低DNA断片化指数で高品質の精子を調製するためのU字型水平遊泳技術

[ナレーター]この研究は精子最適化の方法に焦点を当てており、UHS 技術が DNA 断片化指数の低い高品質の精子の調製に利点があるかどうかを判断することを目的としています。マイクロ流体技術は、DFIの低い高品質の精子の選択を最適化するために利用されています。UHS法の主な制限は、高品質の精子の自己遊泳能力への依存度が高いことです。UHS法は、精子が完全に動かない患者には適していません。チグモタキシスは精子の分離に重要な役割を果たします。U字型の軌道は境界が長いため、高品質の精子の自由な動きが容易になり、動かない精子、不純物、その他の成分から完全に分離できます。DGC法と比較して、UHSレーン法は検査室職員の手作業が少なく、UHSレーン法で得られた高品質の精子は遠心分離手順を繰り返し経ないため、DFIが低くなります。まず、20マイクロリットルの施肥培地を手術皿に加え、U字型のトラックを作成します。ピペットで10マイクロリットルの施肥培地を吸引し、U字型トラックの左側の始点に円形の液滴を作成します。施肥培地を使用して、U字型トラックの左中央部分に沿って間隔をあけて、それぞれ10マイクロリットルの2つの緩衝液滴を作成します。すべての液滴を施肥培地で接続して、連続したトラックを形成します。2.5 マイクロリットルのポリビニル ピロリドン (PVP) を使用して、U 字型トラックの右側に液滴の長いストリップを作成します。PVPストリップの右側にある卵母細胞処理培地を使用して、6つのマイクロドロップレットを作成します。皿に培養油 7 ミリリットルを加え、油が液滴の最高点を完全に覆うようにします。皿を摂氏37度、二酸化炭素6%のインキュベーターに一晩入れて平衡化します。精液を採取した後、計量法を使用してその量を測定し、0.01ミリリットルの精度を確保します。精液サンプルを摂氏37度の環境に15〜30分間置き、広口径のプラスチック製使い捨てピペットに吸引します。精液が60分以内に液化しない場合は、同量の施肥培地を追加します。使い捨てプラスチックトランスファーピペットを使用して、混合物が完全に液化するまで繰り返し吸い込んだり吐いたりします。精液のpH値は、6〜10の範囲の精密pH試験紙を使用して測定します。10マイクロリットルの完全に液化した精液を取り、黄斑計数室に滴下します。光学顕微鏡を用いて200X磁場下で精子の運動性を評価する。ICSI操作皿のU字型トラックの左側の開始点にある受精培地の微小液滴に5マイクロリットルの精液を追加します。4倍対物レンズの下で卵母細胞保持針と注射針の角度と位置を調整します。セットアップを確認した後、選択した卵母細胞をICSI操作皿内の卵母細胞処理培地マイクロドロップレットに移します。卵母細胞を含む手術皿を、準備した顕微鏡オペレーターのホットステージに置きます。焦点を調整した後、注射針をICSI手術皿のPVPストリップに下げます。注射針をU字型トラックの右側にある長いストリップに移動し、高品質の精子を抽出します。精子を右側のPVPストリップに移し、精子を手術皿の底に置きます。精子尾の中央または下部の注射針をそっと押します。注射針を素早く引き戻し、精子を引っ掻いて固定します。次に、尻尾から頭に向かって精子を注射針に吸い込みます。卵母細胞の細胞質に精子をゆっくりと注入し、注入された卵母細胞をインキュベートします。1.5ミリリットルの45%密度勾配遠心分離溶液を15ミリリットルの滅菌円錐形底試験管に加えます。 そして、1.5 ミリリットルの 90% 密度勾配遠心分離溶液を 45% 勾配溶液の底にゆっくりと加えます。次に、液化精液を勾配遠心分離溶液に加え、チューブを室温で300Gで15分間回転させます。上清を除去した後、残りの精子沈殿物を約0.5ミリリットル集め、3ミリリットルの受精培地と混合します。混合物を室温で200 Gで5分間遠心分離します。上清を慎重にピペットで取り出し、約0.2ミリリットルの沈殿物を残し、振って混合して沈殿物を再懸濁させます。最後に、後で使用するためにサンプルを摂氏37度、二酸化炭素6%のインキュベーターに保管する前に、精子の濃度と運動性を数えます。25マイクロリットルの低融点アガロース溶液を含むチューブを摂氏90〜100度のウォーターバスに1〜2分間入れます。次に、温度が安定するまでチューブを摂氏37度のウォーターバスに5分間移します。3〜10マイクロリットルの精液を低融点アガロースチューブに加え、完全に混合します。30マイクロリットルの混合物を、水平位置で前処理されたスライドガラスに落とします。覆った後、前処理されたスライドガラスを摂氏2〜8度の冷蔵庫に4分間置き、水平位置に保たれるようにします。スライドを冷蔵庫から取り出し、カバーガラスをそっとスライドさせて外します。前処理されたスライドガラスを変性溶液に7分間すばやく浸します。スライドを取り外し、直立させます。次に、濾紙を使用して、試験片領域に触れずに余分な水滴を吸収します。スライドを蒸留水で5秒間洗浄します。スライドガラスを特定の期間の適切な溶液に連続的に浸漬します。次に、前処理されたスライドガラスを水平に保ち、約1ミリリットルの混合染料溶液をスライドに加えます。5分間染色した後、ステンドグラススライドを蒸留水で10〜15回優しくすすいでください。進行運動性の良い高品質の精子がU字型のトラックの端に沿ってスムーズに泳ぎ、細胞質内精子注入針が個別に掴みやすくなりました。どちらの方法でも良好な精子が得られましたが、密度勾配遠心分離法で分離した高品質の精子のDNA断片化指数は、U字型水平水泳法と比較して有意に高かった。