Name: 自由移動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバー測光の同時記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ 自由移動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバー測光の同時記録手法。カルシウムダイナミクスをリアルタイムで測定し、脳機能と神経活動の調節メカニズムを解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、中国国家自然科学基金会(32371151)、広東省高レベルイノベーション研究所(2021B0909050004)、香港研究助成評議会共同研究基金(C5053-22GF)、一般研究基金(15224323および15104520)、香港イノベーション技術基金(MHP / 014/19)、香港理工大学(G-SACDおよび1-CDJM)からの内部資金によって部分的にサポートされています。 遼寧省自然科学基金-国家ロボット工学研究所の共同公開基金(2022-KF-22-03)。著者は、香港理工大学の生命科学大学研究施設(ULS)および行動およびシステム神経科学大学研究施設(UBSN)からの施設と技術サポートに感謝します。

すべての手順と動物の取り扱いは、NSFCの倫理ガイドラインに準拠し、広東情報科学技術研究所の施設動物管理および使用委員会の承認されたプロトコル要件に準拠していました。
1. トランスデューサーの準備
<ol><li>内径3mm、外径7mm、中心周波数500kHzの圧電プレートを用意します。 注:外径は、標的とされる特定の脳領域に基づいて調整でき、刺激精度を維持しながら、マウスの頭蓋骨の境界を超えないように最大化する必要があります。</li>
	<li>エポキシ銀ペーストを使用して、圧電プレートの両側にワイヤーを取り付けます(図1)。エポキシ銀ペーストが固まったら、マルチメータを使用してワイヤの両端の抵抗を測定し、約0であることを確認します。</li>
	<li>清潔なガラスシートの表面に両面テープの層を貼り付けます。高さ8mm、外径8mm、内径7.6mmの圧電プレートと銅リングをガラスシートにしっかりと接着します。 注意: 銅リングの内径は、圧電プレートのサイズによって決定され、プレートが銅リングで覆われていることを確認します。</li>
	<li>圧電プレートの中央に外径3mmのポリプロピレンパイプを確実に挿入し、ガラスシートにしっかりと接着します(図1)。</li>
	<li>エポキシ樹脂のりを適量用意し、真空にします。使い捨ての注射器を使用してエポキシを抽出し、ゆっくりと銅リングに注入します。エポキシ樹脂が固まるまで約10時間待ちます(図1)。</li>
	<li>電子はんだごてを使用して、2本のワイヤの緩い端をバヨネットナットコネクタにはんだ付けします。ガラスシートを取り外します。トランスデューサーの表面をアルコールで清掃します(図1)。</li>
</ol>2. FUNのレポートパラメータ
<ol><li>ハイドロフォンとトランスデューサーを脱イオン水で満たされた水タンクに入れます(図2A)。ポジショニングシステムの中央ビーム(Z軸)がトランスデューサーの軸と位置合わせされていることを確認してください。このアライメントは、まず、2Dスキャンを通じて焦点面の最大フィールドを発見することで実現できます。次に、明確な最大値を持つ別の平面のフィールド最大値を特定します。第三に、2つの最大値のX座標とY座標を比較し、必要に応じてトランスデューサの位置および/または向きを繰り返し調整します28。</li>
	<li>トランスデューサーの表面を1 mmの距離にしてハイドロフォンの先端を調整し、この距離を一定に保ちながら、ハイドロフォンをトランスデューサーの右端の中央に配置します。スキャンプログラムを開始して、XZ平面の自由音場をキャプチャします(図2B)。 注:ハイドロフォンの構築方法は https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control にあります。</li>
	<li>ハイドロフォンを Z 軸に沿って移動して、空間ピーク圧力に関連付けられた深さを決定します。この実験では、空間ピーク圧力はトランスデューサーの表面から3.4 mmの距離に現れます。ハイドロフォンをXY平面のトランスデューサーの右下隅に移動するときは、この距離を維持します。電源を入れてスキャンプログラムを開始し、XY平面の自由音場をキャプチャします(図2B)。</li>
	<li>手順4で説明したように、手術を受けたマウスの頭蓋骨にトランスデューサーを置きます。2.1-2.3で説明されているように、ハイドロフォンスキャンを通じてXZ平面とXY平面(図2D)の経頭蓋音場を取得します。</li>
	<li>自由音場と経頭蓋音場の空間ピーク領域である焦点での圧力振幅を読み取ります。自由音場の焦点での圧力振幅は730k Paで、経頭蓋音場では580k Paです。-3 dBでの焦点寸法(図2C、E)と、経頭蓋音場内のXY面とXZ面の位置を読み取り、このトランスデューサの音場が標的の脳領域をカバーできるかどうかを評価します。</li>
	<li>キャビテーションを軽減するために、FDA のガイダンス ドキュメントによって 1.9 未満に制限されている機械指数 (MI) を計算します。MIの計算は、次の式で与えられます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) ここで、p r,.3 は 0.3 dB cm-1 MHz-1 の減衰係数で調整されたピーク希薄圧力 (MPa) を表し、 f0 は動作周波数 (MHz) です。測定された経頭蓋場ピーク希薄圧は、トランスデューサーから3.4 mmのところで580 kPa、 f0 は500 kHz、したがって、ディレーティングされたpr,.3 は576.6 kPaです。MIは0.82です。</li>
	<li>FDAのガイダンス文書に従って、平面方向に190 W / cm2未満である必要がある空間ピークパルス平均強度(Isppa)を計算します。強度の計算は、次の式で与えられます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq02.jpg" style="margin: auto;">(2) ここで、psp (t) は空間ピーク位置での時間変動する音圧、 Z は媒体の特性音響インピーダンス (約 1.5 x 106 Rayls for soft tissue)、PDはパルス持続時間です。正方形のエンベロープの場合、これは次の式に帰着します。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) ここで、Aは空間ピーク圧力振幅です。超音波集束位置で測定されたAは580 kPaで、脳のZは約1.58 x 106 Raylsであるため、正方形のエンベロープのIスッパ は10.65 W / cm2 であり、正弦波エンベロープのIスッパ は10.65 W / cm2です。</li>
	<li>空間ピーク時間平均強度 (Ispta) を計算します。これは、FDA のガイダンス ドキュメントによって平面方向の 430 mW/cm2 未満に制限されています。強度の計算は、次の式で与えられます。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq04.jpg" style="margin: auto;">(4) ここで、T は平均が計算される期間です。正方形のエンベロープの場合、これは次の式に帰着します。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq05.jpg" style="margin: auto;">(5) ここで、DCパルス列 はパルスのデューティサイクルです。ここで、連続波が使用されたため、DCパルス列は1%であり、 Isptaは空間ピークパルス平均強度に等しく、正方形のエンベロープの場合は106.5 mW / cm2 です。MI、 Isppa、 Ispta は、ソフトウェアを使用して計算できます(図3A)。使いやすいMATLABベースのコードは、https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation にあります。</li>
	<li>A最大、パルス持続時間、パルス繰り返し間隔、パルス列持続時間、エンベロープなどのパルスタイミングパラメータを報告します(図3B)。</li>
</ol>3.手術のための動物の準備
<ol><li>体重は8週齢の雄GCaMP6sトランスジェニックマウスで、体重は約20gです。滅菌生理食塩水にケタミンを10 mg / mLで、キシラジンを2 mg / mLで含有する溶液を調製します。.26Gの針と1mLの使い捨て注射器を使用して、100 mg / kgのケタミンと20 mg / kgのキシラジンの投与量で腹腔内注射によりケタミン/キシラジン溶液を投与します。.動物がつま先のつま先をつまむような痛みを伴う刺激に反応しなくなったら、外科的準備を開始します。</li>
	<li>フェーダーを使用して動物の頭の毛を切り取り、外科的処置の前に70%エタノールとポビドンヨードでその部分を消毒します。</li>
	<li>マウスを脳定位固定装置フレームの腹臥位に置き、頭蓋骨が水平であることを確認します。動物の目の上に保護用の眼軟膏を塗り、水分を保ちます。</li>
</ol>4. 外科的処置
<ol><li>後頭骨から鼻骨の始まりまで、矢状縫合糸に沿って切開を行います。外科用ハサミを使用して、両方の半球を覆っている皮膚を取り除きます。</li>
	<li>滅菌生理食塩水を使用して頭蓋骨を洗浄し、残っている骨膜を取り除きます。</li>
	<li>露出した頭蓋骨に綿棒を使用して約2秒〜3秒間3%過酸化水素を塗布し、微細孔を作成します。滅菌生理食塩水で十分にすすぎ、その領域が完全に乾いていることを確認します。</li>
	<li>ブレグマとラムダに整列した脳定位アトラスによって決定される脳領域の位置の上にある滅菌済みのオートクレーブドリルビットを使用して、直径0.6mmのバリ穴開頭術を作成します。滅菌生理食塩水で破片を洗い流し、完全に乾燥させます。ティッシュを傷つけないように注意してください。</li>
	<li>光ファイバーフェルール(インプラント)をプローブホルダーに挿入し、脳定位固定アームに接続します。</li>
	<li>脳定位固定アームを使用して、インプラントを関心領域の真上に位置合わせします。光ファイバーを脳組織に挿入する際は、約2mm/minの速度でゆっくりと進めてください。</li>
	<li>歯科用セメントを混合して、頭蓋骨全体に簡単に塗布できる粘度を実現します。滅菌爪楊枝を使用して、歯科用セメントの薄い層を頭蓋骨の上とインプラントの下部に広げます。完全に乾かします。</li>
	<li>プローブホルダーを慎重に取り外します。高さ3mm、外径3mm、内径2.6mmのポリプロピレンパイプを用意し、パイプを全長にわたって切断します。</li>
	<li>ピンセットを使用してパイプをインプラントの底に取り付けます。歯科用セメント粉末をパイプに注ぎ、光ファイバー信号を記録するためにインプラントの上に十分な長さを確保します。必要な液体を追加し、歯科用セメントが固まるまで数分待ちます。</li>
	<li>パイプの開口部を特定し、慎重にcl ピンセットを使用してパイプを取り外すためにそれを囲みます。歯科用セメント混合物を塗布する準備をし、頭蓋骨全体に均一で薄い層が広がるようにします。頭蓋骨の表面積をできるだけ歯科用セメントで覆います。デンタルセメントが固まるまで数分待ちます。 注意: 歯科用セメントをマウスの皮膚に接触させないでください。</li>
	<li>3Dプリントされたリングに3つの穴(直径1mm)をドリルで開け、水平線上に均等に分割し、高さ7 mm、外径10 mm、内径8.4 mmにします。ネジ(長さ1 mm)をそれぞれの穴に固定します。</li>
	<li>インプラントの上部を、事前に製造されたトランスデューサーの穴に挿入します。3Dプリントリングの内壁が滑らかであることを確認してから、マウスの頭蓋骨に配置されたトランスデューサーの周りに配置します。トランスデューサーがリングの中央にあることを確認します。</li>
	<li>リングと頭蓋骨の間の接合部に歯科用セメントを塗布し、歯科用セメントが固まるまで数分待ちます。トランスデューサーと頭蓋骨の間の接続部に歯科用セメントを置かないでください。</li>
	<li>トランスデューサーを慎重に取り外し、ネジをしっかりと締めます。マウスを温かいケージに移し、完全に回復するまで監視してから元のケージに戻します。</li>
	<li>手術後、鎮痛のために皮下カルプロフェン(2 mg / kg)を投与し、炎症と痛みを管理するために24時間ごとに3日間続けます。.苦痛、異常な体重減少、痛み、または感染の兆候がないか、動物を毎日監視してください。通常、術後3日目までに 、すべてのマウスは正常な行動を示すはずです。3日目 以降にマウスに苦痛や病気の兆候が観察された場合は、安楽死に関する施設のガイドラインに従ってください。</li>
</ol>5.刺激と信号の記録
<ol><li>手術後7日で、ガス麻酔器への酸素供給をオンにし、酸素流量調整器を調整してガス流量を300〜500mL / minに設定します。</li>
	<li>マウスを誘導チャンバーに入れ、マスクへの麻酔ガスの供給を閉じます。気化器のダイヤルを回して、適切な麻酔薬濃度(2%〜2.5%)を調整します。</li>
	<li>マウスに麻酔をかけた後、麻酔マスクを装着してマウスを定位固定装置フレームに置きます。誘導ラインを閉じて、麻酔ガスを麻酔マスクに流します。適切な維持麻酔薬濃度(1%-1.5%)を調整します。</li>
	<li>インプラントの上面をアルコールで洗浄し、準備したトランスデューサーの中央に光ファイバーパッチコードを挿入します。</li>
	<li>26Gの針と1mLの使い捨て注射器を使用して、インプラントと3Dプリントリングの間のスペースに水を注入し、頭蓋骨を湿らせます。ペーパータオルを使用して余分な水分を吸収します。</li>
	<li>26Gの針と1mLの使い捨てシリンジを使用して、インプラントと3Dプリントリングの間のスペースにカップリング剤を注入し、トランスデューサーから脳への超音波の伝播を容易にします。</li>
	<li>インプラントを光ファイバーパッチコードに接続します。カップリング剤が充填された領域にトランスデューサーを慎重に挿入し、ネジをしっかりと締めます。</li>
	<li>マウスをオープンフィールドに置き、ウェイクアップさせます。超音波励起システムにトランスデューサを取り付け、光ファイバーパッチコードを光ファイバー記録システムに接続すると、マウスの動きが自由になります。 注:光ファイバーパッチコードの長さは2m、直径は1.25mmです。光強度は、405チャンネルが20μW、470チャンネルが40μWです。</li>
	<li>超音波励起装置と光ファイバー記録システムの両方を作動させて、超音波神経変調と光ファイバー信号記録を同期させます。</li>
</ol>

自由移動マウスにおけるFUNおよびファイバー測光のための統合プロトコル

<ol><li>Wang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+for+noninvasive%2C+focal+pharmacologic+neurointervention%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention.</a> Front Neurosci. 14, 514541(2020).</li>
<li>Bystritsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+low-intensity+focused+ultrasound+pulsation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">A review of low-intensity focused ultrasound pulsation.</a> Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).</li>
<li>Di Ianni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultrasound+neuromodulation+in+awake+and+freely+behaving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats.</a> Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Badran, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication+of+the+anterior+thalamus+with+mri-guided+transcranial+focused+ultrasound+%28tfus%29+alters+pain+thresholds+in+healthy+adults%3A+A+double-blind%2C+sham-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study.</a> Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).</li>
<li>Yaakub, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound-mediated+neurochemical+and+functional+connectivity+changes+in+deep+cortical+regions+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans.</a> Nat Comm. 14 (1), 5318(2023).</li>
<li>Murphy, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+for+monitoring+cell+type-specific+focused+ultrasound+neuromodulation+and+control+of+chronic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy.</a> Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119(2022).</li>
<li>Niu, X., Yu, K., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+induces+sustained+synaptic+plasticity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound induces sustained synaptic plasticity in rat hippocampus.</a> Brain Stimulation. 15 (2), 352-359 (2022).</li>
<li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+torpor-like+hypothermic+and+hypometabolic+state+in+rodents+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metabol%22%5BJournal%5D)">Induction of a torpor-like hypothermic and hypometabolic state in rodents by ultrasound.</a> Nat Metabol. 5 (5), 789-803 (2023).</li>
<li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote%2C+brain+region-specific+control+of+choice+behavior+with+ultrasonic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Remote, brain region-specific control of choice behavior with ultrasonic waves.</a> Sci Adv. 6 (21), 4193(2020).</li>
<li>Deffieux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-intensity+focused+ultrasound+modulates+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Low-intensity focused ultrasound modulates monkey visuomotor behavior.</a> Curr Biol. 23 (23), 2430-2433 (2013).</li>
<li>Gaur, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+safety+of+transcranial+focused+ultrasound+neuromodulation+and+magnetic+resonance+acoustic+radiation+force+imaging+in+rhesus+macaques+and+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Histologic safety of transcranial focused ultrasound neuromodulation and magnetic resonance acoustic radiation force imaging in rhesus macaques and sheep.</a> Brain stimulation. 13 (3), 804-814 (2020).</li>
<li>Fouragnan, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macaque+anterior+cingulate+cortex+translates+counterfactual+choice+value+into+actual+behavioral+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The macaque anterior cingulate cortex translates counterfactual choice value into actual behavioral change.</a> Nat Neurosci. 22 (5), 797-808 (2019).</li>
<li>Folloni, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation+of+the+deep+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation of the deep brain.</a> Science. 377 (6606), 589-589 (2022).</li>
<li>Verhagen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Offline+impact+of+transcranial+focused+ultrasound+on+cortical+activation+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Offline impact of transcranial focused ultrasound on cortical activation in primates.</a> Elife. 8, e40541(2019).</li>
<li>Yang, P. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+of+sensory+networks+in+monkey+brain+by+focused+ultrasound+with+mri+guidance+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation of sensory networks in monkey brain by focused ultrasound with mri guidance and detection.</a> Sci Rep. 8 (1), 7993(2018).</li>
<li>Yu, K., Niu, X., Krook-Magnuson, E., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+functional+neuron-type+selectivity+of+transcranial+focused+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Intrinsic functional neuron-type selectivity of transcranial focused ultrasound neuromodulation.</a> Nat Comm. 12 (1), 2519(2021).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensitive+ion+channel+piezo1+contributes+to+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The mechanosensitive ion channel piezo1 contributes to ultrasound neuromodulation.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (18), e2300291120(2023).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M4+muscarinic+receptor+signaling+ameliorates+striatal+plasticity+deficits+in+models+of+l-dopa-induced+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">M4 muscarinic receptor signaling ameliorates striatal plasticity deficits in models of l-dopa-induced dyskinesia.</a> Neuron. 88 (4), 762-773 (2015).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Meth. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+engineering+of+xcamps%2C+a+multicolor+geci+suite+for+in+vivo+imaging+of+complex+brain+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rational engineering of xcamps, a multicolor geci suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics.</a> Cell. 177 (5), 1346-1360 (2019).</li>
<li>Legaria, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+photometry+in+striatum+reflects+primarily+nonsomatic+changes+in+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fiber photometry in striatum reflects primarily nonsomatic changes in calcium.</a> Nat Neurosci. 25 (9), 1124-1128 (2022).</li>
<li>Kamimura, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+neuromodulation+of+cortical+and+subcortical+brain+structures+using+1.9+mhz%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound neuromodulation of cortical and subcortical brain structures using 1.9 mhz.</a> Med Phys. 43 (10), 5730-5735 (2016).</li>
<li>Xian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+deep+neural+circuits+with+sonogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of deep neural circuits with sonogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120(2023).</li>
<li>Mohammadjavadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+peripheral+auditory+pathway+activation+does+not+affect+motor+responses+from+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation.</a> Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).</li>
<li>Harris, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophone+measurements+for+biomedical+ultrasound+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrasonics+Ferroelect+Freq+Cont%22%5BJournal%5D)">Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review.</a> IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).</li>
</ol>

著者には、開示すべき利益相反はありません。

このアプローチは、FUNと光測光記録を組み合わせたもので、マウスの脳機能や in vivo FUNメカニズムの解明を可能にします。トランスデューサーの作製から外科的処置まで、完全な運用プロセスの概要が示されているため、研究者はフィールド外から独立してFUNを行うことができます。
プロトコルの重要な側面の1つは、光学インプラントがトランスデューサーにスムーズに挿入され、頭蓋骨を横切る歯科用セメントが脳への超音波浸透に十分に薄く、光学インプラントが実験中に外れるのを防ぐために頭蓋骨にしっかりと接続され、トランスデューサーのエネルギー出力が効果的な神経調節に十分であることを確認することです。インプラントを囲む歯科用セメントの厚さは、トランスデューサーの穴の直径以下である必要があります。したがって、トランスデューサーの製造プロセスと手術の両方に同じポリプロピレンパイプを使用することをお勧めします。ポリプロピレンパイプは歯科用セメントに付着しないため、インプラントの周囲に歯科用セメントを成形するために選択され、サイドカットでポリプロピレンパイプの取り外しが容易になります。
電気生理学的記録と光測光記録は、生体内での脳活動を監視するために一般的に利用されている技術であり、高い時間空間分解能を提供します。しかし、電気生理学的記録は、電極に直接付着したニューロンからの発火活動信号を捕捉します。超音波は電極を直接振動させ、不必要な交絡効果を誘発する可能性があります。幸いなことに、侵襲性の低いファイバー測光技術は、その下のニューロンの活動を捕捉し、インプラント7,19,26に対する超音波振動の交絡効果を減らすことができる。その結果、自由運動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバーフォトメトリー記録を同時に行う技術により、超音波ニューロモデュレーションのin vivoメカニズムの研究が可能になり、麻酔の干渉なしにマウスの行動応答を観察することができます。
しかし、ファイバー測光の空間分解能は、細胞内および微小回路24の活性を監視することができないため、制限されている。さらに、ニューロンの活動によって生成される電気信号を直接記録しないため、ニューロンの活動を間接的に表現します。

集束超音波ニューロモデュレーション(FUN)は、有望で用途の広いニューロモデュレーションツールとして登場し、大きな可能性を秘めた脳機能と組織の探索を可能にしました1。FUNは、ピンポイントの精度で脳組織内の任意の位置に音響エネルギーを非侵襲的に供給することができます2.脳深部構造の神経活動を、高い時空間特異性で、安全かつ非侵襲的に一過性および可逆的に調節するその能力は、既存の臨床神経調節技術を補完する魅力的な属性を示しています3。効果的なFUNの実証は、ヒト被験者4,5,6と、小型7,8,9,10および大型種11,12,13,14,15,16,17を含むさまざまな動物モデルの両方で確認されています。
FUN中の神経活動モニタリングを通じて、FUNが特定の神経タイプに及ぼす影響を観察することにより、このプロセスの背後にあるメカニズムを掘り下げることができる18,19。遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)に基づく繊維測光は、in vivo 20,21,22,23,24の細胞型特異的な集団活動を追跡するための汎用性の高い方法として、過去10年間で広く利用されるようになりました。したがって、FUNとファイバー測光を同時に適用することで、FUNの包括的な理解を大幅に深めることができます。それにもかかわらず、かさばる単一のトランスデューサーの使用はフレームへの固定を必要とするが、動物は麻酔を受け、定位固定装置フレーム7,19,25,26に固定される必要がある。このアプローチは、知覚、認知、行動評価に関連する特定の種類の実験には適していない可能性があります。マウスの動員を妨げることなく、FUNとファイバー測光の融合を容易にするプロトコルを確立することが重要である7。
この研究では、単一のトランスデューサの作成方法とマウスへの一時的な固定、およびトランスデューサ7,19,26のスムーズな通過を容易にするための光ファイバーインプラントの安全な固定をシームレスかつ優雅に補完するために、以前の研究で使用された洗練されたプロトコルを紹介します.これにより、研究者は、拘束されていないマウスの超音波によって調節された神経活動を記録することができます。私たちは、聴覚の交絡27を減らすために、正弦波エンベロープなどのより滑らかなエンベロープを選択しました。このプロトコルの実現可能性は、FUN中に自由行動マウスの視床前核における神経活動の同時記録によって確認されます。これは、トランスデューサーのエネルギーが神経調節を達成するのに十分であり、光ファイバーインプラントとトランスデューサーの固定方法がそれらの安定性を確保できることを実証しています。

<table><tbody><tr><td>1ml使い捨てシリンジ</td><td>DOUBLE-DOVE1ml</td><td></td><td>注射針</td></tr><tr><td>26ゲージ針</td><td>Jin mao</td><td>JM-J02</td>準備<td>針</td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>ドンデアルコール&nbsp;</td><td>0.7</td><td></td></tr><tr><td>アルコール</td>を消毒する <td>Dong de alcohol&nbsp;</td><td>0.75</td><td>トランスデューサー表面のバ</td></tr><tr><td>ヨネットナット</td><td>コネクターRisym</td><td>75-5</td>を清掃します接続<td>ワイヤーのもう一方の端は超音波励起装置銅</td></tr><tr><td>リング</td><td>に接続されていますGuowei金属材料</td><td>外径、壁厚さ、高さ(8mm、0.2mm、8mm)</td>トランスデューサーの<td></td></tr><tr><td>使い捨てシリンジ</td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>の外側保護ケースエポキシ樹脂の吸入は、銅パイプ</td></tr><tr><td>の両面テープ</td><td>3M</td><td>3M55236</td>に注入される正確な少量を可能にします <td>それはトランスデューサーとワイヤーを固定するために使用され、エポキシ銀接着剤が乾燥する前に動かないようにするために使用されます</td></tr><tr>電子<td>はんだごて</td><td>ビ</td><td>クター868A+</td><td>はんだ付けされたワイヤーはBNC</td></tr><tr><td>エポキシ樹脂接着剤</td><td>クラフト</td><td>K9741</td><td>に接続されていますトランスデューサ</td></tr>ー<tr><td>エポキシ銀ペースト</td><td>Vonroll</td><td>CB-052</td>の背面をシールします <td>ワイヤーは圧電セラミックシートの正極と負極に取り付けられ、抵抗は低く保たれています</td></tr><tr><td>フェーダー&nbsp;</td><td>JOQO</td><td>YP-7021</td>マウス<td></td></tr><tr><td>ガス麻酔器</td><td>RWD</td><td>R500</td>の頭の毛を取り除きますマウスガラスシート<td>の麻酔に使用されます</td></tr><tr><td></td><td>正方形のガラス</td><td>80mm * 80mm</td><td>圧電セラミックとワイヤーを配置するための一時的な操作面を使用して、ガラスプレートの表面を両面テープケ</td></tr><tr><td>タミン/キシラジンでコーティングできます&nbsp;</td><td>Shutai/shengxin</td><td>Zoletil 50/2ml*10</td><td>マウス</td></tr><tr><td>の医療用カップリング剤</td>を麻酔する <td>Bestman</td><td>120g</td><td>接触媒質は、超音波信号を伝導する媒体として機能します</td></tr><tr><td>マウス</td><td>Bai shi tong</td><td>GCaMp6</td><td>被験者</td></tr>眼<tr><td>科軟膏</td><td>Yun Zhi</td><td>0.5% x 2.5 g x1</td><td>失明を防ぐために目の領域を湿らせます</td></tr><tr><td>&nbsp;圧電プレート</td><td>Jiaming電子工場</td><td>直径、細孔、厚さ(7mm、3mm、3.56mm)</td><td>電気エネルギーは超音波</td></tr><tr><td>ポリプロピレンパイプ</td><td>Baihaoパイプ工場</td><td>外径、内径、長さ(3mm、2mm、500mm)</td><td>エポキシ樹脂が穴を塞ぎ、穴を離れるのを防ぎます</td></tr><tr><td>ポビドン-ヨウ素</td><td>lefeke</td><td>500ml</td><td>消毒</td></tr><tr><td>ファイバーの信号記録</td><td>Thinker Tech Nanjing Biotech</td><td>3色シングルチャンネル光ファイバー記録システム</td><td>記録ファイバー測光信号</td></tr><tr><td>定位固定フレーム</td><td>RWD</td><td>68805</td><td>マウスの頭を固定し、脳領域をローカライズします</td></tr><tr><td>無菌生理食塩水</td><td>Shijiazhuang si yao</td><td>500ML,4.5g</td><td>溶媒として、超音波の薬物刺激を溶解します</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ディープブレイン</td><td>テクノロジーDB-USNM</td>トランスデューサー<td>に安定した入力を提供します</td></tr><tr><td></td><td>秦伯市</td><td>1718</td><td>マウスワイヤーの重量を量</td></tr>る <tr><td></td><td>Jinpengケーブル</td><td>ファクトリー0.3mm2</td><td>Voltageはトランスデューサーに供給されます</td></tr></tbody></table>

自由移動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバー測光の同時記録

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

集束超音波ニューロモデュレーション(FUN)は、脳深部領域のニューロン回路の非侵襲的摂動に対する有望なアプローチです。これは、 in vivoで脳機能を監視するための既存のモダリティのほとんどと互換性があります。脳機能記録モダリティとの統合により、閉ループフィードバックで特定の脳機能の秩序と障害に対処できるだけでなく、FUN自体に関するメカニズムの洞察も得られます。ここでは、自由移動マウスでのFUNとファイバー測光GCaMP6s蛍光記録の同時適用のための、改良されたシンプルで信頼性が高く、堅牢なプロトコルを提供します。これには、適切なサイズの単一トランスデューサーの作製とマウスへの一時的な配置、およびトランスデューサーのスムーズな通過を容易にするための光ファイバーインプラントの安全な固定が含まれます。FUNとファイバー測光の組み合わせにより、脳深部領域におけるFUN時の神経回路応答を光学的に記録することができます。このプロトコルの効率性を実証するために、Thy1-GCaMP6sマウスを例として使用して、マウスが自由に動いている間のFUN中に視床前核の神経活動を記録しました。このプロトコルは、神経科学分野と生物医学超音波分野の両方でFUNの広範な使用を促進できると信じています。

マウスの視床前核の位置に対応する、トランスデューサー表面から3.4 mm離れたXY平面とXZ平面の自由音場の音圧分布を図2B、Cに示します。これらの測定値は、XYドメインとXZドメインのハイドロフォンスキャンによって取得されました。トランスデューサー表面から3.4 mm離れたXY平面とXZ平面の経頭蓋音場の音圧分布を図2D,Eに示します。測定された自由音圧は730 kPaであり、測定された経頭蓋音圧は500 kHzの中心周波数で580 kPaです。測定された頭蓋骨の厚さは平均して約0.2mmです。分散関係はほぼ線形であると仮定するため、頭蓋骨の減衰係数は19.98dB/cmMHzです。重量が約1.66gの軽量トランスデューサーにより、マウスは簡単に動くことができ、FUN下でのマウスの応答挙動とモーショントレイルの観察が容易になります。
光ファイバ信号はFUN(図4B、D)で記録され、エンベロープはそれぞれ正方形と正弦波です。実験には5匹の雄マウスを使用しました。正方形は300 ms持続し、連続正弦波は471 ms持続したため、2つの異なるFUNで合計エネルギーが同じであることを確認できます(図4A、C)。光ファイバー信号の増強は、神経活動の増加を示しています。FUNの下では神経応答が速く、トランスデューサーが十分なエネルギーと優れた集束能力を持っていることを示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig01.jpg"> 図1:トランスデューサーの製造工程。 これには、圧電シートをワイヤに接続し、それをパッケージ化することが含まれます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig02v2.jpg"> 図2:超音波探触子の超音波フィールド測定のセットアップと特性評価。 (A) 超音波フィールド測定のセットアップには、ハイドロフォン、モーターシステム、制御ソフトウェア、信号発生器、オシロスコープが含まれます。 (B、D) 自由音場および経頭蓋音場での超音波トランスデューサー測定の概略図と、横方向および縦方向の音場測定の結果。 (C、E) トランスデューサーの焦点位置における横方向の音場の図で、赤い線は-3 dB位置の音場を示しています。 (F、G) トランスデューサーのハイドロフォンによって測定された出力の波形図。赤い破線のボックス内の領域と青い破線のボックス内の領域は、それぞれ波形が安定した振幅に達するまでの期間と、最後のトランスデューサのリンギング周期を表しています。オレンジ色の破線のボックス内の領域は、pとして示されている圧力振幅の計算に使用される波形の安定した部分 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig02largev2.jpg" target="_blank">を表しています。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig03.jpg"> 図3:計算ソフトウェアと超音波パラメータ。(A) 自家製の超音波パラメータ計算インターフェース。MI、Isppa、Ispta を計算しました。インターフェースは https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation から取得できます。(B) 超音波圧力波形の概略図。正弦波パルスエンベロープと長方形のパルスエンベロープが使用されます。周期(T)は、動作周波数の1サイクルの持続時間を表します。単一の連続超音波処理として知られるパルスは、パルス持続時間(PD)と呼ばれる指定された期間持続します。通常、パルスはパルス列と呼ばれる順序で繰り返されます。パルス列内の2つの連続するパルス間の時間間隔は、パルス繰り返し間隔(PRI)と呼ばれ、パルス繰り返し周波数(PRF)の逆数として計算されます。パルス列と呼ばれるパルスのシーケンス全体には、パルス列の持続時間と呼ばれる特定の持続時間があります。インターバル時間とは、1 回の試行の期間を意味します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig04v2.jpg"> 図4:FUN中のファイバー測光の信号。(A、C) 正方形(B)と正弦波(D)で囲まれた超音波パラメータ。 (B、D) (A)と(C)のFUN中のファイバー測光信号。緑の影はFUNの持続時間です。実線は平均で、青と赤の濃淡は記録された信号の平均と標準偏差です。実験には5匹の雄マウスを使用しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig04largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルには、トランスデューサーの製造、パラメータレポート作成、外科的処置、および自由移動マウスでの同時集束超音波ニューロモデュレーションおよびファイバー測光記録の運用ワークフロー全体の信号記録が含まれます。

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

simultaneous-focused-ultrasound-neuromodulation-fiber-photometry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、繊維測光を使用して自由に動くマウスの神経活動を記録する方法を示します。この方法では、特定の脳領域のニューロンが遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを発現します。この脳領域に刺激を加え、刺激依存的な蛍光の変化を測定して神経活動を特定します。...

繊維測光法による自由自在に動くマウスの神経活動の記録

出典: Maruoka, H., et.al. 覚醒マウスにおけるミクログリアダイナミクスとニューロン活動の同時イメージング J. Vis. Exp.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

このプロトコルでは、マルチファイバーフォトメトリー記録の実装と実行方法、カルシウムに依存しないアーティファクトの修正方法、およびデュアルカラーフォトメトリイメージングに関する重要な考慮事項について詳しく説明します。...

自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー

このプロトコルは、機能的超音波(fUS)を用いたマウス脳における容積脳血力学的変動の定量化を記述する。感覚刺激に続く3D機能活性化マップの手順と安静状態機能接続性は、麻酔および覚醒マウスにおける例示例として提供される。...

経頭蓋機能超音波画像を用いたマウスにおける脳全体3D活性化と機能結合性マッピング

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

全光学的アプローチを使用して、虚血性脳卒中を誘発すると同時に、覚醒して行動しているマウスの新たな脳卒中コアで蛍光バイオセンサーを使用してニューロンのCa2+...

行動マウスの虚血性脳卒中を誘発および監視するための同時光血栓症とファイバー測光法

このプロトコルは、複数の記憶関連脳領域にまたがるニューロンおよびアストロサイトからのカルシウム信号を同時に記録する方法を包括的に説明し、学習および記憶行動のパラダイムにおける応用を示しています。...

学習および記憶行動中の複数の脳領域にわたるアストロサイト-ニューロン活動を記録するための二色ファイバーフォトメトリー法

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

この新しい方法は、単一の成体マウスの運動ニューロンとその筋線維による力の測定を同時に細胞内記録を可能にします。正常および遺伝子改変動物における運動単位の電気的および機械的特性の組み合わせ調査は、神経筋システムの研究のための画期的な製品です。...

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。...

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

学ぶ 自由移動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバー測光の同時記録手法。カルシウムダイナミクスをリアルタイムで測定し、脳機能と神経活動の調節メカニズムを解明する。

自由移動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバー測光の同時記録

さらに動画を探す