Name: ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶヒト赤血球生成の効率評価法。CD34+造血幹細胞を用いたin vitroおよびex vivoの分化パイプラインにより、骨髄異形成症候群における貧血治療への応用可能性を探索する。

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<meta charset="utf8"></head><body>臍帯血および骨髄からのHSPCを使用した赤血球生成のモデリング

<ol><li>Sender, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cellular+turnover+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The distribution of cellular turnover in the human body.</a> Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).</li>
<li>Cazzola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+and+its+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis and its treatment.</a> Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).</li>
<li>Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathological+consequences+of+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">The pathological consequences of anaemia.</a> Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).</li>
<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+anemia+and+its+underlying+causes+in+204+countries+and+territories%2C+1990-2019%3A+results+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).</li>
<li>Bondu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+erythroferrone+disrupts+iron+homeostasis+in+SF3B1-mutated+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome.</a> Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).</li>
<li>Elvarsdottir, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+model+of+erythropoiesis+recapitulates+erythroid+failure+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).</li>
<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-leucine+in+5q-+syndrome+and+other+RPS14-deficient+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts.</a> Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).</li>
<li>Clough, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+missplicing+of+TMEM14C+and+ABCB7+causes+ring+sideroblast+formation+in+SF3B1-mutant+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).</li>
<li>Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71%28high%29+population+represents+primitive+erythroblasts+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).</li>
<li>Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow%3A+I.+Normal+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development.</a> Blood. 69 (1), 255-263 (1987).</li>
<li>Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71+%28transferrin+receptor%29%3A+an+effective+marker+for+erythroid+precursors+in+bone+marrow+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens.</a> Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).</li>
<li>Berastegui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+DDIT3+is+a+potential+driver+of+dyserythropoiesis+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).</li>
<li>Mian, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+B5+and+succinyl-CoA+improve+ineffective+erythropoiesis+in+SF3B1-mutated+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia.</a> Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).</li>
<li>Armes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+ERCC+excision+repair+6+like+2+%28ERCC6L2%29+mutations+lead+to+impaired+erythropoiesis+and+reshaping+of+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment.</a> Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).</li>
<li>Hug, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+the+RNA+helicase+DHX34+in+NMD+and+pre-mRNA+splicing+and+its+function+in+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.</a> RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x HEPES</td><td>Merck</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>ビーズ</td><td>Thermo Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>CD235a APC Cy7</td><td>Biolegend</td><td>349115</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP Cy5.5 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td></td></tr><tr><td>CD71 PE 抗体</td><td>Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAPI Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Merck</td><td>D4527-200KU</td><td></td></tr><tr><td>DPX封入剤&nbsp;</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria フュージョン&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>メルク</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>ギムサ溶液</td><td>Abcam</td><td>ab150670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>メルク</td><td>H0887-100mL</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EPO</td><td>PeproTech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>ヒト Flt-3 リガンド</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>ヒト G-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>ヒト IGF1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>ヒト IL-6</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>ヒト SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>ヒト TPO</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-18</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwaldソリューション&nbsp;</td><td>Generon</td><td>26250-01</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250 ハイスループットスキャナー&nbsp;</td><td>3DHISTECH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>幹細胞培地 培地</td><td>幹細胞技術</td><td>9655</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

臍帯血または骨髄由来のCD34+細胞をまず解凍し、刺激し、GFP発現shRNAで形質導入します(図1A)。CD34+GFP+細胞は、図1Bに示すゲーティング戦略に従って、形質導入の4日後に選別されます。代表的な結果は、形質導入およびFACSソーティング後のCD34+細胞の成熟を示した。細胞は、(1)CD71/CD235a 9,10,11染色を用いて、成熟のさまざまな段階でフローサイトメトリーによって分析されます(図1A)。(2)顕微鏡で可視化したGemsa染色後の免疫化学による。
赤血球の分化は、CD71とCD235aの連続的な獲得に...

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

a-comprehensive-pipeline-to-assess-efficiency-human-erythropoiesis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。...

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

造血のための3D培養系は、ヒト臍帯血および白血病骨髄細胞を用いて記述されています。方法は、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた多孔質のポリウレタン合成足場の使用に基づいています。この足場は、細胞の広い範囲に対応するために適応可能である。...

正常と異常ヒト造血のex vivoでの擬態

この議定書は、赤芽球摘出プロセスの可視化を提供し、フローサイトメトリーマルチスペクトルイメージングフローによりオルソ赤芽球を除核の集団を同定する新規な方法を説明します。...

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

私たちは、端末赤血球生成の初期および後期段階を解剖インビトロマウス胎児肝臓赤芽球培養系を提示。このシステムは、異なる発生段階における特定の遺伝子の機能解析を容易にします。...

マウス胎児肝臓培養システムは、ターミナル赤血球の初期および後期段階での標的遺伝子の機能を分析する

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。...

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

赤血球赤血球変形能と細胞の不均一性を測定する技術をご紹介します。これらのテクニックは、赤血球変形能の一般的な調査および鎌状細胞貧血症などの循環の両方の剛性と変形赤血球の存在によって特徴づけられる血液の疾患の特定の調査に適用されます。...

変形能と赤血球による血液中赤血球の不均一性を測定

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。...

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。...

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

このプロトコルは、患者の骨髄および末梢血単核細胞から由来するヒト造血幹細胞および前駆細胞の分化誘導手順を概説しています。このアッセイは半固体培養培地を用いて赤血球および骨髄系譜のコミットメントを支持し、前臨床薬物特性評価のための再現性コロニー分類の標準化された指標を取り入れています。...

患者由来の骨髄および末梢血単核細胞に適応したコロニー形成ユニットアッセイ

学ぶヒト赤血球生成の効率評価法。CD34+造血幹細胞を用いたin vitroおよびex vivoの分化パイプラインにより、骨髄異形成症候群における貧血治療への応用可能性を探索する。

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

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