100 mmのペトリ皿に入れたPBSに移します。その後、ペトリ皿をプラスチックフィル

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、無菌連続流回路における層流のせん断応力を受ける接着細胞への方法を記述しています。細胞の接着、形態は、透明なチャンバーを通過代謝物の分析と将来の実験や培養のためのせん断曝露後に細胞を回収するための回路から得られた試​​料を研究することができる。...

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。...

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

ショウジョウバエの幼虫は、その半透明のキューティクルと強力な遺伝学へのライブイメージングのための魅力的なモデル系である。このプロトコルは、単層のPDMSデバイスを活用する方法について説明し、 第3齢ショウジョウバエの幼虫の神経細胞内で細胞過程のライブイメージングのための「幼虫チップ」と呼ばれる。...

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

このプロトコルは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング、細胞の付着、増殖、運動性、および薬理学的および毒性刺激に対する細胞応答の定量化のための接着細胞のインピーダンススペクトルを記録し、分析する方法を検討します。内皮透過性および細胞 - 細胞および細胞 - 基質接点の評価の検出が強調される。...

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

ここでは、マルチウェルプレートフォーマットのポリアクリルアミドゲルの迅速、効率的、安価な調製を可能にする方法について説明しています。この方法は特別な機器を必要とせず、どの研究室でも簡単に採用できます。これは、剛性依存性の細胞応答の理解に焦点を当てた研究に特に役立ちます。...

剛性依存性細胞応答の研究のための簡単​​なポリアクリルアミド系マルチウェル剛性アッセイ

我々は、3次元再構成人間の角膜のような上皮（RHCE）組織モデルを利用した眼刺激性試験を開発しました。テストは、眼刺激性及び腐食性物質（GHSカテゴリー1と組み合わせた2）とラベル（GHSなしカテゴリ）を必要としないものとを区別することができます。...

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

このプロトコルは、疾患の病理における細胞応答を決定するのを助けるために、インビトロで生理学的または病理学的な血流を複製します。血液ポンプの下流ダンピング室の圧力を導入することにより、脈管構造を横切る血流が血管内皮または模倣共培養の単層上で要約し、課すことができます。...

血管細胞リモデリングの研究への応用生理学的および病理学的血流のインビトロモデル

血小板輸血と止血は、血液貯蔵血小板の機能を調査するために、血液再構成とマイクロ流体フローチャンバーを使用してモデル化されました。このデータは、血小板蓄積病変がin...

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

椎間板（IVD）の全体の器官培養は、天然の細胞外マトリックス、細胞表現型、および細胞 - マトリックス相互作用を保存します。ここでは、マウスの腰椎とその機能脊髄単位で尾したIVDと、このシステムを利用する複数のアプリケーションを使用してIVD培養系を説明します。...

アン<em&gt;インビトロ</emマウス椎間板の&gt;器官培養モデル

ここでは、流体せん断応力下における血管内皮細胞の培養と遺伝子発現解析のワークフローが表示されます。同時に監視制御環境および外因性参照 RNA の定量的 PCR...

剪断応力の複数の平行平板流チャンバーを使用して内皮細胞の遺伝子発現解析

学ぼう、基質の剛性と流れを統合したin vitroモデルを用いて内皮細胞の応答を研究する方法。この革新的なアプローチは、血管環境をより正確にシミュレートし、動脈硬化症や高血圧などの血管疾患のメカニズム解明に貢献します。

内皮細胞応答を研究するための基質の剛性と流れを統合するin vitroモデル

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