Name: タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶNMR¹⁵N緩和実験によるタンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクス解析法。残基特異的な動的挙動を測定し、本質的に無秩序なタンパク質の柔軟性と分子機能を解明する強力なプロトコルを提供する。

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<meta charset="utf8"></head><body>蛋白質の動力学の調査のNMR 15Nの緩和およびhetNOEの実験のためのプロトコル

このプロトコルは、Lakomekら69およびStiefら70によるNMR 15N緩和実験のセットアップについて説明しました。私たちは、感度を高めたHSQC検出スキームを用いたNMRパルス配列に着目しました。15N R1およびR1ρ実験は、Stief et al.70によって詳細に記述されているように実施されており、hetNOE実験はLakomek et al.69によって記述されている。
NMR緩和実験を設定する際には、最大緩和期間が長すぎたり、スピンロックのRF振幅が高すぎたりするとプローブが損傷する可能性があるため、 15N R1ρ が最も重要です。緩和期間では、100%の強度から25%の強度(参照実験と比較して)の完全な減衰曲線を均等にサンプリングすることが望ましいです。IDPのように、 15N Tが2 倍長いゆっくりとリラックスするタンパク質の場合、プローブへのパワー蓄積を制限する必要があるため、崩壊曲線を完全にサンプリングすることは手が届かないことがよくあります。
15Nの無線周波数(RF)振幅の場合、理論的には、RF振幅νスピンロックが大きいほど、より多くの交換プロセスを再焦点化できるため、より良い結果が得られます。経験則として、1 / (2π νスピンロック) より遅い交換プロセスは、再焦点を合わせることができます。ただし、RF 電力の制限が適用されます。たとえば、私たちの手では、安全側にとどまるために2kHzのRF振幅が適用された場合、最大スピンロック期間の65ミリ秒を超えません。同時に、600 MHzの分光器でのスピンロックRF振幅は1 kHz(たとえば、600 MHzで1.4 kHz)よりも高くなければなりません。これは、小さな球状タンパク質gb369に対して十分であることが証明されています。スペクトル幅をカバーし、より高い電界強度でのオフ共振効果を回避するには、対応するRF振幅を磁界に合わせてスケーリングする必要があります(たとえば、900MHzで1.5倍(νスピンロック<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;">2kHz)。ただし、プローブの制限内にとどまる必要があります。(分光器の電力制限に関するローカルリストを参照し、NMR施設マネージャーにアドバイスを求めてください。 
参照実験(短絡遅延)と最長遅延期間(上記の要因によって決定)との間の緩和遅延の間隔の選択については、緩和遅延データポイントの間隔を等しくし、8の数を選択します(割り当てられた測定時間と信号対雑音比が許される場合)。最初のインクリメント(およびその後のインクリメント)は、最も強い(そしてしばしば最も遅いリラックスする)残留物によって支配されます。したがって、タンパク質のダイナミックレンジによっては、タンパク質配列中のいくつかの残基のNMRシグナルは、選択された最大緩和期間後にすでに崩壊している可能性があります。遅延ポイントを等間隔にすることで、高速緩和残基の緩和曲線も、緩和曲線をサンプリングする十分な数のデータ ポイントによってカバーされます。
また、正確な緩和データを取得し、プローブへの長期的な損傷を避けるためには、回復遅延の適切な選択が不可欠です。プローブの損傷を防ぐために、少なくともD1 = 2秒の回復遅延を選択します。正確な結果を得るためには、タンパク質 1Hおよび 15Nの縦分極も、平衡状態または少なくとも安定した定常状態に戻るのに十分な時間を与える必要があります。 1H T1 は通常、600 MHzで1秒から4秒の間で変化し、中小規模のタンパク質(最大20 kDa)です。より大きなタンパク質や高磁場では、 1H T1 はさらに増加します。小さな球状タンパク質gb3については、 15N R1 およびR1ρ の実験にD1 = 3.5秒で十分であることがわかりました。このプロトコルで提示された小さなIDP Syb-2については、最近、D1 = 2 sが適切な70であることを示しました。
15N hetNOEは、励起が15Nで開始され、パルスシーケンスの先頭に1 H-15N INEPTが適用されないため、感度が最も低くなります。さらに、正確なデータを得るためには、1H飽和期間と15N回復遅延を15NT1の5倍にする必要があります。ここで紹介するIDP Syb-2では、5秒の飽和/回復遅延と追加の2秒のD1回復遅延(合計7秒)で十分でしたが、より大きなタンパク質および/または重水素化タンパク質の場合、この時間は大幅に長くなる可能性があります(例:10秒以上)。ただし、定性的データが十分に優れている場合は、わずかな系統的オフセットを受け入れることができます。その場合、飽和度の95%が達成されるため、15NT1の3倍ですでに合理的な結果を得ることができます。その場合、結果の hetNOE 値は、より高い値へのシステマティック オフセットを示します。
このプロトコルでは、最もコスト効率の高い完全プロトン化 15N Syb-2を使用しました。側鎖重水素化は、リラクゼーション経路の数を減らし、最も単離された 1 H-15N骨格アミドスピンペアと連携するために推奨されます。しかし、 15N2H Syb-2と 15N syb-2を比較すると、重水素化サンプルと完全プロトン化サンプルとの間にはわずかな違いしか見られない70。実用的な目的のために、NMR緩和データは、二重または三重標識サンプル(15N13Cまたは 2H15N13C)に頻繁に記録されます。今回取り上げたNMRパルスシーケンスは、 13Cと 1Hまたは 15N核との間のJ結合進化を再集束させることができます。明らかに、 13C標識が導入されると、リラクゼーション経路も増加します。しかし、私たちの手元では、実用的な目的では、導入された誤差は、たとえあったとしても5%未満であり、定性的なデータのみが必要な場合には許容できる可能性があります。
検出のために異なるサイズのタンパク質を扱う場合、感度を高めたHSQC検出実験70 とTROSY検出実験69のどちらを選択するかという問題がしばしば生じる。低分子タンパク質の場合、感度を高めたHSQC検出NMR実験により、S/N比が2倍向上します(良好な水抑制が得られる場合)。より大きなタンパク質の場合、TROSYで検出された実験が優先されます。損益分岐点は、折り畳まれたタンパク質で約20kDaです。鎖長の増加に伴ってほぼ直線的に増加する低いR2 レート定数が得られるIDPの場合、損益分岐点はより高い分子量にシフトできます。実用的な目的では、疑わしい場合は、感度を高めたHSQC検出実験またはTROSY検出実験の両方を実施することをお勧めします。次に、最初の増分で最高の信号対雑音比を提供するものを選択します。
感度を高めたHSQC検出実験とTROSY検出実験のどちらを選択するかという議論は、S/N比が主な基準である場合にのみ当てはまります。最小の線幅と最高の解像度が必要な場合、TROSYは常に勝ちます。また、TROSYは、プロトンパルスが少なく、プロトンデカップリングが不要なため、常に最高の水抑制を提供します。より広範な議論については、以前に公開された記事69 を参照してください。
水抑制の問題について、もう一つお話しします。Bruker Avance NEOコンソールではレシーバー・ゲイン(rg)を16に設定するだけで十分な場合がありますが、(古い)Bruker Avanceコンソールでは通常、レシーバー・ゲインを128〜256の範囲にすることが望ましいです。達成可能なrg(ブルカーコマンド rgaによって決定される)は、残留水信号の強度から騒音レベルまで頻繁に得られます。水の抑制が悪いと、常にスペクトルに追加のノイズが発生します。したがって、Bruker Avance NEOコンソールでrg = 16を達成できたとしても、残りの水信号はノイズレベルに大きく寄与する可能性があります。したがって、信号対雑音比は減少します。したがって、rg レベルを 128-256 にすることをお勧めします。提示されたパルスシーケンス70 は、600MHzおよび1200MHzでテストされている。どちらの電界強度も、パルスシーケンスに記述されている同じグラジエント設定で機能します。少なくとも、さらなる最適化のための良い出発点として、これらをお勧めします。
冒頭で述べたように、議論されたNMR緩和実験は、ピコ秒からナノ秒の時間範囲のみをカバーしています。マイクロ秒からミリ秒のダイナミクスに関する洞察を得るために、緩和分散実験、CPMG実験、およびスピンロック振幅(またはキャリア周波数)を変化させるR1ρ実験の拡張が使用されています44,46,58,59,60,61,85,86。マイクロ秒より遅いダイナミクスは、15N CEST(化学交換飽和移動)NMR62、交換分光法(EXSY、ミリ秒から秒)、またはRT(リアルタイム)NMR(秒から時間)63,64を捕捉することができる。常磁性プローブのPRE(常磁性緩和強化)効果、および残留双極子カップリング(RDC)を使用して、psからmsのダイナミクス65,66,67,68の全範囲を評価できます。
これらの実験はすべて、バックボーンのダイナミクスのみをカバーしています。側鎖ダイナミクスを調べるために、Kay氏らは、1 MDa 2,87までのタンパク質の側鎖ダイナミクスに関する情報を提供する、別の多数のNMR実験を導入しました。
タンパク質骨格ダイナミクスについてより定量的な洞察を得るためには、15N R1、R2、hetNOEの3つのNMRパラメータすべてを組み合わせた解析が必要であり、時には相互相関した緩和速度定数など、さらに追加のパラメータが含まれることもあります。さまざまな洗練された分析方法が開発されています。いわゆるモデルフリーアプローチは、生体分子NMR43,88,89,90,91に広く適用されています。また、スペクトル密度マッピングは貴重な洞察を提供することができます55,92,93。これらは、回転相関時間が明確に定義された球状タンパク質の強力な解析方法ですが、IDPへの適用性は限られています。回転相関時間39を定義するためには、折り返し領域が必要である。これは、相関関数C(t)を指数関数的に減衰する関数の合計でモデル化できる場合、関連するさまざまな時間スケールが十分に分離できる場合、部分的に回避できます23,31,84。明確に定義された回転相関時間がない場合、相関時間の分布を含む代替アプローチ、例えば、IMPACT解析94またはDETECTOR解析95,96が代替である。さらに、NMR緩和データとMDシミュレーションの複合解析もIDPs97にとって有望です。現在、より大きなIDP31,98の全原子シミュレーションでは、サンプリングと力場の制限にまだ直面しています。

<table><tbody><tr><td>Bruker 600 MHz AVANCE III HD 分光計&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>NMR実験を実施&nbsp;</td></tr></tbody></table>

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのnmr 15n緩和実験

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

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