Name: C. elegansの受精および初期発生中のカルシウム過渡現象のin vivoでの可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 学ぶ CaFEレポーターを用いたC. elegansの受精および初期発生におけるカルシウム動態の可視化手法。遺伝子組み換えカルシウムインジケーターにより、卵母細胞の遅延カルシウム波と単細胞カルシウム過渡現象を観察し、発生生物学研究に有用なツールを示します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegansの初期発生期におけるカルシウムの追跡

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
<li>Johnston, W. L., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+in+the+C.+elegans+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition.</a> Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).</li>
<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
<li>Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+nuclear+%CE%B2-catenin+and+TCF+pattern+embryonic+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg;粉末はフレークよりも簡単に溶解します</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>アルコールランプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S13475</td><td>95% エタノール</td></tr>塩化<tr><td>アンモニウム (NH4Cl)</td> と併用 フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>アンピシリン</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>アムスコ 400 シリーズ小型蒸気滅菌器</td><td>ステリスヘルスケア</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>トンボ 200 スピニングディスク共焦点</td><td>オックスフォードインスツルメンツ アンドール</td><td>N/A</td><td>ライカ顕微鏡で使用</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド スーパーフロスト 細胞創生学 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-035-900</td><td>1パックあたり144</td></tr>スライド <tr><td>フラットノーズプライヤー、スムースジョー</td>ホーム<td>デポ</td><td></td><td>305530604 プライヤーが滑らかな顎であることを確認してください</td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;- d-1-チオガラクトピラノシド&nbsp;(IPTG)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP1755-10</td><td>10 g;ジオキサンフリー</td></tr><tr><td>ラボラトリーテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-901-10R</td><td>0.5インチテープは、顕微鏡スライドをテープで巻くために使用されます</td></tr><tr><td>レバミソール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム(MgSO4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12541016</td><td>1オンスパック</td></tr><tr><td>ニコン ECLIPSE Ti2 レーザー走査型 共焦点</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ニコン NIS Elements ソフトウェア</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td>共焦点</td></tr><tr><td>OP50 大腸菌</td><td>Caenorhabditis 遺伝学センター (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>プラチナワイヤー</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性カリウム (K2HPO4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AA1159436</td><td>500 g</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S271-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性七水和物 (Na2HPO4)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ペトリディッシュ (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 ペトリ皿/ケース</td></tr><tr><td>滅菌ペトリ皿 (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td></td><td>229665 500 ペトリ皿/ケース</td></tr><tr><td>ひずみ EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis 遺伝学センター (CGC)</td><td>EAG16</td><td>キム・ギスバート研究所によって作成されました</td></tr><tr><td>EAG25 株 spn-4p::jGCaMP7s::パイ-1U;ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>作成者: Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>作成者: Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p::his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>E. Preston によって作成 - Murray Lab</td></tr><tr><td>ひずみ OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>Audhya/Oegema によって作成 - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech ワーム ピック ハンドル</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>IBIサイエンティフィック</td><td>IB49160</td><td>500g</td></tr></tbody></table>

c. elegansの受精および初期発生中のカルシウム過渡現象のin vivoでの可視化

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

この原稿で概説したプロトコルを使用して、受精および胚形成におけるカルシウムシグナル伝達の動的パターンが C.エレガンスで観察されました。
CaFEレポーターを含む線虫の典型的な受精配列を 図2に示します。解析を容易にするために、CaFEレポーターとプレクストリンホモロジードメイン(PH-mCherry)導入遺伝子13を組み合わせたEAG28株を用いた。PH-mCherryマーカーは原形質膜に局在し、特に生殖腺アームの細胞境界の可視化を容易にします。EAG28株は、CaFEレポーターを含むEAG16株とOD70 PH-mCherryレポーター13株を交配することによって作成されました。 C.エレガンスでは、排卵と受精が同時に起こります。受精の時間0は、排卵細胞で蛍光シグナルが検出される最初のフレームと見なされます(図2)。精子融合部位では、卵母細胞の前縁が精子の貯蔵器官である精子7に入るとすぐに、明るい蛍光のバーストが起こります。排卵が完了する前に信号が表示されます。カルシウム波は二相性で、最初のバーストが急速に発生し、その後、入口から反対側の極に向かって蛍光の波が続きます。卵子全体が&lt;30秒で蛍光になります。
CaFEレポーターは1つのコピーにあるため、シグナルは他の導入遺伝子ほど明るくないことに注意してください。排卵期のZスタックタイムラプスは、スピニングディスク共焦点が利用可能で最適化されていない限り、推奨されません。Zスタック画像は、生殖腺の形態の3D変化をキャプチャするために、ムービーの前または後に取得できます。ここでの画像は共焦点顕微鏡で撮影されましたが、トランジェントは、共焦点よりも一般的で手頃な価格の広視野蛍光顕微鏡を使用しても観察されています。レーザースキャンコンフォカルを使用すると、フレームレートは約1fpsになります。回転するディスク共焦点を使用すると、フレームレートは10fps以上になります。CaFEレポーターのバックグラウンドシグナルは、生殖腺腕の成熟した卵子を照らすのに十分です。受精時には、通常、GFPシグナル強度の1.5〜2倍の増加が観察されます。
定量にはいくつかの代替方法があります。例えば、Oxford Instruments社(Andor Dragonflyスピニングディスク共焦点顕微鏡と同じ親会社)が開発した画像解析ソフトウェア「Imaris」は、各フレームのシグナルをトランジットする卵子のみから定量化する機能を備えており、ROIは大きくなりません。ただし、Imarisソフトウェアは無料ではありません。また、卵子のカルシウム波を測定するための詳細な画像解析戦略は、高山、藤田、大波によって非常に詳細に説明されており、自由に利用可能なImageJを使用しています14。あるいは、単一の卵子を横切る蛍光シグナルの波を示すためのキモグラフは、ここで述べるよりも広範な画像操作を必要とするが、高山と大波3で説明されている。
C.エレガンスの明確な利点は、dsRNAを発現する細菌を内因性RNAi15,16をトリガーする細菌をワームに供給することにより、ほぼすべての遺伝子の発現をノックダウンする能力です。最適なdsRNA発現のために、RNAiプレートと飽和RNAi培養物の両方にIPTGが含まれています。dsRNAは、目的の遺伝子を隣接するプロモーターで発現させることによって産生されます。ここでは、16,256の細菌株17を使用して線虫ゲノムの大部分を標的とするAhringerライブラリを使用しました。また、~11,000個のRNAiクローンからなるORFeomeは、Gatewayシステムを使用してVidalラボによって作成され、Horizon Discovery18を通じて購入することができます。
RNAiと組み合わせたCaFEレポーターの有用性を実証するために、早漏を調べました。 ipp-5 の部分的な欠失は、-1卵子と-2卵子の両方が同じ排卵中に精子に入る二重排卵イベントを誘発します19。IPP-5は、IP3に作用し、IP3セカンドメッセンジャーのレベルを効果的に低下させるホスファターゼです。 その結果、ipp-5 のRNAiノックダウンは、変異体と同様の二重排卵表現型を誘発することを発見しました。
ipp-5 RNAiノックダウンによって誘発された二重排卵中のCaFEレポーターの分析により、OETの新たな側面が明らかになりました。まず、カルシウムシグナルは、先行する-1卵子の精子に入るとすぐに観察されましたが、末尾の-2卵子には観察されませんでした(図3)。2つの卵子が排卵されますが、-1卵子は依然として適切な成熟の兆候を示す唯一の卵子であり、特に核膜(NEBD)の崩壊を示します。これらのデータは、-2卵子が精子の存在下にあるにもかかわらず、まだ適切に成熟していないため、受精する能力がないことを示唆しています。第二に、-2卵子は、通常、卵母細胞が子宮の精子から出るときに、遅延したカルシウム波を示します。卵子の成熟は通常、排卵の前提条件ですが、これらのデータは、卵子の成熟と受精能力が排卵後も起こり得ることを示唆しています。ipp-5ノックダウン中の遅延カルシウム波の視覚化は、受精能力とタイミングを調査するCaFEレポーターの利点を強調しています。
さらに、CaFEレポーターは産卵中に検出可能であり、C.エレガンスでは初期胚形成における単一細胞カルシウム過渡現象を明らかにすることを発見しました。同期した1日目の成人EAG28(CaFE;PH-mCherry)ワームは、セクション1〜5のプロトコルを使用して、Zylaカメラを使用したAndor Dragonfly回転ディスク共焦点でイメージングしました(図4)。カルシウムの過渡現象は単一細胞に限定され、受精カルシウム波よりも完了までの時間が短くなります(~9秒、n = 11)。しかし、胚形成中のカルシウム波は二相性ではないようです。カルシウムの過渡性は、8細胞期の前には観察されませんでした。注目すべきは、カルシウムは、ヒトやXenopus 20,21,22を含む他の多くの生物に見られるように、C.エレガンスの卵割溝に局在しないことです。単一細胞カルシウムの過渡現象は、原腸陥入後(受精後~200分)および産卵卵で観察されました。1つの胚は、時間の経過とともに複数のカルシウム過渡現象を示しますが、異なる細胞で、通常は一度に1つの細胞で発生します。レーザー刺激に継続的にさらされると、胚が損傷することに注意してください。LED/レーザー出力を低くするか、不連続露光をお勧めします。ただし、カルシウム波は~9秒と比較的短いため、LED/レーザー刺激イベント間の2秒より遅いことはお勧めしません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
図1: C.エレガンス 生殖腺腕。 EAG25線虫株の生殖腺アームの1本の画像で、CaFEレポーターGFP(緑)と生殖細胞系の核を強調するヒストン2B-mCherryマーカー(赤)を示しています。近位卵子は、精子が保存されている精子の直前に-1で表されます(矢印)。精子に最も近いが子宮内にある胚が最新の胚です。画像は、Nikon ECLIPSE Ti2レーザースキャニングコンフォカルを使用して撮影されました。スケールバー = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
図2:受精中のカルシウム波の可視化。 EAG28線虫株の受精中の細胞内カルシウムを反映した蛍光の時系列画像。EAG28株には、CaFEレポーター(緑)と、原形質膜を強調表示するプレックストリンホモロジードメイン-mCherry融合(黄色)の両方が含まれています。時間0は、卵子の蛍光シグナルの明らかな増加を示す最初のフレームを示します。時間 24.4 秒は、卵子全体の蛍光を示す最初のフレームを反映しています。時系列画像は、Andor Dragonfly回転円盤共焦点とZylaカメラを使用して撮影されました。スケールバー = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
図3:ipp-5 RNAiによる二重排卵イベント中のカルシウム波。 ipp-5 RNAiに曝露したEAG16株(GFPグリーンのCaFE)における-1卵子と-2卵子の連続カルシウム波のタイムラプス画像。-40.0 s フレームには、-1 個の卵子 (-1)、-2 個の卵子 (-2)、精子 (*)、+1 個の胚 (+1) のラベルが含まれています。時間0秒は、-1卵子のカルシウム波の蛍光の初期増加を示します。時間4.5秒は、カルシウム波が-1卵子の反対側の極に向かって広がっていることを示しています。時間 70.5 秒は、ベースライン GFP シグナルで -1 卵子と -2 卵子の全細胞蛍光を示します。両方の卵子は精子にあります。受精した-1卵子と未受精の-2卵子は、158.3秒の時間に子宮に入り、219.3秒で、-2卵子は遅い蛍光カルシウム波を示します。画像は、Andor Dragonfly回転円盤共焦点とZylaカメラを使用して撮影されました。スケールバー= 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
図4:初期胚形成における単一細胞カルシウム過渡現象。 (A) 子宮内の 胚と(B) 子宮外 (産卵)は、胚形成中に単一細胞で蛍光シグナルを示しました。画像は、Andor Dragonfly回転円盤共焦点とZylaカメラを使用して撮影されました。スケールバー = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

C. elegansの受精および初期発生中のカルシウム過渡現象のin vivoでの可視化

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

in-vivo-visualization-calcium-transients-during-fertilization-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、線虫の胚発生の初期のイベントの可視化のための手法について説明...

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

このビデオでは、カルシウムイメージングの背後にある概念を紹介し、成形されたアガロースウェルに含まれる線虫のタイムラプスイメージングのプロトコル例が含まれています。...

カルシウムイメージング:生きたC.エレガンスの神経活動を可視化する方法

このビデオは、遺伝的にコードされた蛍光レポータータンパク質を使用して、行動する線虫の個々のニューロンにおけるカルシウムイメージングの技術を示しています。これは、ワームの動きをイメージングし、ニューロンからのレポーター蛍光比を測定して、細胞内のカルシウムレベルをニューロンの活動および産卵中の行動変化と相関させる手順を概説しています。...

線虫の産卵行動を制御する個々のニューロンにおけるカルシウムイメージング

Source: バンクロフト、E. A., et al.自発的なCa style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'2+ &gt; Fluxes and their downstream effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020)...

マウス胚由来の腹側中脳ニューロンにおけるカルシウム流入の可視化

出典: Doser, R., et al.in vivoでのニューロンカルシウムハンドリングの細胞内イメージングJ. Vis. 経験。(2023年)このビデオは、トランスジェニックCaenorhabditis elegans株の腹側神経索ニューロンにおける細胞内カルシウムフラックスのin...

Caenorhabditis elegansのニューロンにおける細胞内カルシウムダイナミクスのイメージング

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、...

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

このプロトコルでは、線虫みみずの動作における神経活動の変更を記録する遺伝子にエンコードされた Ca2...

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。...

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin...

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

学ぶ CaFEレポーターを用いたC. elegansの受精および初期発生におけるカルシウム動態の可視化手法。遺伝子組み換えカルシウムインジケーターにより、卵母細胞の遅延カルシウム波と単細胞カルシウム過渡現象を観察し、発生生物学研究に有用なツールを示します。

C. elegansの受精および初期発生中のカルシウム過渡現象のin vivoでの可視化

さらに動画を探す