偽層状肺気道上皮の毛様体機能と膜不透過性の決定

私たちの研究は、気液界面で正常なヒト気管支上皮細胞を分化させることによって得られる、偽層状気道上皮の2つの重要な生物物理学的特性を測定することを目的としています。偽層化気道上皮を用いて、異なる呼吸器系ウイルスの異なる特徴を同定した。例えば、細気管支炎の非標準的なメカニズムである呼吸器合胞体ウイルスによる細胞骨格系炎症。

また、杯細胞の過形成は、慢性閉塞性肺疾患の気道上皮におけるSARS-CoV-2の複製を増加させることを同定しました。私たちは、RSV感染やウイルス誘発性細気管支炎に対抗するための新しい治療標的を特定するために、呼吸器合胞体ウイルスによる細胞骨格シグナル伝達の調節のメカニズムを解明することに焦点を当てました。まず、正常なヒト気管支上皮細胞(NHBE)細胞懸濁液を服用します。

P200ピペットを使用して、200マイクロリットルの完全気道上皮細胞(AEC)培地に50, 000個の再懸濁細胞をインサートの頂端側に加えます。85%から95%の加湿二酸化炭素細胞培養インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートします。細胞がコンフルエントになったら、滅菌鉗子を使用してインサートを空のウェルに移します。

P1000ピペットを使用して、すべての基礎AEC培地を吸引します。次に、2%ペニシリン-ストレプトマイシンと1%アムホテリシンBを添加した500マイクロリットルの新鮮な完全ALI分化培地を基礎ウェルに加えます。滅菌鉗子を使用して、完全なALI培地を添加したインサートを基礎ウェルに移します。

P200ピペットを使用して、頂端AEC培地をウェルから穏やかに吸引し、インキュベートします。48時間後、滅菌鉗子でインサートを空のウェルに移します。P1000ピペットを使用して、古い培地を吸引し、500マイクロリットルの新鮮な完全なALI培地を追加します。

滅菌鉗子を使用して、新鮮な培地でインサートをウェルに戻します。26日目に、P200ピペットを使用して、インサートの頂端側に100マイクロリットルのDPBSを追加します。加湿細胞培養インキュベーターで摂氏37度で30分間インキュベートします。

次に、P200ピペットを使用してDPBSを吸引します。まず、顕微鏡、付属のコンピューター、および環境チャンバーの電源を入れます。チャンバーのドアを開き、NBHE細胞のインサートが入ったプレートを顕微鏡ステージに置きます。

プレートがステージに上がったら、チャンバーを閉じます。次に、顕微鏡ステージの操作ノブを使用してプレートを動かし、インサートを視界に浮かべます。コンピューター画面で、SAVAシステムアイコンをクリックしてSAVAプログラムを開きます。

ソフトウェアインターフェースで、[Configure Experiment] をクリックします。次のタブで、[実験の作成] をクリックします。次に、新しいタブで、データが保存されるディレクトリを [Enter Experiment Directory Name] フィールドに入力し、[Enter Experiment Description] フィールドに詳細を入力して、[OK] をクリックします。次に、作成され、ディレクトリの [実験] セクションに表示されている実験をクリックします。

その後、[Modify] をクリックし、[Sample Description] フィールドにサンプルの詳細を入力します。「追加」をクリックし、「終了」をクリックしてタブを終了します。メイン ソフトウェア インターフェイスで、実験スロットのドロップダウン メニューから作成した実験を選択します。

次に、[ビデオの録画]をクリックして、コンピューター画面上の毛様体心拍の周波数を監視します。画面には焦点が合った毛様体の動きが表示されます。挿入ごとに、6 つの異なるランダム フィールドを 120 フレーム/秒で 2.1 秒間記録します。

[ビデオの保存]をクリックして、毛様体ビート周波数データを監視します。データを分析するには、ソフトウェアインターフェースの「ビデオの分析」をクリックします。次に、タブで[OK]をクリックします。次に、次のタブに移動し、[すべて分析]をクリックします。

各実験で生成されたスプレッドシートをコンピューターの SAVA Data Acquisition フォルダーにダウンロードします。データ表示のガウス平均度数を取ります。毛様体拍動の頻度は、健康な成人とCOPD患者の気道上皮の両方で少なくとも3ヘルツに達し、同等の毛様体機能を示しました。

まず、電源スイッチを使用してEVOM2ボルト抵抗計の電源を入れます。テスト抵抗を入力スロットのEVOM2に接続します。EVOM2画面で読み取りを監視します。

読み取り値が 1 、 000 より上または下にある場合は、鉗子を使用して EVOM2 の ADJ スイッチを回し、均一な 1 、 000 の読み取り値が表示されるまでデバイスを校正します。次に、実験的なコントロールの読み取りのために空のインサートを取ります。P200ピペットを使用して、空のインサートの頂端側に100マイクロリットルのDPBSを追加します。

次に、P1000ピペットで基底面に500マイクロリットルのDPBSを追加します。その後、テスト抵抗を取り外し、STX2電極をEVOM2の入力スロットに接続します。次に、STX2電極を70%エタノールで静かに洗浄します。

STX2電極をDPBS付きの空のインサートに挿入し、短い方の電極脚を頂端部に、長い方の電極脚を基部に保ちます。次に、EVOM2画面に安定した読み取りを記録します。次に、P200ピペットを使用して、インサートの頂端側に100マイクロリットルのDPBSを追加します。

先に示したように、STX2電極を26日間の分化気道上皮のあるインサートに挿入します。次に、EVOM2画面に安定した読み取りを記録します。経上皮電気抵抗値はCOPDの成人で増加し、COPDの膜不透過性が高まっていることを示しています。