C. elegansの受精および初期発生中のカルシウム過渡現象のin vivoでの可視化

生存可能な胚の生産は複雑なプロセスです。私たちの全体的な目標は、卵子から胚への移行を調整する細胞シグナルを定義することです。CaFEレポーターは、受精時や初期胚形成時に発生するカルシウムシグナルを可視化するために開発された新しいツールです。

CaFEレポーターを用いて、早産卵細胞におけるカルシウム波の遅延を発見しました。また、初期胚形成における単一細胞カルシウム過渡現象の存在も発見しました。どちらの知見も、遺伝的にコードされたカルシウム指標が初期発生期に有用であることを示しています。

カルシウム卵母細胞を可視化する以前の技術は、生殖腺への色素注入に依存していました。この技術は労働集約的であり、特殊なマイクロインジェクション装置が必要です。CaFEレポーターは、広く利用可能な機器を使用して、卵子や胚のカルシウム波を簡単に視覚化できます。

CaFE Reporterは、卵子や胚におけるカルシウムシグナル伝達のタイミングと制御に関する調査を容易にします。このレポーターは、既存の変異体、マーカー、RNAiノックダウンと簡単に組み合わせることができ、筋形成の初期における他の画期的なイベント(筋の成熟など)と比較したカルシウムの挙動を明らかにすることができます。まず、ワームピックのハンドルを持ち、シルバーのカラーを頭に向かって緩め、4つのセクションがバラバラになるようにします。

1.5 インチのプラチナ ワイヤーを 4 つのセクションの中央に配置します。ワイヤーを中央に持ちながらカラーを締め、4つのセクションをまとめます。フラットノーズペンチを使用して、ワイヤーを慎重に形作り、ワイヤーの端を繰り返しクランプして、約2〜3ミリメートルのフィートを作成します。

この足を使ってワームを拾います。3%アガロースの溶液を水に調製し、アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。長軸を横切るラボテープの1つの層を持つ他の2つの顕微鏡スライドの間に空白の顕微鏡スライドを置きます。

1ミリリットルのピペットを使用して、加熱した3%アガロース溶液をブランクスライドの中央に滴下します。新しい顕微鏡スライドをアガロース液滴の上にブランクスライドに垂直にすばやく置き、液滴が隣接するテープスライドを横切って静止し、パッドを無傷に保ちながらスライドを静かに分離します。20マイクロリットルのピペットを使用して、M9バッファー中の1ミリモルのレバミゾールをアガロースパッドの中央に少量加え、線虫を麻痺させます。

少なくとも5つの同期ワームを選び、ワームピックハンドルの足をレバミゾール液滴にそっと触れて、ワームを移します。アガロースパッドをカバースリップで慎重に覆います。カバースリップがワームの飛散を引き起こす可能性があるため、ワームの位置を確認してください。

顕微鏡スライドに、線虫の名前など、適切な詳細をラベル付けします。顕微鏡の低倍率対物レンズを使用し、明視野照明を使用して線虫の位置を特定します。卵子のカルシウム波をはっきりと視覚化するには、最低でも20倍の空気対物レンズまたは40倍の浸型対物レンズを使用してください。

蛍光レポーターを最適に可視化するには、GFPチャンネルとRFPチャンネルのゲインまたは露光時間を調整します。線虫の生殖腺腕にある各マイナス1卵子を調べて、受精イベントが差し迫っているかどうかを判断します。核膜が破壊された後、最も近位のマイナス1卵子の細胞骨格は再配列し、丸みを帯びた外観を取り、マイナス2の卵子から分離します。

排卵が差し迫っている場合は、すぐに広視野設定でビデオの録画を開始してください。近位卵子は、精子が保存されている精子の直前にマイナス1で表されます。最新の胚は精子に最も近く、子宮の内側にあります。

カルシウム波は、急速なバーストから始まり、入口から反対側の極に向かって移動する蛍光波に続く二相性パターンを示しました。カルシウムシグナルは、先行するマイナス1卵子の精子に入るとすぐに観察されたが、末尾のマイナス2卵子では観察されなかった。子宮内胚と子宮外胚は、胚形成中に単一細胞で蛍光シグナルを示しました。