Name: ロータリータトゥーマシンによる Xenopus laevis のタトゥー方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: 学ぶロータリータトゥーマシンを用いたXenopus laevisのタトゥー法。個体識別と遺伝系統の追跡に有効で、4か月後も91%の視認性を維持する低侵襲なマーキング技術です。

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このプロトコルで使用される動物に日々の飼育を提供してくれたダートマス大学の比較医学研究センターに感謝します。また、プロトコルのテストと動物の撮影に協力してくれたリア・ジェイコブとアドワイタ・ボーズにも感謝します。最後に、タトゥーの実践に関するトレーニングを提供してくれたAnn Millerの研究室に感謝します。この研究は、NIHの助成金R00 GM147826 to J.L.の支援を受けました。

記載されているすべての動物処置は、ダートマス大学の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。
1. 機器のセットアップ
注:手順のワークフローとベンチセットアップの例が含まれています(図1)。
<ol><li>タトゥーガンとフットペダルを電源に接続します。フットペダルを作業面の下に置きます。</li>
	<li>タトゥーガンの組み立て<ol><li>六角レンチまたは六角ドライバーを使用して、グリップのネジを緩めます(図2A、赤丸で囲んだ部分)。</li>
		<li>プラスチック製の先端をグリップの奥まで挿入します。ネジを締めて所定の位置に固定します。</li>
		<li>グリップの背面に金属チューブを挿入します(図2A)。こちらは調整されますので、半分の長さに差し込んでいきます。ネジを締めて所定の位置に固定します。</li>
		<li>タトゥー針をグリップの背面に挿入して、グリップの前面にあるプラスチック製の先端に快適に収まるようにします(図2B)。</li>
		<li>針と金属チューブの背面をチューブクランプに通します。針がプラスチックの先端に快適に収まるように金属チューブを調整します(図2B)。チューブclを手で締めますamp チューブが動かなくなるまで(図2C)。</li>
		<li>黒いOリングを取り外し、針をローターアームに引っ掛けます。Oリングを元に戻して、針を所定の位置に固定します(図2C)。</li>
	</ol></li>
	<li>電源の電圧は、皮膚を貫通するのに十分な電力があるが、制御が難しいほど強力ではないように設定します。電源を接続して接続したら、フットペダルを押して、マシンが機能していることを確認します。針を自分や他の人に向けないように注意してください。 注:このプロトコルで使用されるタトゥーマシンは、6.0〜9.0 Vの間で最適に機能しますが、これはタトゥーマシンと電圧供給によって異なる場合があり、経験的に決定する必要があります。</li>
	<li>1.5 mLの微量遠心チューブまたは付属のプラスチック製インクポットのキャップに黒いタトゥーインクを入れ、約4分の3まで満たします。</li>
</ol>2.麻酔
<ol><li>1匹の成虫の雌の X.laevis カエルを沈めるのに十分な大きさのタンクで麻酔を準備します。<ol><li>カエルに安全な(塩素フリー)水を使用して、トリカインを最終濃度1.5 g / Lに、重炭酸ナトリウムを最終濃度3.5 g / Lに添加します。この溶液のpHは7.15です。 注意:トリカインは刺激物です。</li>
	</ol></li>
	<li>1匹のカエルを麻酔タンクに沈めます。カエルが麻酔されるまでトリカイン溶液に沈めたままであることを確認してください(7〜8分)。<ol><li>カエルが完全に麻酔されているかどうかを確認するには、カエルを持ち上げて逆さまに持ち、片足でしっかりと握ります。カエルがひるんだり反応したりしない場合は、入れ墨をすることができます。</li>
		<li>カエルが麻酔を受けるのに一貫して10分以上かかる場合は、重炭酸ナトリウムで緩衝した新鮮なトリカイン溶液を準備します。 注:カエルはトリカイン溶液15に30分以上費やさないでください。</li>
	</ol></li>
</ol>3.タトゥー
注:生きている動物に入れ墨をする前に、皮がしっかりした果物(レモンやバナナなど)で練習すると便利です。
<ol><li>入れ墨をする前に、カエルのための回収タンクを準備してください。タンクに10〜15Lの新鮮なカエルに安全な水を入れ、発泡スチロールのアイランドを追加します。これにより、カエルが溺れることなく目を覚ますための表面が提供されます。 注:発泡スチロールの島は、ジップトップバッグの中に入れられた発泡スチロールの冷蔵輸送コンテナの蓋を使用して作成できます。</li>
	<li>麻酔をかけたカエルを背中に乗せて、乾いたペーパータオルまたはベンチペーパーに置きます(図3A)。カエルを含むすべての作業には、無漂白(茶色)のペーパータオルを使用してください。</li>
	<li>糸くずの出ない乾いたワイプを使用して、カエルの胸から水と粘液を拭き取ります。</li>
	<li>指でカエルの胸の中央にある胸骨を見つけ、利き手ではない手を使って、皮膚をぴんと張ったままにします。</li>
	<li>カエルのマーキング<ol><li>組み立てたタトゥーガンを作業面に対して垂直に持ち、針をインクに浸します(図3B)。</li>
		<li>組み立てたタトゥーガンを垂直に保ち、針の先端をカエルの皮膚に押し付けてから、フットペダルを踏みます。カエルの肌に線を引き、圧力を均等にかけます。 注:軽度の出血や発赤は正常であり、軽度の皮膚の脱落も同様です。</li>
		<li>針がカエルの皮膚に引っかかっている場合は、ワイプで針から余分なインクや皮膚を取り除きます。入れ墨中にインクが過剰になるのは正常です。</li>
		<li>カエルの胸がインクで覆われすぎてマークされている領域がはっきりと見えない場合(図3C)、カエルに安全な水とワイプ(図3C ')で余分なインクを取り除きます。次に、ドライワイプで水分を逃がし、インクを続けます。 注:入れ墨をする前に、カエルに安全な水のスクイーズボトルを準備できます。</li>
		<li>余分なインクを拭き取った後、暗くなるまで同じ領域にインクを塗り続けます。読みやすい数字が残ります(図3D)。1回のストロークで全体のマーキングや数字を描くのではなく、特に曲線の場合は、小さなストロークを繰り返し作成します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. リカバリー
<ol><li>ペーパータオルをカエルに安全な水で濡らし、発泡スチロールの島の上に平らに置きます(図4A)。</li>
	<li>カエルを立っている水槽に戻す<ol><li>カエルの腹を下にして、水に面したタオルの上に置きます(図4B)。ペーパータオルの半分をカエルの後ろ半分に折り、カップ状の手でカエルの上部を濡らします。カエルが麻酔から出てくると(入れ墨の後約1時間)、カエルは独立して水に入り、普通に泳ぎます。</li>
		<li>入れ墨が完全に治癒したら、24時間後にカエルを長期住宅に戻します。</li>
	</ol></li>
</ol>5. 清掃・設備メンテナンス
<ol><li>タトゥー針の再利用とオートクレーブ<ol><li>100%イソプロパノールと脱イオン水で針をすすぎ、インクをほぐし、溶けていない残りのインクをこすり落とします。</li>
		<li>スクラブ後、針を金属製のオートクレーブケースに入れるか、アルミホイルとオートクレーブで30分間乾燥サイクルで包みます。</li>
	</ol></li>
	<li>タトゥーマシンやその他の機器の一部にインクがある場合は、100%エタノールとペーパータオルで拭いてください。</li>
	<li>麻酔薬溶液の最終的なトリカイン濃度は約0.5%である。これは、施設の有害廃棄物管理ガイドラインに従って廃棄してください。</li>
	<li>機器の保管とメンテナンス<ol><li>可能であれば、タトゥーマシンは乾燥した部屋に保管してください。水分が多すぎると、電気部品が損傷し、機械の寿命が短くなります。</li>
		<li>タトゥーマシンを良好な状態に保つには、ローターのベアリング(図2C)をチェックして、振動22から緩んでいないことを確認します。これは、六角レンチまたは六角ドライバーで締めることができます。</li>
		<li>月に1回程度、ローターアームのベアリングに厚塗りグリース22を使用して潤滑します。</li>
		<li>タトゥーマシンによっては、ローターアームが動かなくなって振動しなくなることがあります。これを修正するには、ローターアームをひねるか、スプリングを圧縮して、針が下がった位置にくるようにします(図2C)。</li>
	</ol></li>
</ol>

両生類のマーキングの最適化:Xenopusのタトゥーのガイド

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</ol>

著者は、競合する利益を宣言しません。

人間を入れ墨することは何千年も前にさかのぼる芸術形式であり、人間が自分自身を入れ墨している限り、彼らは動物にも入れ墨をしたり、ブランド化したりしてきました23。動物、特に哺乳類をマーキングするための機器と技術は、十分に確立され、十分に文書化されており、広くアクセス可能です。動物にマーキングすることは、もともと家畜と盗難の抑止力を区別するためのものでしたが23、生物医学研究におけるその役割も同様に重要になっています。
両生類の入れ墨の利点は、入れ墨が24時間以内に治癒し、良い入れ墨が数ヶ月間続くことです(図5D ')。入れ墨は、両生類の住居と飼育に複数の利点を提供します。入れ墨は、研究者や獣医スタッフが、暗い色合いのタンクでも、見やすく解釈しやすい数字を使用して個々の動物を容易に区別することを可能にします19。この手順は、2歳以上のカエル15歳には推奨されない皮膚自家移植と比較して、どの成体のカエルにも行うことができます。最も重要なことは、入れ墨により多数の動物を識別でき、X.laevisの胸に少なくとも3本の指が快適にフィットすることです(図5A)。
ビーズやタグを付けるのに比べて、入れ墨は落ちる可能性のあるものを残さず、刺激が限定的です17。さらに、入れ墨は、ワイヤーをブランドに成形する必要がある他のブランディング技術よりも汎用性があります。この手順自体は、組織が除去されないため、皮膚自家移植よりもはるかに破壊的ではありません。ただし、自家移植片と同様に、入れ墨も部分的に侵襲的であり、怪我や感染のリスクがわずかです。これは動物をマーキングするために必要な部分ですが、研究者は入れ墨中の過度の出血に注意し、 A.ハイドロフィリア 感染のために動物を監視することが重要です。これは、入れ墨の前、最中、後に清潔なワークスペースを維持し、動物がコロニーに戻る前に入れ墨が完全に治癒していることを確認することで防ぐことができます。この論文を執筆し、開発する中で、どのカエルも入れ墨によって永久に怪我をしたり死亡したりしていません。この手順の制限は、1歳以上の成体のカエルでのみテストされていることです。今のところ、このプロトコルで入れ墨されたカエルはいません。さらに、この手順は、胸に暗い色があり、入れ墨が識別しにくくなる X.トロピカリスには最適化されていません21。将来的には、この入れ墨プロトコルが更新され、 X.tropicalisの考慮事項が含まれる可能性があります。
Xenopusの生息地は水生生物4であるため、これらの入れ墨は時間の経過とともに色あせるのが普通です。入れ墨を頻繁に交換する必要性は、唾液や飲料との継続的な接触のために表皮の入れ墨よりも早く消える口の中の人間の唇の入れ墨で文書化されています24。ただし、入れ墨の寿命は、入れ墨の技術に大きく依存します。技術の悪さは、タトゥーマシンの組み立てが不適切(図4C)または電圧供給設定が最適でないことに起因している可能性があります。巻tage設定が低すぎると、針が皮膚を貫通するのを防ぎ、かすかな跡や線が入ります。電圧を高くしすぎると、動物に不必要な害を及ぼす可能性があります。入れ墨が悪いもう一つの一般的な原因は、人員が入れ墨銃を持っているときの針の位置や圧力が正しくないことです。圧力が少なすぎるタトゥーは、電圧を低く設定しすぎるのと同じ効果があり、すぐに消えるかすかなタトゥーになります(図5B ')。入れ墨をしていると、針がカエルの皮膚を突き刺すのではなく、すくい取っているように感じることがあります。圧力がかかりすぎるタトゥーを入れると、出血が目立ったり、制御不能になったりします。最高のタトゥーは、短い部分にインクを塗り、重くて一貫した圧力で線をなぞることによって、忍耐強くそして整然と行われます。
全体として、両生類の入れ墨による動物のマーキングの利点は、欠点を上回ります。生物医学研究における Xenopus の個別追跡は、生物学的複製の追跡における科学的な厳密さを可能にし、研究者や獣医スタッフが個々の動物の健康状態を評価することを可能にし、動物の長期的な健康を維持するための適切な排卵頻度を確保します。動物研究の3R-refinement, reduction, and removal-について、このプロトコルはRefinementとReductionに最も関連しています1。カエルにマーキングを付けることで、研究者や獣医師は健康上の懸念を追跡しやすくなるだけでなく、実験の合間にカエルに十分な休息時間を与えることができます。これにより、動物から収集されたデータとサンプルの品質が向上し、畜産とケアの実践が洗練されることで、研究プロセスが洗練されます。また、実験の再現性を向上させるのにも役立ちます。さらに、動物にマーキングを付けると、動物を再利用できるため、必要な動物の総数を減らすことができます。特に高品質の卵を産むカエルや他の実験に最も役立つカエルは、研究により適しているとマークして識別できます。カエルが一貫して実験に役立たない場合は、カエルを特定してコロニーから取り除くことができるため、リソースとスペースを節約できます。この論文の目的は、両生類の入れ墨のベストプラクティスを文書化し、 Xenopus ラボに詳細で簡単にアクセスできる入れ墨プロトコルを提供することです。この慣行は 、Xenopus 分野ではまだ一般的ではありませんが、これは、既存の公開リソースが限られていることも一因です。このリソースにより、研究者は動物を安全かつ効果的にマーキングし、大規模なコロニーの記録管理を改善し、生物医学研究における両生類の使用を改善することができます。

動物モデルは、人間の健康に関する問題を調査するための便利なツールです。実際には、動物モデルを用いた生物医学研究では、健康な動物コロニーを慎重に組織し、維持する必要があります。倫理的な動物の取り扱いと飼育のためのベストプラクティスは、実験に必要な動物の数を減らし、動物福祉を確保するための実践を洗練することを目的としています1。Xenopus laevis(X. laevis;アフリカツメガエル)とXenopus tropicalis(X. tropicalis;Western Clawed frog)は、1930年代に南アフリカの医師が最初の妊娠検査を行うためにX. laevisを使用して以来、生物医学研究に使用されてきました2。現代の妊娠検査薬ではカエルは不要になりましたが、Xenopus研究の役割は続いています。生物医学研究にXenopusを使用する利点には、よく注釈されたゲノム3、大量の卵の年間にわたる排卵誘発性4、体外受精に適した外部産卵などがあります。これらの特徴により、脊椎動物の発生学と発生学5,6,7、基本的な分子生物学と細胞生物学7,8,9,10、およびヒト疾患のモデリング7,11,12,13に有用な資産となっています。
個々のXenopus動物を追跡する信頼性の高い方法は、生物学的複製を記録し、研究の厳密性と再現性を向上させるために不可欠です。Xenopusはグループで飼育されることが多いため、動物マーキングにより、研究者は個々の動物を簡単に追跡できます4。動物の正確な記録を維持することで、時間とリソースを節約し、動物の健康状態を追跡する能力を向上させることができます。例えば、動物の個体同定は、トランスジェニックXenopus系統を作製するための組織化ワークフローを改善することができるが、これは、シーケンシング14によって検証された特定の遺伝子型を持つカエルの複数世代が必要であり、それには動物の組織化および個体同定が必要であるからである。これは、これらの突然変異が容易に識別できる成人の表現型を欠いている場合に特に当てはまります。同様に、Xenopusの卵母細胞と胚を使用して基本的な細胞生物学と発生生物学を研究することは、個々の動物を追跡することで有益です。排卵を誘発した後、動物は過排卵症候群などの健康上の合併症を防ぐために最低3ヶ月間休む必要がある15。個々の同定方法により、動物が頻繁に排卵するように誘導されないようにします。
また、動物のマーキングと追跡により、ラボの担当者は動物の健康上の懸念を追跡することもできます。同じ遺伝子型の動物が病気になるのは、導入遺伝子に関連する過度の近親交配または予期しない健康上の懸念を示している可能性があります。同様に、最近の排卵後に病気になった動物は、試薬、材料、または技術に問題があることを示している可能性があります。動物とその健康状態を追跡することで、研究所の担当者や獣医師は、懸念が再浮上したときにフォローアップし、将来の病気を防ぐための予防策を講じることができます。哺乳類では、多数の識別方法があります。マウスの恒久的な方法には、耳のパンチング、耳のタグ、入れ墨、および皮下マイクロチップ16が含まれる。これらは、コロニーやケージ内の動物を明確かつ確実に区別でき、実験室の担当者が簡単に投与できます。耳を打つなどの方法は、侵襲性が低く、特殊な器具を1つだけ必要とし、ほとんどの年齢の動物に効果があります。これらのシステムはマウスにとっては簡単で便利ですが、カエルでの使用には独自の課題があります。カエルや他の両生類には耳介(外耳の構造)がありません。一部の研究者は、動物の顎、つま先、または後肢17,18にタグを取り付けている。このアプローチは、さまざまな問題を引き起こしました:顎のタグは刺激を引き起こし、興奮したカエルは前肢でタグを引き抜こうとしました17。つま先タグがつま先の間のウェビングを貫通し、動きを妨げ、紛失するリスクを運びました。そのため、両生類は識別のために独自の方法を必要とします。歴史的に、つま先切り取りは両生類17,19をマークするためにも使用されてきました。つま先は鋭利なハサミで切り取られ、動物は前足と後足のつま先の長さ、またはつま先が元に戻った角度(サンショウウオの場合)で識別できます。しかし、この方法は、つま先の切り取りが動物の動きを損なう可能性があるという倫理的な懸念を提起します17。さらに、これは出血を引き起こし、感染のリスクをもたらす可能性があります。別の確立されたマーキングシステムは、カエルの一部から皮膚を採取し、別の部分に外科的に取り付けた皮膚自家移植です。例えば、カエルの背中または肩に、その胸部20からの明るい色の皮膚移植片を使用してカエルの背中または肩をマーキングする方法が記載されている。皮膚移植には制限とリスクも伴います:この手順は侵襲的であり、Aeromonasの親水性感染、または致命的な可能性のある赤い脚のリスクをもたらします。自家移植片の完全な治癒には最大6週間かかります。そして、記載されている方法では、自家移植片20を置く場所が限られているため、6匹のカエルしか一緒に収容できません。
侵襲性の低いマーキングアプローチには、ガラスビーズとトランスポンダチップ17,19が含まれます。ガラスビーズ法では、ガラスビーズを小さな縫合糸に通し、カエルの皮膚に縫い付けます。これにより、皮膚自家移植片よりも大きな変動性が得られ、少なくとも60の特徴的な色の組み合わせがあります。しかし、縫合糸が抜けてビーズが失われるリスクがあります。あるいは、マイクロチップトランスポンダーをカエルの背側リンパ嚢の皮下に埋め込むこともできます。これは最も永続的なマーキング方法と考えられており、潜在的に無限の数の動物を個別に識別してカタログ化することができます。ただし、個々のマイクロチップは高価であり、大きなコロニーはマーキングに費用がかかるため、これは最も高価な方法でもあります。マイクロチップは、19を読み取るために特別なスキャナも必要です。Xenopusの識別のための一般的なアプローチの1つは、動物の自然な色とパターンを参照することです。これは、X. laevisのようなカエルにとって特に効果的で、彼らは成体期を通じて明確なパターンを残します。しかし、これらのパターンはストレスによって時間とともに変化する可能性があり、カエルが透明な容器と着色された容器の間を移動すると、色が異なって見えることがある15。さらに、この同定方法は、X. laevisと比較して明確なマーキングパターンが少ないX. tropicalisや、色のマーキングがないアルビノの動物にはあまり有用ではない21。明確なマーキングを持つ種であっても、研究室の担当者はマーキングの配置とサイズを異なる方法で解釈することがあり、識別にエラーが発生する可能性があります。このため、動物の撮影は、追加の識別方法と併用すると最も信頼性が高くなります。したがって、私たちは、容易に識別でき、永続的で、低侵襲の技術を使用してXenopus動物をマークし、識別することを目指しています。
両生類の入れ墨の方法を説明する公開されたリソースは限られています。入れ墨は、熱ブランド、硝酸銀ブランド、凍結ブランド17など、他のブランディング技術と一緒に説明されています。同じリソースで、入れ墨は27G皮下注射針で数字を描くことによって行われ、そのプロセスは、数字または他のマークに形作られたワイヤーを使用した他のブランディング技術とは対照的に、感染を引き起こさないことが注目されました。別の情報源では、電気入れ墨機(振動針として説明されている)がカエルに印を付けるために使用されたが、技術についての詳細はほとんど提供されなかった17,19。著者たちは、この手順がカエルの保護スライム層を乱すことで、脚が赤くなるリスクが高まると警告している。完全に非侵襲的(写真など)と恒久的な(マイクロチップなど)の両方のマーキングや識別方法はありませんが、入れ墨は効果的な妥協点を提供します。入れ墨は、皮膚自家移植などの他の技術に比べて比較的簡単です。その他の利点には、学習曲線が小さく、機器が比較的安価であることが含まれます。水生両生類の入れ墨には特定の課題が伴い、研究者を威嚇し、成功した動物のマーキングを損なう可能性があります。この論文は、回転式タトゥーマシンで大人のXenopusを入れ墨するための十分に文書化された方法を研究者に提供することを目的としています。

<table><tbody><tr><td>3本針ラウンドライナー</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>1203RLB</td><td>パッケージ滅菌</td></tr><tr><td>5本針ラウンド使い捨てウルトラ</td>ワールド<td>ワイドタトゥーサプライ</td><td>HTIPRS5-U</td><td>パッケージ滅菌</td></tr><tr><td>5本針ラウンドライナー</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>1205RLB</td><td>パッケージ滅菌</td></tr><tr><td>7本針ラウンドライナー</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>1207RLB</td><td>パッケージ滅菌</td></tr><tr><td>クリップコード</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>フットペダル</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>インクポット</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ、繊細なタスクワイプフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>RCA接続</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>スクリームインクピッチブラック、1オンス</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>SI101</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム(NaHCO3)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>ステンレススチールグリップ</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>ステルス2.0ロータリータトゥーマシン</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>ステルス2.0ロータリータトゥーマシンボックスセット</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>STEALTH2セット</td><td></td></tr><tr><td>発泡スチロール島</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>これは発泡スチロールの冷たい輸送容器の蓋です</td></tr><tr><td>トリカイン(エチル3-アミノベンゾネートメタン硫酸塩)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>E10521</td><td>注意:刺激性</td></tr><tr><td>無漂白ペーパータオル</td><td>グレイン</td><td>ジャー2U229</td><td>ペーパータオルは無漂白でなければなりません、漂白剤は両生類に有毒です</td></tr><tr><td>電圧供給</td><td>ワールドワイドタトゥーサプライ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ウォッシュボトル(カエルに安全な水付き)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>FB0340923T</td><td>カエルの安全な水は脱塩素化されています、pH 7.0-8.5、導電率1200-1800 uS</td></tr><tr><td>X. laevis成人女性</td><td>Xenopus1</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>ジップトップビニール袋</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>このバッグは、発泡スチロールの島を保持するのに十分な大きさである必要があります</td></tr></tbody></table>

ロータリータトゥーマシンによる xenopus laevis のタトゥー方法

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

動物モデルは生物医学研究の範囲を広げ、発生生物学、分子生物学、細胞生物学の理解を深め、研究者がヒトの疾患をモデル化することを可能にします。個々の動物を記録し追跡することで、研究者は研究に必要な動物の数を減らし、動物の健康を改善するための実践を洗練させることができます。哺乳類のマーキングと追跡には、耳のパンチングや耳のタグなど、いくつかの十分に文書化された方法が存在します。しかし、水生両生類の種をマーキングする方法は限られており、既存の資源は時代遅れであったり、効果がなかったり、法外に高価であったりします。この原稿では、ロータリータトゥーマシンで Xenopus laevis をマーキングする方法とベストプラクティスを概説します。適切な入れ墨は高品質の入れ墨をもたらし、研究者が個人を簡単に区別できるようにし、動物の健康へのリスクを最小限に抑えます。また、入れ墨がすぐに消えて動物に不必要な害を及ぼす可能性のある、質の悪い入れ墨の原因を強調します。このアプローチにより、研究者や獣医師は両生類に印を付けることができ、生物学的複製やトランスジェニック系統を追跡し、動物の健康状態を正確に記録することができます。

高品質の入れ墨は、カエルの胸に暗くて読みやすいストロークがあり、数フィート離れた場所から明確に区別できます(図5A)。一般に、数字やマーキングは読みやすくするために大きいほど優れていますが、長い名前や数字は、カエルの胸に快適に収まるように小さくすることができます。入れ墨の寿命を判断するのはより困難ですが、高品質のカエルの入れ墨は、少なくとも3〜6か月間は暗くて読みやすいままである必要があります(図5D-D ')。タトゥーが色あせたら、同じ技術で修正することができます。
技術が不十分であっても動物に害を及ぼすことはありませんが、入れ墨がすぐに消える可能性があり(図5B)、より頻繁なタッチアップにつながる可能性があります。過度に入れ墨をすると出血や発赤を引き起こす可能性があり、カエルを間違った回復位置に置くと、意図しない溺死を引き起こす可能性があります。
入れ墨の品質と技術の有効性は、入れ墨後の数か月で評価できます(図5E)。回復期間後にカエルにインクがある限り、入れ墨は成功したと見なされます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig01v2.jpg"> 図1:プロトコールのワークフローとベンチのセットアップ(A)ワークフローとタイミング。(1)カエルは、1.5 g / Lのトリカインと3.5 g / Lの重炭酸ナトリウム、pH 7.15の溶液で麻酔をかけられ、カエルに安全な水に溶解して7〜8分間過ごします。1匹のカエルがタトゥーを入れている間、もう1匹のカエルを麻酔タンクのデッキに置くことができます。一度にトリカイン溶液に入れることができるカエルは1匹だけです。(2)カエルは入れ墨のために水から約10分を費やします。時間は、タトゥーのサイズとラボのスタッフの経験によって異なります。(3)意識を失ったカエルを発泡スチロールの上に30〜45分間置いて溺れないようにし、濡れたペーパータオルで覆って乾燥を防ぎます。(4)入れ墨の後、カエルは新鮮なカエルに安全な立っている水で回復するのに24時間を費やします。彼らが回復したら、カエルを彼らのコロニーに戻すことができます。(B)ワークスペースの例のベンチセットアップ。無漂白のペーパータオルであるタトゥーワークスペースは、ベンチの中央に配置されています。タトゥーマシンと電源電圧はペーパータオルの左側にあります。これらは、人員の利き側に配置されます(人員は左利きです)。インクポットとタトゥーインクは、電圧供給の近く、タトゥーワークスペースの邪魔にならないように配置されています。フットペダルは電圧供給と同じ側にあります。このフットペダルを踏むと、回転運動が制御されます。糸くずの出ないワイプとカエルに安全な水が入ったスクイーズボトルは、ペーパータオルの右側にあります。これらは、入れ墨中にカエルの皮膚から余分なインクをきれいにするために使用されます。アレンレンチは、タトゥーマシンのネジを締めたり緩めたりするために使用されます。これは、タトゥーマシンの組み立てと分解に使用されます。麻酔タンクと予備のペーパータオルも入れ墨の間、ベンチに置いておきます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig02.jpg"> 図2:タトゥーマシンの組み立て (A)タトゥーニードル、グリップ、および関連部品を分解した画像。金属製のグリップのネジは赤で丸で囲まれています。(B)タトゥー針がグリップに適切に組み立てられている画像。(C)タトゥーガンに組み立てられたタトゥー針とグリップの画像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig03.jpg"> 図3:カエルの入れ墨の位置決めと参照画像(A)ペーパータオルの上にうつ伏せに横たわるカエルの画像。矢印はカエルの胸骨を指しています。(B)研究室の職員がカエルにインクを塗っている画像。(C)インク中、(C)の余分なインクが洗い流された後、インクを塗る前、および(C')の数字の画像。(D)インクを塗った直後、回復前のカエルの入れ墨の画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig04.jpg"> 図4:タトゥー後の回復 (A)発泡スチロールの島。発泡スチロールのアイスボックスの蓋は、ジップトップバッグの中に入れられます。(B)入れ墨後の回復位置にあるカエル。発泡スチロールの島は、通常、1匹または2匹のカエルを収容できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67086/67086fig05.jpg"> 図5:代表的な結果の例(A)入れ墨されてから24時間後の新しい入れ墨。(B)質の悪い技術。(B)では、タトゥーマシンは適切に組み立てられていなかったが、それでも回転運動は可能であった。この写真はタトゥーを入れてから4ヶ月後に撮影したものです。(B')では、タトゥーマシンが適切に組み立てられておらず、回転運動ができませんでした。この写真はタトゥーを入れてから6ヶ月後に撮影したものです。(C)不適切に組み立てられたタトゥーマシン。金属チューブとプラスチックチップは存在せず、金属グリップはタトゥーマシンの他の部分に正しく固定されていません。輪ゴムは回転運動を損ないます(D)カエルの回転運動を損ないます:良い技術と適切な機器のセットアップで入れ墨されたカエルの前（D)）と後（D'。(D)はタトゥーを入れた直後に、(D')はタトゥーを入れてから4ヶ月後に撮影しました。(E)カエルの入れ墨の結果の定量的データ。入れ墨されたカエルのうち、100%は入れ墨の直後に目に見える入れ墨をし、100%は入れ墨の24時間後に、91%は入れ墨の4か月後に入れ墨をしました。n = 58匹のカエル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67086/67086fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、回転式タトゥーマシンで大人の Xenopus laevis (アフリカの爪のあるカエル)の入れ墨の方法について説明します。適切な入れ墨は、数ヶ月間持続し、研究や記録管理の目的で動物を簡単に区別できるようにする、暗くて読みやすい数字をもたらします。

ロータリータトゥーマシンによる Xenopus laevis のタトゥー方法

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ロータリータトゥーマシンによる Xenopus laevis のタトゥー方法

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