Name: マウスの痛みの研究における時間同期行動と脳ダイナミクスのための自動斜視法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学ぶマウスの自動斜視追跡法で、痛み反応と神経生理学的計測を時間同期させる技術です。片頭痛の神経回路基盤を解明し、リアルタイムの脳活動測定を可能にします。

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<meta charset="utf8"></head><body>DeepLabCut を使用した片頭痛の痛み追跡のためのマウスの眼の斜視のリアルタイム検出

<ol><li>Disease, G. B. D., Injury, I., Prevalence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+incidence%2C+prevalence%2C+and+years+lived+with+disability+for+354+diseases+and+injuries+for+195+countries+and+territories%2C+1990-2017%3A+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: A systematic analysis for the global burden of disease study 2017.</a> Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).</li>
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<li>Rea, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+squint+as+a+sensitive+assay+of+sex-dependent+calcitonin+gene-related+peptide+and+amylin-induced+pain+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Automated detection of squint as a sensitive assay of sex-dependent calcitonin gene-related peptide and amylin-induced pain in mice.</a> Pain. 163 (8), 1511-1519 (2022).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+neural+network+to+assess+spontaneous+pain+from+mouse+facial+expressions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">A deep neural network to assess spontaneous pain from mouse facial expressions.</a> Mol Pain. 14, 1744806918763658(2018).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>CUDA toolkit 11.8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cuDNN SDK 8.6.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intel コンピューター Windows 11、第 13 世代&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LabFaceX 2D Eyelid Tracker Free Roaming Mouse用アドオンモジュール:</td><td>FaceX LLC</td><td>NA</td><td>動物の目を記録できるカメラなら何でも十分ですが、これが当社のアイトラッキングハードウェアです。</td></tr><tr><td>バージョン 450.80.02 以降の</td><td></td><td></td><td></td>NVIDIA GPU ドライバー</tr><tr><td>NVIDIA RTX A5500、24 GB DDR6</td><td>NVIDIA</td><td>[490-BHXV]</td><td>DLC のバージョンに指定されている最小要件 (現在は 8 GB) を満たす GPU で十分です。NVIDIA GeForce RTX 3080 Ti GPU</td></tr>、<tr><td>Python 3.9-3.11</td><td></td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>TensorFlowバージョン2.10</td><td></td><td></td><td></td></tr>を使用しました</tbody></table>

マウスの痛みの研究における時間同期行動と脳ダイナミクスのための自動斜視法

An Automated Squint Method for Time-syncing Behavior and Brain Dynamics in Mouse Pain Studies

ここでは、DeepLabCutを使用して、高い時間分解能で斜視を確実に検出する方法を提供します。トレーニングパラメータを最適化し、この方法の長所と短所の評価を提供します(図1)。
モデルをトレーニングした後、ユークリッド距離測定の座標点として機能するまぶたの上部と下部の点(図2)を正しく推定できることを確認しました。ユークリッド距離は、目の上点と下点の 2 つの点の間の距離の平均の長さとして定義されます。私たちのモデルは、非斜視(図2A)と斜視(図2B)のインスタンスを検出することができました。青い点は、各フレームのユークリッド距離を決定するために使用される点を示しています。緑、黄、オレンジ、紫の点は、モデルがユークリッド距離を正しく推定し、頭が最適でない位置にあるとき (つまり、頭の動きとセッション間での位置の変化を考慮した) の尤度値を減らすために使用されました。次に、さまざまな方法を使用してモデルの精度を検証しました。
モデルに使用した理想的なフレーム数を検証するために、サンプルフレームサイズの異なる4つのモデルをトレーニングしてテストしました(図3)。まず、テストデータとトレーニングデータの間で二乗平均平方根誤差(RMSE)の値を比較し、モデルがトレーニングされていないテストデータを正確に予測できるかを検証しました。この比較により、手動でラベル付けされたポイントとモデルでラベル付けされたポイントの間の変動は、300フレーム後に横ばいになることが示されました。この傾向は、報告された尤度の平均と相関しており、これもラベル付きフレームが 300 個ある後に横ばいになったように見えました。これらの報告された尤度値を使用して、0.92未満のポイントをフィルタリングしました。これらの尤度値は、特定のポイントがトレーニング データに基づいて正しくラベル付けされたというモデルの信頼性を示します。これらの値をユークリッド距離メトリックに寄与するポイントについて平均化して、モデルが互いにどの程度うまく機能したかを調べました。300 フレームと 400 フレームの間に有意差はありませんでしたが、400 フレームを使用したのは、平均が 0.95 の尤度値を超えており、手動フィルタリングのしきい値に近く、姿勢推定の同様のモデルで使用されるしきい値と一致しているためです16。
モデルの精度を検証する別の方法は、手動で注釈が付けられたフレームとDLCラベルが付けられたフレームを比較する混同行列を使用することでした。盲目の2人の人物が、8つのビデオで同じ目の300フレームに手動で注釈を付けました。これらのデータを使用して、真陽性と偽陽性、および否定性を評価するための混同行列を構築しました(図4)、手動でスコアリングされたデータをグラウンドトゥルースとして使用しました。DLCでは、ユークリッド距離が75ピクセル未満(つまり、動物が斜視する)として記録された場合は正の斜視値が記録され、75ピクセルを超える値(つまり、動物が斜視しない)に対しては負の値が記録されました。96.96%の正の予測値が得られましたが、これは、手動で注釈が付けられた斜視と比較して、モデルが斜視を正確に予測する時間の割合です。99.66%の負の予測値を見つけましたが、これは、モデルが手動で注釈付けされた斜視と比較して斜視が正確に予測されない時間の割合です。これらは、正しくラベル付けされた負の値と正の値の割合を示しています。また、真陽性率が98.1%、真陰性率が99.46%であることもわかり、これらは、それぞれ正の値と負の値に対するモデルの正の値と負の値の正確な予測を表しています。マシューズ相関係数(MCC)は93.8%で、観測値と予測値の間の相関係数を示しています。
モデルが斜視を確実に追跡すると確信したため、このDLC法を、前臨床片頭痛データセット14を使用して以前に発表された斜視追跡法と比較しました。この他の方法は、連続変数測定斜視14として開眼領域を使用して開発されたため、「エリア斜視モデル(ASM)」と呼ぶ。エリア スクイント モデルは、学習済みの顔検出ソフトウェアとカスタム MATLAB スクリプトを組み合わせて、トラッキング エラー率が &gt;15% のフレームを除外しながら、目の平均ピクセル面積を解析します14。大きな制限の 1 つは、「ASM」がオープンソースではないため、広くアクセスできないことです。DLCは、ソフトウェアやハードウェアを大量に購入することなく、最適化と適応性を高めることができます。
10匹の女性と10匹の男性のCD1マウスのデータセットを使用しました。実験的に、すべての動物を、記録開始の3日前に合計30分間、穏やかな拘束具に順応させました。各動物は、ベースラインの 5 分間、その後治療の記録のために 5 分間記録されました。治療セッション中、動物はPBS(ビヒクル)または0.1 mg / kg CGRP(治療)のいずれかで腹腔内治療され、片頭痛様状態を誘発されました。.データは、赤外線を搭載したカメラを使用して顔を照らし、明るい部屋でデータを収集し、正確なランドマーク検出を確保しました。赤外線カメラには、焦点距離254mm、絞りを適切に調整したKowa LM35JC 2/3" 35 mm F1.6マニュアルアイリスCマウントレンズが含まれていました。データを収集した後、ASMとDLCを活用してデータを分析しました。手動採点は、顔のしかめっ面を定量化するために現場では従来から利用されており、顔のしかめっ面14の1つの要素である斜視も使用されていたため、データを手動で採点したデータと比較しました。
CGRPの末梢注射がマウスにおいて斜視反応を誘発するという以前の知見に基づき、我々は、ビヒクルとCGRP治療との間の斜視反応の有意差を観察すると予想した6,14。ASM、手動、DLCの方法を比較したところ、手動法とASM法と同様に、モデルが斜視表現型を確実に検出することがわかりました(図5)。ASMモデルは、CGRPによる痛みと斜視の評価に使用されたことに注意することが重要です。その研究では、Rea らは、「より伝統的な」疼痛誘発アッセイとして、CGRP 後の斜視反応と後足へのホルマリン注射後の斜視反応を比較しました14。さらに、CGRP は、フォン フレイ 3,17 を使用してマウスの触覚過敏症を誘発することが十分に文書化されています。フィールドと一致して、治療セッション中の平均斜視を各動物の治療前ベースライン5分に正規化し、PBS(n = 10)とCGRP処理(n = 11)動物を比較しました。PBS群とCGRP治療群の統計解析は以下の通りである。CGRP処理された動物は、エリアスクイント法の追跡法(p = 0.012、図5A)を使用して平均ピクセル面積が減少し、手動でスコアリング(p = 0.0007、図5B)し、DLCモデル(p = 0.007、図5C)を使用するとユークリッド距離が減少することがわかりました。各方法を1つの代表的な動物で経時的に比較したところ、同じパターンが観察されました(図5)。この動物は、CGRP治療に反応して非常に明確な斜視表現型を示しましたが、PBSには反応しませんでした。すべてのモデルでこれらの違いを検出できましたが、データはDLCモデルで最も明確に表現されていました(図5)。正確で正確なメトリクスは、平均化が完全な行動測定値(脳活動など)を示さないような、より細かい解像度でデータを分析する必要がある場合に特に重要です。マウスの斜視を検出するDLC法により、ミリ秒のタイムスケールでデータを収集し、ミリ秒のタイムスケールで発生する脳活動の測定値(局所電位など)にタイムロックすることができます。その後、この手法を利用して、片頭痛やその他の複雑な脳障害の文脈で自発的な痛みを示す脳状態のより堅牢なプロファイルを構築できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67136/67136fig01.jpg"> 図1:DLCを使用して学習済みネットワークを生成する手順の概要。 動物の目の特徴を追跡し、機械学習を使用して分析するプロセスの一般的な概略図。略語:DLC=DeepLabCut。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67136/67136fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67136/67136fig02.jpg"> 図2:代表的なCD1マウスにおける自動斜視追跡の例。 (A)マウスが目を細めていない治療日中に、目の輪郭にDLCトラッキング斜視(色付きの点)を示すフレームの例。(B)DLCモデルを使用した、治療当日の斜視の自動検出を示すフレームの例。ユークリッド距離は、目の上と下にある青い点であるBとCの間の平均距離を使用して測定されました。目の上と下にある青いドットのセットは、ユークリッド距離を追跡するときに使用されます。他のポイント (緑、黄、オレンジ、紫) は、モデルがユークリッド距離ポイントを推定し、データ収集後に最適でないヘッド位置を除外するために使用されるフレーミング ランドマークです。略語:DLC=DeepLabCut。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67136/67136fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67136/67136fig03.jpg"> 図3:モデルのトレーニングに使用されるフレーム数の正当化。 (A)二乗平均平方根誤差分析は、テストデータセットとトレーニングデータセットの予測値と観測値の間の平均距離を示します。トレーニング データ セットは、モデルのトレーニング時にサンプリングされたフレームを表し、テスト データ セットは、モデルが類似しているが異なるイメージをどの程度適切に識別できるかを検証するために使用される非トレーニング フレームを表します。5セットのトレーニングデータとテストデータを使用し、テストグループではRMSE値が約300フレームで横ばいになることがわかりました。(B)特定のポイントが正しくラベル付けされている可能性(平均+ SEM)。これにより、手動でラベル付けされた 400 個のフレームが理想的であることが示されました。これは、生データ セットの平均が 0.95 尤度を超え、RMSE スコアがトレーニング データの RMSE スコアに最も近いためです。これは、モデルがトレーニングされたポイントを厳密に近似すると同時に、高い確率でほとんどのフレームについてレポートできたことを意味します。略語:RMSE =二乗平均平方根誤差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67136/67136fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67136/67136fig04.jpg"> 図4:DLCスクイント測定の混同行列。 8つのビデオ(CGRP5つとPBS3つ)から300秒をサンプリングし、それらのポイントを手動でラベル付けした「はい」または「いいえ」の2値スコアと比較しました。予測値はDLCで特定された値として、実際の値は人間が手動で採点したものとして定量化しました。次に、これを手動でスコアリングしたデータと比較して、手動でスコアリングされた squint の yes または no に対して squint が正しく識別された頻度を確認しました。略語:DLC = DeepLabCut;CGRP = カルシトニン遺伝子関連ペプチド;PBS = リン酸緩衝生理食塩水;TP = 真陽性;FP = 誤検出;FN = 偽陰性。TN = 真陰性;PPV = 正の適中率;NPV = 負の予測値;TPR = 真陽性率;TNR = 真陰性率MCC = マシューの相関係数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67136/67136fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67136/67136fig05.jpg"> 図5:斜視を検出するための3つの異なるモデルにわたる斜視表現型。 上の 2 行には、斜視を検出するための 3 つの異なるモデルで、各条件 (PBS または CGRP) を持つ同じ代表的な動物が含まれています。一番下の行は、すべての動物の平均を反映しています。(A)CGRP処理マウスとPBS処理マウス(t(18)= 2.805、p = 0.012)では、以前に公開および検証された領域スクイントモデル14を使用してすべてのデータを処理した後、平均ピクセル面積(平均全体のピクセル面積/ベースライン)が減少しました。(B) 手動でスコアリングしたデータでも同様の応答が見られた (t(18) = 4.064, p = 0.0007)。(C)CGRP処理マウスは、DLCを全データ処理に利用した場合、PBS処理マウス(t(18)=3.040、p=0.007)に比べて、平均眼瞼間距離(治療ユークリッド距離/治療前ユークリッド距離、ベースライン)が減少した。N = 20(女性10人、男性10人)。エラーバーは平均±SEMを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67136/67136fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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