Name: タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぼう、eSPAN法を用いた酵母およびマウスES細胞における親ヒストンリサイクル機構の解析。DNA複製時のエピジェネティック情報継承と染色質動態の理解に貢献する革新的アプローチを解説します。

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この研究は国立衛生研究所(NIH)の助成金R35GM118015(Z.Z.)、R01GM130588(C.Y.)、ホーメルスタートアップファンド(C.Y.)によって支援されました。

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

著者たちは何も明かすことはありません。

先行および遅れ複製鎖に関連するタンパク質の検出は、クロマチン複製のメカニズムおよびそれに伴うプロセスを理解する上で重要であり、これらはヒトがん研究や薬剤耐性のメカニズムに直接関係しています。2Dゲル、ネイティブクロマチン免疫沈殿(nChIP)、iPOND、新生クロマチンキャプチャ29,30,31など、DNA複製やDNA修復などの関連プロセスの研究に用いられています。さらに、MINCE-Seq(EdUおよびシーケンスによる生体内新生クロマチンマッピング)32やCHOR-seq(複製後のクロマチン占有)33などの生前クロマチンマッピング手法も開発されており、DNA複製過程におけるヒストンやその他のクロマチン結合タンパク質の動態を研究しています。これらの手法はクロマチン複製の理解を大きく進めましたが、いずれも複製フォークの異なる...

真核生物では、ゲノム複製は複製起源と呼ばれる複数の部位から開始され、起源認識複合体(ORC)が結合し、CMGヘリカーゼを含むリクルートメントタンパク質機構を起動してDNA複製を開始します。各複製原点のリプリゾム機構は、双方向に移動する2つの複製フォークを形成します。双子複製フォークは、先導鎖の連続合成と遅れた鎖の不連続合成を通じて、DNAの2本の親鎖を複製します。各複製フォークの非対称性を考えると、先導鎖と遅延鎖のDNAポリメラーゼを含む複製成分は異なります。変異DNAポリメラーゼに基づく従来の遺伝解析では、DNAのPol εとDNAのPol δがそれぞれ先導鎖複製と遅れ鎖複製の主な役割を持つポリメラーゼであることが示されています。DNAポリメラーゼの鎖の好みを検出するために、Pu-seq 6,7、HydEn-seq8、emRiboSeqまたはRiboSeq 9,10など、いくつかの手法が開発されています。これらの鎖特異性を解析する遺伝学的手法はDNAポリメラーゼに限定され、各タンパク質4,5,11,12に変異を導入する必要があります。標的タンパク質とDNA複製フォークの先行鎖および遅れ鎖との関連を追跡することは、DNA複製に関する貴重な洞察を提供します。この取り組みの中で、まず酵母細胞におけるeSPAN技術(タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス、図1)を開発しました。原理証明研究として、まずPol δとPol δがそれぞれ先導鎖と遅れた鎖に濃縮していることを示しました。また、複製DNAヘリカーゼ、単鎖DNA結合タンパク質(複製タンパク質A)、増殖細胞核抗原(PCNA)ランプとそのローダー複製因子C(RFC)を含む主要なDNA複製成分の鎖の好みも明らかにしました13。重要なのは、私たちや他の研究者がこの手法を用いて、40年以上にわたり解決困難だった親ヒストン移動のメカニズムを明らかにしたことです(14,15,16,17)。
eSPAN法は、ChIP18またはCUT&Tag19による標的タンパク質の濃縮と、BrdU免疫沈殿によるタンパク質関連の新生DNAの濃縮の2つの連続工程から成り立っています。標準的な酵母株(W303またはS288C)では、細胞外のBrdUやEdUは細胞内に侵入し染色体に取り込まれることができません。これらの株は、チミジンを取り込むための適切なヌクレオシドトランスポーターや、チミジンをTMPにリン酸化するために必要なチミジンキナーゼを欠いており、TMPはBrdU(またはEdU)をBrdUMP(EdUMP)に変換します。ヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター1(hENT1)および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV-TK)の発現は、チミジンの取り込みを促進し、BrdU(またはEdU)からBrdUMP(EdUMP)への変換を促進します20。したがって、酵母でeSPAN実験を行うためには、株にBrdU-Incorporating (BrdU-Inc)構造(HSV-TKおよびhENT1)を挿入する必要がありました13,21。
以前は、酵母22のDNA複製タンパク質向けにeSPANプロトコルを提供しました。最近では、架橋、クロマチン剪断など最適化が必要な技術的に難しいステップに対応するため、哺乳類細胞のeSPANプロトコルにCUT&Tag法を統合し、開始細胞数17,23の最小化を図りました。ここでは、酵母細胞を用いた可視化のためのヒストンeSPAN(図2)を提供しました。この方法は主に、複製中のDNA鎖上における修飾されたヒストンの分布を解析するために用いられます。いくつかのヒストンマークをテストする際、例として親ヒストンH3のマークであるH3K4me3を例に挙げました。複製フォークでDNA修復に関与するレプリゾン成分や因子を解析するために、最初の論文22で説明したように、クロマチンを超音波処理を用いて小さな断片にせん断することを推奨します。哺乳類細胞では、酵母23で記述されたChIPステップを置き換える修正版Cut&Tag手順を採用しました。この修飾により、起始物質(細胞)の数が減り、最も重要なことに、単鎖DNA製剤キットを使わずにeSPANライブラリーのシーケンス生成が可能になります。酵母プロトコルでは、開始物質の量が十分だったため、Cut&Tag法は使用しませんでした。さらに重要なのは、Cut&Tagの手法が手の酵母細胞に対して一貫して効果的でないことが分かったことです。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA、pH 8.0</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL DNA低結合チューブおよびnbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>10倍アンプリガーゼバッファ</td><td>ルシゲン</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10倍PBS&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10倍TBS</td><td>バイオラッド</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1と1/2インチ。BD プレシジョングライドニードル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>ACCEL-NGS 1SプラスDNAライブラリキット</td><td>統合DNA技術</td><td>10009817</td><td>ssDNAおよび低入力DNAライブラリー準備キット&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent 2100バイオアナライザー&nbsp;</td><td>アジレント</td><td>2100バイオアナリシス</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000キット&nbsp;</td><td>アジレント</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>アンプリガーゼ&nbsp;</td><td>ルシゲン</td><td>A0110K</td><td>パラホルマルデヒドは可燃性で危険なので注意してください。</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>ベックマン</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>AMPureXP SPRI試薬</td><td>ベックマン・カウルター</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>抗BrdU抗体およびnbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>抗H3K4me3抗体&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>AB8580</td><td></td></tr><tr><td>自動セルカウンター&nbsp;、モデルTC10</td><td>バイオラッド</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>バシトラシン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>バクト・ペプトネ&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>ベンザミジン塩酸塩など;</td><td>シグマ</td><td>B2417</td><td>可燃性固形物</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>B5002</td><td>BrdUは潜在的な変異原や催奇形体となるため、慎重に扱ってください。</td></tr><tr><td>BSA</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>シグマ</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター&nbsp;</td><td>サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック&nbsp;モデル Forma シリーズII ウォータージャケット式CO2インキュベーター</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養培地および</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞株 ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td>1422842</td><td>200&ndash;400のドライメッシュサイズ</td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>コンカナバリンA(ConA)被覆磁性ビーズ&nbsp;</td><td>ポリサイエンス</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>デジトニン</td><td>ミリポール</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌とnbsp;tRNA&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP2818100</td><td>エタノールは可燃性なので注意してください</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP26324</td><td>イソプロポノールは慎重に扱ってください。可燃性です</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>ロッシュ</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>コー</td><td>シグマ</td><td>221473</td><td>KOHは腐食性なので注意してください</td></tr><tr><td>低速真空</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マグネットスタンド&nbsp;</td><td>ミリポール</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>マスターサイクラー勾配PCRサーマルサイクラー</td><td>エッペンドルフ</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>シグマ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>微小球菌ヌクレアーゼ&nbsp;(MNase)</td><td>ウォージントン</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR精製キット&nbsp;</td><td>キアゲン</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>ミニビーズビーダー</td><td>ミニビードビーター24ディスラプター</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機など;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>シグマ</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>マルチプラットフォームシェーカー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>マルチプラットフォームシェーカーインキュベーター</td><td>ベンチマーク</td><td>インキュシェイカー10L</td><td></td></tr><tr><td>マルチサーマルヒートブロック&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>サーモミキサーC</td><td></td></tr><tr><td>N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]-3-アミノプロパンスルホン酸&nbsp;(タック)</td><td>シグマ</td><td>T5130</td><td>200&ndash;400のドライメッシュサイズ</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S8045</td><td>NaOHは腐食性なので注意してください</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2&times;PCRマスターミックス</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 イゲパル CA-630</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>J61055。AP</td><td></td></tr><tr><td>パラフォーマルドハイド</td><td>シグマ</td><td>158127</td><td>パラホルマルデヒドは可燃性で危険なので注意してください。</td></tr><tr><td>pA-Tn5酵素&nbsp;</td><td>アッドジーネ</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>ペファブロック</td><td>シグマ</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>フェノールクロロホルムイソアミルアルコールおよびnbsp;</td><td>インビトロジェン</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>ピペット P1000、P200、P20、P2</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>シグマ</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤</td><td>シグマ</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質G-セファロースビーズ&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質沈殿溶液</td><td>キアゲン</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質沈殿溶液</td><td>キアゲン</td><td>848023</td><td>KOHは腐食性なので注意してください</td></tr><tr><td>タンパク質沈殿溶液およびnbsp;</td><td>キアゲン</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquickのPCR精製キット&nbsp;</td><td>キアゲン</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>シグマ</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計および</td><td>サーモ・サイエンティフィック。</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Pol</td><td>ニューイングランド・バイオラボ、nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・カウルター</td><td>アレグラX-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質関連新生dna法の濃縮およびシーケンスによる複製dna鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

ゲノム複製は、ヘリカーゼを含むレプリソームタンパク質によって操られ、二本鎖DNAを独立した反平行の一本鎖に展開させ、それぞれに異なる複製モード(連続的(誘導型)と不連続型(遅延)が必要です。クロマチン関連タンパク質と複製DNA鎖の相互作用を理解することは、クロマチンの組み立てとDNA修復のメカニズムを解明し、DNA複製と関連しています。本プロトコルは、複製フォークにおける新生生DNA鎖の先導および遅れのDNA鎖における相対的なタンパク質レベルを定量するために設計された、タンパク質関連新生DNAの濃縮および配列決定(eSPAN)法を提示します。eSPAN手順は、対象タンパク質のクロマチン免疫沈降(ChIP、酵母において)または標的およびタグメント下での切断(CUT&Tag;哺乳類細胞では)から始まり、その後ブロモデオキシウリジン(BrdU)免疫沈殿によるタンパク質関連の新生DNAの濃縮が行われます。鎖特異的次世代シーケンシングは、分離されたssDNAに適用されます。この技術は、タンパク質がリーディングまたはラギング複製フォークで濃縮されているかどうかを判定するために用いられます。eSPANは、複製フォークにおけるヒストンを含むクロマチン関連タンパク質のゲノム全体鎖優先性を提供します。

eSPANは、ヒストンやヒストン修飾など、標的タンパク質に関する鎖特異的情報を取得するために利用できます。この代表的な結果では、図2の示された図式に従って出芽酵母システムを用いてサンプル採取およびeSPANプロセスが実施されました。サンプル処理および採取は、このプロトコルと同様にヒドロキシウレア処理された初期S期の状態に従っています。2つの酵母株、野生型(WT)とmcm2-3A変異株が用いられました。DNAヘリカーゼサブユニットMCM2は親ヒストンのH3-H4シャペロンとして働きますが、3つのアミノ酸変異を含むmcm2-3A変異体は親ヒストンのH3-H4に結合する能力を持ちません。図3Aは一定の長さの倍数のDNA断片を示し、バイオアナライザーで解析したクロマチンヌクレオソームラダーパターンを示し、準備されたシーケンスライブラリーを用いています。通常、eSPANライブラ...

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、バクテリオファージの複製システムのタンパク質によって媒介個々のDNA分子のリアルタイムレプリケーションを観察するための方法を説明します。...

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

NGSシーケンシングのためのgDNA濃縮は、体質的突然変異の研究のための簡単で強力なツールです。この記事では、DNA損傷修復に関与する11個の遺伝子の完全な配列を簡単に解析する手順を紹介します。...

の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント BRCA1 BRCA2、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9

このプロトコルでは、新しく合成された、または新生DNAに関連するタンパク質とヒストン修飾を調べるための新しいBrdU-ChIP-Slot-Western技術について説明します。...

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

ここでは、大腸菌の複製フォークを失速させ崩壊させるための、部位特異的で可逆的なin...

サイトを誘導する具体的なレプリケーション閉塞中<i&gt; E。大腸菌</i&gt;蛍光プレッサーオペレータシステムの使用

フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット...

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

非標識、ラジオ-同位体 DNA ポリメラーゼの校正と DNA 修復アッセイ法は高分解能 MALDI-TOF 質量分析法および単一のヌクレオチドの拡張戦略を使用して開発されました。アッセイは、非常に特定、簡単、迅速かつ簡単に校正を実行し、修復するパッチ...

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

タンパク質結合マイクロアレイ(PBM)実験は、生化学的アッセイと組み合わせることで、テンプレートDNA上でRNAプライマーを合成する酵素であるDNAプリマーゼの結合および触媒特性を連結します。この方法は、ハイスループットプリマゼプロファイリング(HTPP)として指定され、様々な酵素のDNA結合パターンを明らかにするために使用することができる。...

ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

ATP依存クロマチンリモデラーとDNAリガンドとの相互作用は、CD分光法を用いて説明されている。生成されたピークによって分析された遺伝子プロモーター上の誘導された立体構造変化を使用して、転写調節のメカニズムを理解することができる。...

DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法

この記事では、6X-ヒスチジンタグで標識されたヒト組換えタンパク質であるフラップエンドヌクレアーゼ1(FEN1)のアフィニティー精製の手順について説明します。このプロトコルでは、タグ付きタンパク質の精製に2つの異なる固定化金属イオンカラムを使用します。...

Fast Protein Liquid Chromatographyシステムを用いた6X-Hisタグ付きタンパク質のアフィニティー精製(英語) 

ここでは、2次元ゲル電気泳動を使用して、病原性の構造が取りやすいリピートによる複製進行を解析する手順について概説します。...

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

学ぼう、eSPAN法を用いた酵母およびマウスES細胞における親ヒストンリサイクル機構の解析。DNA複製時のエピジェネティック情報継承と染色質動態の理解に貢献する革新的アプローチを解説します。

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

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