Name: 中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるDNA切断の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学ぼう、中性コメットアッセイを用いて分裂中のヒト細胞におけるDNA切断を検出する方法を。SNF2Lの役割とゲノム安定性のメカニズムを解明し、がん治療への応用可能性を探る。

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Dungrawala研究室のメンバーの意見とフィードバックに感謝します。この研究は、NIH の HD 助成金R35GM137800によって資金提供されました。

このプロトコル(図1)は、主に接着性U2OSがん細胞株を利用しますが、組織培養で増殖したさまざまな接着細胞および浮遊細胞に適応できます。この試験で使用した溶液とバッファーを 表1に示します。使用した試薬や機器は 、材料表に記載されています。
1. 資料の準備
<ol><li>実験の日の前に、付属のボトルに低融点アガロース(PBS中の1%低融点アガロース)を入れたボトルを温水浴に5〜10分間入れて、アガロースが完全に溶けたことを確認します。 注意: 電子レンジでボトルを加熱しないでください。</li>
	<li>溶かしたら、必要に応じて100 μLのアガロースを1.5 mLの遠心チューブにすばやく分注し、チューブを4°Cで保存します。 固化したアガロースは、4°Cで最大1年間保存できます。</li>
	<li>実験当日は、必要な数の遠心分離チューブを4°Cの貯蔵庫から取り出します。チューブを42°Cのヒートブロックまたはウォーターバスに入れて、アガロースを溶かします。 注:細胞を回収する前にチューブを42°Cに置き、アガロースが完全に溶けて再懸濁することを確認します(ステップ3.7)。</li>
	<li>実験当日に新鮮な溶解バッファーとTAEバッファーを調製し、使用する準備ができるまでそれぞれ室温と4°Cで保存してください。さらに、15 mLのコニカルチューブに1x PBSを分注し、冷蔵庫に置いて再懸濁ステップ(ステップ3.5)で使用します。</li>
	<li>2ウェル彗星スライドのつや消し端にサンプル識別をマークし、使用する準備ができるまで室温で保管します。</li>
</ol>2. サンプルの調製
<ol><li>実験の日の前に、細胞を6ウェル皿に播種し、5%CO2を含む37°Cで一晩培養します。U2OS細胞については、各サンプルに対して約2〜3 x 105 個の細胞を播種しました。 注:セル番号は、分析に使用するセルタイプによっては調整が必要な場合があります。</li>
	<li>実験当日は、実験デザインに従った条件で細胞を治療してください。複製依存性切断誘導を実証するためのポジティブコントロールとして、細胞を1μM CPTで1時間処理する。CPTは、複製依存的に二本鎖切断を誘導するトポイソメラーゼ-1阻害剤である14。</li>
</ol>3. 細胞の再懸濁と溶解
<ol><li>細胞培養培地を吸引し、1x PBSで2回すすぎます。</li>
	<li>各ウェルに300 μLのトリプシンを加えます。皿を組織培養インキュベーターで2〜3分間インキュベートします。 注:トリプシンでの長時間のインキュベーションは、コメット分析中に偽の結果を生成する可能性があります。</li>
	<li>各ウェルに700 μLの細胞培養培地を加えます。穏やかに再懸濁し、サンプルを1.5 mLの遠心分離チューブに移します。 注:このステップで細胞をカウントすることは、ステップ3.6で適切な細胞密度を得るために推奨され、分析中に尾部が重なる頻度を減らします。</li>
	<li>細胞懸濁液を2400 x gで室温で5分間遠心分離します。</li>
	<li>培地を吸引し、細胞を1 mLの冷冷1x PBSに再懸濁します。</li>
	<li>ステップ3.4とステップ3.5を2回繰り返し、細胞密度2×105 細胞/mLで冷温1x PBSに細胞を再懸濁します。 注:このステップで細胞生存率を評価することは、十分な数の生存細胞が存在することを確認するために推奨されます。少なくとも90%の生存率が推奨されます。</li>
	<li>10 μLの細胞懸濁液を溶融アガロースの100 μLアリコートに再懸濁し、同じピペットチップを使用して穏やかに混合し、混合物をスライドの1ウェルに均等に広げます。必要に応じて、すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返します。 注:アガロースが固まるのを防ぐために、42°Cのウォーターバスからすべてのアリコートを一度に取り除かないでください。このステップは、好ましくはウォーターバスによって実行されるべきであり、各サンプルは再懸濁され、ずらして広げられます。エアポケットは電気泳動中の彗星尾部の移動に影響を与え(ステップ4.5)、乾燥ステップ(ステップ5.3)で亀裂が発生するため、スライド上にアガロースを広げるときに気泡を導入しないでください</li>
	<li>スライドを4°Cの暗所で15〜20分間保存し、アガロースが完全に固まったことを確認します(図2A)。</li>
	<li>スライドをCoplinジャーに入れ、スライドを溶解バッファーに室温で1時間浸します。</li>
	<li>スライドを冷たいTAEバッファーで一度すすぎ、スライドを冷たいTAEバッファーに4°Cで30分間浸します。</li>
</ol>4. 電気泳動
<ol><li>電気泳動チャンバーを平らな面に設置し、装置の端にある4つのレベリングノブを使用してシステムを水平にします。電気泳動中に溶液を冷たく保つために、下部チャンバーにコールドパックを挿入します。</li>
	<li>約 ~850 mL の冷たい 1x TAE バッファーを装置に注ぎます。</li>
	<li>スライドを4°Cから取り出し、電気泳動トレイに適切な向きで置き、壊れたDNAの移行を可能にします。 注意: トレイには 2 ウェルスライドが 10 枚収納できます。サンプル数が少ない場合は、スライドをトレイの中央に置きます。奇数のスライドで作業する場合は、各ウェルが2枚のスライドを収容できるように空白のスライドを含めます。</li>
	<li>付属のスライドトレイオーバーレイをトレイの上にそっと置き、スライドを覆います。 注意: 装置を適切に動作させるには、TAEバッファーの体積をオーバーレイの底面より低くしてはならず、オーバーレイの上面を超えないようにする必要があります。</li>
	<li>ケーブルを接続した後、電源を21Vに設定し、電気泳動(1V / cm)を40分間行います。 注:電気泳動時間は、分析に使用する細胞の種類によっては調整が必要な場合があります。未処理のサンプルのロングテールは、実行時間が長すぎることを示しています。逆に、ポジティブコントロールサンプルの短いテールは、不十分なランタイムを反映している可能性があります。</li>
</ol>5. 染色
<ol><li>電気泳動終了後、スライドを装置から取り出し、DNA沈殿液に室温で30分間浸漬します。</li>
	<li>DNA沈殿溶液を廃棄し、スライドを70%エタノール溶液に室温で30分間浸します。</li>
	<li>70%エタノール溶液を廃棄します。スライドを取り出し、ハイブリダイゼーションオーブン(45°C)で暗所で30分間乾燥させます(図2B)。 注:スライドは、乾燥ステップのために暗く乾燥した場所に一晩置いておくことができます。</li>
	<li>ウェルを100 μLの1x SYBR Green溶液と室温の暗所で30分間インキュベートします。</li>
	<li>スライドを傾けてSYBR Green溶液をデカントし、糸くずの出ないワイプでウェルの端を軽くたたいて余分なものを取り除きます。</li>
	<li>スライドを引き出しに入れ、30分間乾燥させます。</li>
	<li>スライドのイメージングを進めます。</li>
</ol>6. イメージングと解析
<ol><li>イメージングのために顕微鏡をセットアップします。 注:すべての画像は落射蛍光顕微鏡を使用して取得されました。10倍の倍率と0.45の開口数を使用し、露光時間は1/40秒、ゲインは+6dBでした。モノクロ8bitのキャプチャモードは、2×2ビニングとブラックバランス補正で活用しました。</li>
	<li>スライドを顕微鏡ステージに置き、FITCフィルターを使用してイメージングを開始します。 注:未処理のファイルを使用して、最初に曝露時間をテストします。ほとんどの細胞は、DNAがよりコンパクトであるため、彗星の尾を示さない。CPT処理した細胞をウェルに切り替え、同じ露光時間で画像化します。このサンプルでは、壊れたDNA末端の移動により、長さが長くなった彗星の尾が観察されます。</li>
	<li>サンプルごとに少なくとも 100 個の彗星の画像を取得し、3 回のテクニカルレプリケートで同じ露光時間を使用します。 注:カバースリップの端にある彗星の尾部は、不均一に移動し、サンプル分布の外れ値として機能する傾向があります。解析のために捕獲された彗星のほとんどは、カバーガラスの中心近くに存在します(図3)。</li>
	<li>画像をエクスポートし、彗星を手動で(Image Jを使用)または無料で入手できる彗星スコアリングソフトウェアを使用して、彗星をスコアリングします。個々に区別可能で、視野に完全に含まれている彗星がスコアリングのために選択されます。重なり合っている彗星や部分的に見える彗星は、さらなる分析では考慮されません(図4)。 注:ユーザーは、次のプラグインを使用して画像Jに彗星をスコアリングできます:https://cometbio.org/index.html。CometScoreソフトウェアを使用して彗星をスコアリングするための詳細は、図5に含まれています。</li>
	<li>解析から取得したテールモーメントを、10-90パーセンタイル値を示す箱ひげプロットとしてプロットします。正規性検定を実行して、パラメトリック検定とノンパラメトリック検定のどちらを統計分析に使用すべきかを判断します。 注:ほとんどの場合、ノンパラメトリック検定は、2つのサンプルのみを比較する場合はMann-Whitney検定を使用して、3つ以上のサンプルを比較する場合はDunnの多重比較を使用したKruskal-Wallis検定を使用して適用されます。</li>
</ol>

DNA複製中に発生するDNA切断の程度の調査 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

著者は、競合する利益を宣言しません。

このプロトコルは、活発な複製を受けているヒト細胞のDNA切断を評価するためのNCアッセイの概要を示しています。このプロトコールは比較的簡単に実施でき、研究者はアルカリ性分析のための高pH条件に容易に適応させることができます8。これには、ステップ 3.7 と 4.5 で説明されている 2 つの重要なステップが含まれています。ステップ3.7では、分析中に彗星が重ならないように、溶融したアガロースを細胞とともにウェル全体に均一に広げることが不可欠です。細胞をアガロースに再懸濁する前に、細胞凝集体が溶解していることを確認してください。アガロースを広げながらピペットチップが放出されるのを防ぐと、気泡の導入を最小限に抑えるのに役立ちます。電気泳動の条件は、イメージングと分析のための適切な彗星尾の移動を達成するために重要です。研究者は、尾部の移動の程度と彗星の尾を示す細胞の割合が細胞タイプによって異なるため、分析に使用する細胞株の性質を考慮する必要があります(図9)。したがって、実験の前に電気泳動の実行時間を経験的に決定することをお勧めします。
ポジティブコントロールサンプル(CPT処理細胞)でコメットテールが観察されない場合は、DNA損傷マーカーγH2AXの免疫染色などの代替アプローチを使用して、薬効を並行して確認する必要があります。広範なテールマイグレーションにより、ブレークインダクションの解析が妨げられる可能性があります。電気泳動時間を最小限に抑え、解析前に細胞の形態を評価することで、長すぎるコメットテールが得られるのを防ぐことができます。スライドの乾燥が不十分な場合、彗星の画像がぼやけたり、ぼやけたりすることがあります。コメットスライド上のアガロースが均一に乾燥し、平らになっていることを確認してから、1x SYBR溶液で染色してください。フォールド誘導の範囲が狭い場合、CPTで用量反応曲線を実行すると、実験目的に最適な作業範囲を決定するのに役立ちます。これらのトラブルシューティングのヒントを適用することで、これらのアッセイの結果を最大化することができます。
このアッセイ法は、Haloアッセイ29,30、TUNELアッセイ31、パルスフィールドゲル電気泳動32など、DNA切断誘導の研究に使用される他の技術と比較して、費用対効果が高く、高感度です。ただし、現在のアッセイ技術には一定の制限があります。DNA病変の正確な数は提供されませんが、損傷を受けていない細胞と比較したブレーク蓄積の相対的な推定値を提供します。さらに、細胞周期依存的な方法で発生するブレークインダクションを評価することはできません。細胞周期の進行の違いによるブレークインダクションの変化を排除するには、フローサイトメトリーによる細胞周期解析を並行して行う必要があります。

コメットアッセイは、シングルセルレベルでDNA切断を検出するために使用されるゲル電気泳動法です。これは、オープンエンドのDNA切断が電気泳動条件下で移動する一方で、無傷のDNAはほとんど静止したままであるという原理に依存しています。壊れたDNAが移動するのは、切断がスーパーコイル状のDNAの弛緩をもたらし、電気泳動チャンバー内のアノードに向かって徐々に空間的に再配置するためであり、その結果、免疫蛍光法によって観察される彗星のような外観になります1,2。次に、DNA損傷の程度は、コンパクトなDNAに対して移動した壊れたDNAの量を定量化することによって測定されます。
最も一般的に使用される2つのコメットアッセイ法は、アルカリコメット(AC)アッセイとニュートラルコメット(NC)アッセイです。ACアッセイは高アルカリ性pH溶液を使用して変性条件下で実施され、NCアッセイは中性pHの溶液で実施されます。NCアッセイとACアッセイはどちらも、核内で発生するDNA切断を確実に検出できます。しかし、アルカリ性バージョンは、アルカリに不安定なサイト3の検出にも有利である。どちらのアッセイ形式でも、電気泳動の前にDNAにタンパク質が含まれていないことを確認するために溶解条件を使用する必要があります。
このアッセイは、DNA切断を検出するための簡単な方法であり、細胞DNA損傷を決定するためのいくつかのユニークな利点を提供します。この分析法は比較的セットアップが簡単で、試薬はラボで調製するか、市販のベンダーから購入する必要があります。シングルセル分解能技術として、アッセイに必要な出発物質はほとんど必要ありません。特に、NCアッセイは高感度でブレークを測定でき、細胞あたり50〜10,000個のブレークを検出すると報告されています4。この手法の汎用性は、生態毒性学5、ヒトバイオモニタリング6、遺伝毒性試験7など、その幅広いアプリケーションによって実証されています。また、このアッセイは、さまざまな細胞タイプで信頼性を確保し、ハイスループットアッセイ8 や特定のゲノム領域での切断の評価9にも適合させることができます。したがって、このアッセイは、シングルセルレベルでのブレーク形成を調査するための迅速で信頼性の高い手法として機能します。
DNA複製のプロセスは、いくつかの内因性および外因性のストレッサー10,11によって絶えず挑戦されている。このような病変によるレプリソームの失速は、DNAの切断を引き起こし、ゲノムの不安定性を高める可能性があります。DNA切断は、DNA修復を容易にするための複製中間体としてもしばしば生じる12。さらに、いくつかの化学療法剤は、カンプトテシン(CPT)13,14,15やPARP阻害剤16,17など、複製依存性二本鎖切断(DSB)を誘導します。したがって、このアッセイは、DNA損傷の性質を研究し、複製フォークの処理を評価し、DNA損傷剤の治療可能性を調査するための強力な方法論として機能します。新たに合成されたDNAをBrdUで標識するアッセイの適応は、複製関連ストレス表現型18,19,20,21の研究に役立っています。特に、NCアッセイは、フォークタンパク質の特性評価22,23、複製中間体の分析24,25、およびゲノム維持における転写-複製競合の調査26,27を含む研究で実証されているように、複製の文脈でDNA切断誘導を研究するための信頼性の高い方法である.ここでは、ヒト細胞での複製中のDNA切断を定量化することを目的としたNCアッセイプロトコルの概要を説明します。このプロトコルは、分裂しているヒト細胞の多種多様な複製ストレス関連損傷の評価に関心のある研究者によって容易に実施できます。

<table><tbody><tr><td>1 x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Comet LMAgarose (LMA)</td><td>R&Dシステム</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>CometAssay 電気泳動システム II</td><td>R&Dシステム</td><td>4250-050-ES</td><td>電気泳動タンク、安全蓋、ケーブル、2/20ウェルスライドトレイ、スライドトレイオーバーレイを含む</td></tr><tr><td>CometScoreソフトウェア</td><td>TriTek</td><td></td><td>オープンソース</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R&Dシステム</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr>落<tr><td>射蛍光顕微鏡</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 - プレミアム</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>hTERT-RPE-1細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシ尿素</td><td>ミリポア Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>PARP阻害剤 オラパリブ</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>表面処理滅菌組織培養プレート</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain (10,000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>U2OS cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp;HB-1000ハイブリダイゼーションインキュベータ</td><td>ーFisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるdna切断の検出

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

DNA複製は、DNAを損傷する可能性のあるさまざまな内因性および外因性のストレッサーによって常に挑戦されています。ゲノム重複中に遭遇するこのような病変は、レプリソームを失速させ、複製フォークを二本鎖切断に変換する可能性があります。修復せずに放置すると、これらの有毒なDNA切断が染色体再配列を引き起こし、ゲノムの不安定性を高め、細胞形質転換の可能性を高める可能性があります。さらに、がん細胞は持続的な複製ストレスを示すため、腫瘍細胞の複製フォークの脆弱性を標的とすることは、化学療法の魅力的な戦略となっています。複製中のDNA切断を研究するための非常に汎用性が高く強力な手法は、コメットアッセイです。このゲル電気泳動技術は、シングルセルレベルでのDNA切断の誘導と修復を確実に検出します。ここでは、研究者が複数の細胞タイプにわたるフォークストール剤を使用してヒト細胞を有糸分裂する際のDNA損傷の程度を測定できるようにするプロトコルが概説されています。これを自動コメットスコアリングと組み合わせることで、迅速な分析が容易になり、DNA切断の誘導研究の信頼性が向上します。

レプリケーションストレス試薬によるブレークインダクションの解析 U2OS細胞をDMSO、4のmMヒドロキシ尿素(HU)、または100nMのCPTで4時間処理し、NCアッセイによりブレーク蓄積について分析しました(図6A)。CPTはトポイソメラーゼ-1を阻害することによりS期に切断を誘導するが13、HUによって誘発されるヌクレオチドプールの枯渇は、徐々にDSBに変換される複製フォークを失速させる28。データは、HUまたはCPTへの曝露がS期のブレーク誘導を引き起こすことを示しており、これはNCアッセイによって検出可能です。
異なる温度での溶解を比較したブレークインダクションの解析 未処理のU2OS細胞を、ブレークインダクションの分析に先立って、室温(RT)または4°Cで溶解バッファー中でインキュベートしました(図6B)。この結果は、溶解が行われる温度がアッセイ内のテールの移動に最小限の影響を与えることを示しています。
ヒドロキシ尿素(HU)によるブレークの時間解析 U2OS細胞は、未処理のまま放置するか、NCアッセイによるブレークインダクションの解析に先立って、4 mMのHUで4時間および8時間処理しました(図7)。この結果は、HU を使用したレプリケーション フォークのストールが長引くと、レプリケーション フォークが DSB に崩壊することを示しています。
カンプトテシンによるブレークの用量依存的解析 U2OS細胞をCPTの増量で1時間処理し、NCアッセイを使用してブレーク分析のために回収しました(図8)。CPTで処理されていない細胞ではブレークの蓄積が最小限に抑えられますが、CPTの投与量が増えるとブレークインダクションの程度が徐々に増加するため、DNA複製中のブレークの蓄積に対する用量依存的な影響を研究する上でのアッセイの有用性が実証されています。
複数の細胞タイプにわたるブレークの比較解析 DNA切断の基礎レベルは、hTERT不死化網膜色素上皮細胞(hTERT-RPE-1)、サルウイルス40(SV40)、ヒト胚性腎臓細胞(HEK293T)、骨骨肉腫細胞(U2OS)を発現する大型T抗原の3つの異なる有糸分裂細胞タイプで評価されました(図9)。各細胞株は、細胞周期の分布、クロマチン組織化、または活性複製フォークの数の違いによるものと考えられますが、追加の複製ストレスがない場合、テールモーメントの異なる移動を示しました。また、各細胞タイプを1μMのCPTに1時間曝露し、複製依存性DNA切断の増加を検証しました。
ACアッセイによるブレークインダクションの解析 U2OS細胞をDMSO、4 mMのHU、1 μMのCPT、または10 μMのPARP阻害剤(PARPi)オラパリブで処理し、ブレーク誘導について分析しました(図10)。細胞をDMSO、HU、およびPARPiで2時間処理しましたが、CPT処理は1時間でした。その結果、複製ストレスへのばく露はブレーク蓄積を引き起こすことが示されており、これはACアッセイによって観察可能である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> 図1:NCアッセイの概略図(A)必要な数の細胞を前日に6ウェルディッシュに播種します。(B)薬物治療後、細胞はトリプシン化され、冷たいPBSで回収されます。(C)ピペットチップを使用して、細胞を溶融アガロースに10:1の比率(10μLの細胞懸濁液に対して10μLのアガロース)で穏やかに再懸濁します。(D)細胞懸濁液をピペットチップを使用してスライドウェルに移し、ウェル表面をアガロースで完全に覆うように均一に広げます。(E)4°Cでのインキュベーション後、スライドを溶解バッファーに浸漬し、続いて冷温1x TAEバッファーを浸漬します。(F)サンプルを適切な装置を使用して電気泳動します。(G)次いで、スライドをDNA沈殿溶液に浸漬し、続いて70%エタノール溶液を浸漬する。(H)乾燥後、ウェルを1x SYBR Green溶液で染色します。(I)スライドは落射蛍光顕微鏡を使用して画像化されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> 図2:コメットスライドウェル上のアガロースの側面図(A)4°Cでのインキュベーション(ステップ3.8)後、固化したアガロースは凸状の「泡」として現れます。(B)45°Cで乾燥させた後(ステップ5.3)、アガロースはウェル上で平らに見えます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> 図3:彗星のイメージングと分析。 (A)坑井の内側の円(青色で強調表示)内の彗星が分析のために選択されます。彗星は、尾部モーメントが異常に長いため除外され、外れ値としてマークされます。(B)青色の領域から代表彗星を100個以上ランダムに選別。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> 図4:NCアッセイから得られた彗星の代表画像。 右のパネルにはSYBR緑色に染色された原子核の代表的な視野が表示され、左のパネルには彗星のスコアリングに使用された領域(緑色の輪郭)が強調表示されています。部分的に見える原子核または互いに近接して積み重なっている原子核(赤い輪郭、右パネル)は、解析に含まれません。スコアリング用に選択された彗星は、個別に識別可能であり、視野内に完全に含まれており、均一な染色強度を示す必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> 図5:NCアッセイから得られた彗星の代表的なスコアリング (A)個々の核は、CometScoreソフトウェアを使用して概説されています。(B)フルスペクトラムビュー(左パネル)が有効になり、しきい値(カットオフバー)が調整されて、最小限のバックグラウンドで最適な信号強度が得られます。「フルスペクトル」信号は、「単一色相」画像(上の画像、右パネル)に対応し、アウトライン(下の画像、右パネル)を超えないようにする必要があります。(C)ボックス内の黄色の縦線は、彗星雲頭の最も幅の広い部分を一貫性の基準として使用して、彗星頭の中心に揃えられています。(D)分析された各彗星のスコアは、右上隅に報告されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> 図6:複製ストレス試薬によるブレークインダクションの解析 (A)U2OS細胞をDMSO、100 nMカンプトテシン(CPT)、または4 mMヒドロキシ尿素(HU)で処理した後、ブレークインダクション解析を行った。代表的なグラフは、CPTまたはHUで処理した細胞におけるブレーク蓄積の増加を示しています。(B)未処理のU2OS細胞をコメットスライド上に播種し、室温(RT)または4°Cで溶解のためにインキュベート(ステップ3.9)して、溶解温度の影響を比較しました。解析のテールモーメントは、10-90 パーセンタイル値を表す箱ひげ図としてプロットされ、中央値はボックス内の水平線で表されます。 p値は、Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較(カットオフ p値0.05)を使用して計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> 図7:ヒドロキシ尿素によって誘発されるブレークの時間的解析。 U2OS細胞は、未処理またはブレークインダクション解析の前に4時間または8時間4mM HUで処理しました。代表的なグラフは、HUで処理した細胞におけるブレーク蓄積の緩やかな増加を示しています。解析のテールモーメントは、10-90 パーセンタイル値を表す箱ひげ図としてプロットされ、中央値はボックス内の水平線で表されます。 p値は、Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較(カットオフ p値0.05)を使用して計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> 図8:カンプトテシンによって誘発されるブレークの用量依存的な分析。 U2OS 細胞を DMSO または高濃度の CPT(25 nM、100 nM、500 nM、および 1 μM)で 1 時間前に処理しました。解析のテールモーメントは、10-90 パーセンタイル値を表す箱ひげ図としてプロットされ、中央値はボックス内の水平線で表されます。代表的なグラフは、CPTによって誘発されるブレークの用量依存的な増加を示しています。 P値は、ダンの多重比較(カットオフ p値0.05)を伴うKruskal-Wallis検定を使用して計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> 図9:複数の細胞タイプにわたる切断の比較解析 hTERT-RPE-1、HEK293T、およびU2OS細胞をDMSOまたは1μM CPTで1時間処理しました。代表的なグラフは、CPTの存在下または非存在下での3つの細胞タイプにわたるDNA損傷の相対的な程度を示しています。分析からのテールモーメントは、10〜90パーセンタイルの値を示す箱ひげプロットとしてプロットされ、中央値はボックス内の水平線で表されます。 p値は、Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較(カットオフ p値0.05)を使用して計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> 図10:ACアッセイによるブレークインダクションの解析。 U2OS細胞は、ブレークインダクション解析の前に、DMSO、4 mM HU、1 μM CPT、または10 μM PARP阻害剤オラパリブで処理しました。細胞をDMSO、HU、およびPARP阻害剤で2時間処理しましたが、CPT処理は1時間でした。代表的なグラフは、CPT、HU、またはPARP阻害剤で処理された細胞におけるブレーク蓄積の増加を示しています。解析のテールモーメントは、10-90 パーセンタイル値を表す箱ひげ図としてプロットされ、中央値はボックス内の水平線で表されます。 p値は、Kruskal-Wallis検定とDunnの多重比較(カットオフ p値0.05)を使用して計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>試薬</td>
			<td>実用的な解決策</td>
		</tr><tr><td>溶解バッファー</td>
			<td>0.5% SDS、200 mM Tris-Cl (pH 7.4)、50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1 x TAEバッファ</td>
			<td>40 mM トリス塩基、20 mM 酢酸、1 mM EDTA (pH 8.45)</td>
		</tr><tr><td>DNA沈殿液</td>
			<td>1 M 酢酸アンモニウム、87% エタノール</td>
		</tr><tr><td>70%エタノール溶液</td>
			<td>蒸留水中の70%エタノール</td>
		</tr><tr><td>1x SYBRグリーンソリューション</td>
			<td>1x SYBR Green in 1x TAE buffer (1x TAE バッファー)</td>
		</tr><tr><td>DMEM培地</td>
			<td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

このプロトコルは、DNA複製中に発生するDNA損傷の程度を調査するように設計されています。中立条件下では、DNA切断の誘導を短時間で容易に評価できます。さらに、このプロトコルは、他の細胞タイプやさまざまな複製ストレス試薬にも適応可能です。

中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるDNA切断の検出

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

detection-of-dna-breaks-in-dividing-human-cells-by-neutral-comet-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオは、有害物質にさらされた後のDNA損傷を検出するための彗星アッセイを示しています。アルカリ性条件下では、DNAは巻き戻されて変性し、電気泳動では、損傷していないDNAと損傷したDNAがアガロースゲル内で異なる方法で移動し、彗星状の構造を形成します。ゆっくりと移動する損傷を受けていないDNAは円形の彗星の頭を形成し、急速に移動する損傷したDNA断片は細長い彗星の尾を形成します。...

細胞内のDNA損傷検出のためのCometアッセイ

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コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。...

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

コメット ・ アッセイは、単一および二重鎖 DNA を含む DNA 損傷の中断を検出する効率的な方法です。化学療法の治療効果を評価するためがん細胞における DNA...

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。...

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

ここでは、病変誘導後のDNA複製における一本鎖DNAギャップを調べるためのDNAファイバーアッセイの2つの改変について説明する。S1ファイバーアッセイは、ssDNA特異的S1エンドヌクレアーゼを使用して複製後ギャップの検出を可能にし、ギャップ充填アッセイはギャップ修復の視覚化および定量を可能にする。...

DNAファイバーアッセイを用いたヒト細胞における複製後ギャップの蓄積と修復の検出

コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。...

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

このプロトコルは、コメットアッセイの適用を通じて、FLT3変異細胞におけるI型およびII型阻害剤によって誘発されるDNA損傷の違いを定量化するための効果的な方法を説明しています。...

I型およびII型FLT3阻害剤への曝露後のFLT3変異体発現32D細胞におけるDNA損傷を定量化するためのコメットアッセイ

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

我々は、トポイソメラーゼのタンパク質を搭載した分子スケールデバイスのアセンブリとアプリケーションを示しています。構造は、その両端に二つの異なる蛍光色素を付加することにより組織切片におけるDNA切断の2つの主要なタイプを標識する生体分子センサーです。...

DNA損傷の検出のための半人工分子機械とその使用のin vitroでの組立に

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中性コメットアッセイによる分裂中のヒト細胞におけるDNA切断の検出

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