Name: ラパマイシン制御チロシンホスファターゼの開発と応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶラパマイシン制御チロシンホスファターゼの開発と応用。HEK-293T細胞を用いてSHIP-2の活性化による細胞形態変化とシグナル伝達機構を解明する方法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>ラパマイシン制御系によるホスファターゼ活性の時間的調節

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

タンパク質チロシンホスファターゼは、多数の細胞シグナル伝達イベントに関与する重要なタンパク質ファミリーです。それらは、細胞増殖、遊走、およびアポトーシスの調節において重要な役割を果たすことが示されています1,2,3。その結果、タンパク質チロシンホスファターゼの調節不全は、さまざまな衰弱性疾患や障害につながります4,5,6,7。チロシンホスファターゼの生理学的機能とこれらの病状の発症におけるそれらの役割の研究は、ホスファターゼシグナル伝達の複雑さを調査するために必要なツールの欠如によって歴史的に妨げられてきました8。
従来、ホスファターゼは、望ましい特異性を持たない方法、および/またはホスファターゼの活性を時間的に制御しない方法を使用して研究されてきました。利用可能なツールのこれらの重大な制限は、シグナル伝達経路におけるホスファターゼの特定の役割を解剖することを困難にしています。恒常的に活性で優性なネガティブ変異体の過剰発現やホスファターゼの発現のダウンレギュレーションは、特異性をもたらしますが、時間的な制御を欠いており、多くの場合、酵素の真の機能を隠す代償メカニズムを引き起こす可能性があります。
薬理学的阻害剤は、ホスファターゼの時間的調節を可能にします。しかし、多くのホスファターゼ阻害剤は、チロシンホスファターゼ9の活性部位の組成が良好に保存されているため、非特異的であることで有名です。さらに、設計上の制約により、触媒部位を標的とする阻害剤は、細胞膜透過性が不良である10。阻害剤のもう一つの制限は、ホスファターゼ不活性化11の効果を調べることしかできないということである。したがって、ホスファターゼの特異的で時間的に調節可能な活性化を可能にするツールが必要です。これらのツールにより、研究者はホスファターゼ活性化の直接的な影響を特定し、生物学的刺激によってしばしば活性化される複数の並列シグナル伝達カスケードからホスファターゼを分離することができます。重要なことは、活性の厳密な時間的制御により、ホスファターゼによって誘発される一過性の事象の同定が可能になり、急性および長期のホスファターゼ活性の影響を分離することです。時間的調節と突然変異解析を組み合わせることで、ホスファターゼの個々のドメインの特定の役割の詳細な解剖と、その下流のシグナル伝達の調査が可能になります12。
既存のツールに望ましい機能の欠如に対処するために、Karginovグループはラパマイシン制御(RapR)システム13,14,15を開発しました。RapRシステムは、目的タンパク質(POI)のアロステリック制御を可能にする人工スイッチドメインiFKBPを利用しています。POIの触媒部位にアロステリックに結合した位置にiFKBPドメインを挿入すると、ラパマイシンによる調節を受けやすくなります。ラパマイシンが存在しないと、iFKBPはiFKBPの本質的に高い構造ダイナミクスにより触媒部位を破壊し、POIを不活性化します。ラパマイシンを添加すると、iFKBPと共発現タンパク質FRBとの相互作用が誘導されます(図1)。これにより、スイッチドメインが安定化し、その結果、POIの触媒ドメインの構造と機能が回復します。そのため、このツールを使用すると、POIの特定の時間的に調整可能なアクティブ化が可能になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> 図1:RapR-Shp2ラパマイシン制御システムの概略図。 RapRは、ラパマイシンを添加することで、目的のタンパク質のアロステリック活性化を可能にします。この図は、Fauser et al.12から修正されました。略語:iFKBP =挿入可能なFKBP12;FRB = FKBP-ラパマイシン結合ドメイン;R =ラパマイシン;Shp2 = Srcホモロジー-2ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
RapRツールは、さまざまなタンパク質ファミリーに適用できます。これは、ホスファターゼ12,14と同様にプロテインキナーゼの調節に用いることができる。このプロトコルでは、Shp2ホスファターゼを制御するためのRapRツールのアプリケーションに焦点を当てます。Shp2は、増殖、遊走、免疫調節、分化などのシグナル伝達プロセスに関与する遍在的に発現するタンパク質チロシンホスファターゼです1,16,17,18。Shp2の調節不全は、多くの固形がん、骨髄性白血病、および発達障害と関連しています5,7。しかし、Shp2は上記と同じツールの欠点の犠牲になっています。これらの制限に対処するために、特異的かつ時間的に調整可能なShp2コンストラクトであるRapR-Shp2が開発され、特徴付けられた12。
RapR-Shp2が開発される前は、Shp2が細胞遊走に関与していることが知られていた19,20,21。しかし、このプロセスに関与するシグナル伝達におけるその具体的な役割は不明でした。また、Shp2がどの時間スケールで細胞の移動を制御し、その活性化の異なる時点でどのような特定の形態力学的変化を誘発するかも不明でした。さらに、Shp2の急性および長期の活性化が異なる影響を引き起こすかどうかは不明でした。RapR-Shp2を用いて、Shp2の急激な活性化が一過性の細胞拡散、突起の増加、細胞分極、遊走を誘導することがわかりました。Shp2の下流で明確な形態力学的変化を調節する特定の経路も同定された12。このプロトコルは、RapR-Shp2の設計と特性評価の詳細を提供し、他のRapRホスファターゼの開発と応用を導くために使用できます。

<table><tbody><tr><td>#1.5 ガラス カバースリップ 25 mm 丸型</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli バッファー</td><td></td><td></td><td>500 mL 用: 5.18 g Tris-HCL、131.5 mL グリセロール、52.5 mL 20% SDS、0.5 g ブロモフェノール ブルー、最終 pH 6.8</td></tr><tr><td>4-20% ミニプロティアン TGX プレキャスト ゲル</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus バッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>アガルソース</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor セルチャンバー</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>ベンチマーク ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ジェミニ バイオ製品</td><td>100-106</td><td>熱不活性化トリプル 0.1 & マイクロ;m 滅菌ろ過</td></tr><tr><td>Brig 35,30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Published in 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red plasma membrane dye</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a competent細胞</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>コーニング</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>DNAラダー</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI 酵素</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-ジチオスレイトール、Cleland's Reagents</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin from usvine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Transfection Reagent</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>transfection reagent</td></tr><tr><td>Gel extraction Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET Gel Extraction Kit</td></tr><tr><td>Gel Green Nucleic Acid Stain</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディング染料 パープル 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 処理ソフトウェア</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール緩衝液</td><td></td><td></td><td>25 mM イミダゾール pH 7.2、2.5 mM EDTA、50 mM NaCl、5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Σ</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>培</td>地 <td>Fisher BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>溶解緩衝液</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7.8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>R 2022b アップデートは、CellGeo 関数の実行に使用されました</td></tr><tr><td>Metamorph Microscopy Automation and Image Analysis Software</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gene選択肢</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン TGX プレキャストゲル 12 ウェル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレード 水</td><td>コーニング</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>マルチバンド ポリクロイック ミラー</td><td>クロマ テクノロジー</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー ケミカル</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス UPlanSAPO 40x 対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca and Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tubes</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps</td></tr><tr><td>Phusion Plus DNA</td><td>Polymerase Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>PVDF メンブレン</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>免疫ブロット PVDF/フィルターペーパーサンドイッチ</td></tr><tr><td>ラパマイシン</td><td>フィッシャー</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン、2.21 mM EDTA、1x [-] コー</td><td>ニング</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>トリス-アセテート-EDTA (TAE) 50x</td><td>フィッシャー</td><td>BP1332-1</td><td>電気泳動用</td></tr><tr><td>洗浄バッファー</td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH、pH 7.8、50 mM KCl、100 mM NaCl、1 mM EGTA、1% NP40</td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR 抗体</td><td>細胞シグナル</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>アンチエルク 1/2 抗体</td><td>細胞シグナル</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>アンチフラッグ抗体</td><td>ミリポアシグマ</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>抗mCherry抗体</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>抗パキシリン抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化EGFR Y992</td>抗体 <td>細胞シグナル伝達</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化エルk 1/2 T202/Y204抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化パキシリン Y31 抗体</td><td>ミリポアシグマ</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化PLC&γ;Y783抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>抗PLC&γ;抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

ラパマイシン制御チロシンホスファターゼの開発と応用

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

図4は、パキシリンベースのホスファターゼ活性アッセイから期待できる結果を示しています。この実験では、ホスホパキシリンを読み取り値として使用して、恒常的に活性でドミナントな負のShp2ホスファターゼ活性を、活性および不活性のRapR-Shp2活性および不活性RapR-Shp2の活性活性と比較しました。Shp2コンストラクトを免疫沈降させ、プロトコールに記載されたように活性アッセイに供した。恒常的に活性なShp2と活性なRapR-Shp2のリン酸化パキシリンの読み出しは類似しており、活性なRapR-Shp2はRapRドメインの導入によって悪影響を受けず、活性化されると完全な活性を保持したことを示しています。ドミナントネガティブShp2と非アクティブなRapR-Shp2も類似しており、非アクティブなときにRapR-Shp2コンストラクトが活性を持たないことを示しています。これは、RapR-ホスファターゼの設計が成功したことを示しています。このアッセイに使用されるリン酸化基質は、目的のホスファターゼによって異なる場合があります。
図5は、 図4と同様に、恒常的に活性なRapR-Shp2、ドミナントネガティブ、アクティブと非アクティブのRapR-Shp2を比較しています。この実験は、コンストラクトの免疫沈降なしで行われました。その代わりに、細胞内のRapR-Shp2コンストラクトの下流シグナル伝達効果を特徴付けるように設計されました。ここでは、Shp2コンストラクトをHEK293T細胞で発現させました。下流のエフェクターERK1/2は、恒常的に活性なサンプルと同様に、RapR-Shp2の活性化に応答してリン酸化が増加することが示されました。不活性なRapR-Shp2は、この変化を誘発しなかった。これは、Shp2の下流シグナル伝達がRapRドメインを取り込むことで保持されることを示しています。同様に、既知のリン酸化基質EGFRおよびPLCγは、A431細胞におけるRapR-Shp2活性化に応答して脱リン酸化されました。
最後に、 図6 は、HeLa細胞の形態動態におけるRapR-Shp2の活性化結果を示しています。RapR-Shp2が活性化されると、細胞は突出活性と細胞面積の増加を示しました。このことは、RapR-Shp2の活性化がHeLa細胞の形態動態学的変化を誘導するのに十分であり、研究者がこの効果に関与する特定の下流シグナル伝達経路を探ることができる可能性があることを示しています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> 図4:パキシリンベースの活性アッセイの結果: 恒常的に活性、ドミナントネガティブ、およびRapR-Shp2を免疫沈降させ、概説されたプロトコルを用いた活性アッセイの対象としました。CAとRapR-Shp2の両方でpY31パキシリンのレベルは類似しており、RapR-Shp2コンストラクトは、活性化後のCA Shp2と比較して同様の活性を持っていたことを示しています。非活性化されたRapR-Shp2サンプルは、DNサンプルと同様に活性がなく、「漏れ」ていなかったことを示しています。この図は、Fauser et al.12から修正されました。略語:RapR = ラパマイシン規制;Shp2 = Srcホモロジー-2ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ;DN = dominant negative;CA = 恒常的に活性;FRB = FKBP-ラパマイシン結合ドメイン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> 図5:全細胞ライセートアッセイの結果: HEK293T細胞で恒常的に活性、ドミナントネガティブ、およびRapR-Shp2が発現し、全細胞ライセートプロトコルが完了しました。不活性な場合、RapR-Shp2はDN Shp2サンプルと同様に、リン酸化によってERK1/2を活性化しませんでした。これは、RapR-Shp2が非アクティブなときにアクティビティがないことを示しています。活性化されると、ERK1/2のリン酸化レベルはCA Shp2サンプルと同程度であり、Shp2の活性化と下流シグナル伝達が成功したことを示しています。同様に、RapR-Shp2を発現するA431細胞は、Shp2の既知の基質であるEGFRとPLCγの両方のリン酸化の減少を示しました。この図は、Fauser et al.12から修正されました。略語:RapR = ラパマイシン規制;Shp2 = Srcホモロジー-2ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ;DN = dominant negative;CA = 恒常的に活性;ERK = 細胞外シグナル調節キナーゼ;GAPDH = グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ;EGFR = 上皮成長因子受容体;PLCγ = ホスホリパーゼCγ;FRB = FKBP-ラパマイシン結合ドメイン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> 図6:ライブイメージングに基づく細胞面積と突起活性データ解析: HeLa細胞にRapR-Shp2をトランスフェクションし、概説したライブイメージングプロトコルにかけました。データは、データ分析プロトコルに概説されているように分析されました。活性化されると(灰色の縦線で示されています)、HeLa細胞は細胞の突出活性と細胞面積の両方で増加を示しました。FRBのみを発現していた陰性サンプルでは、この活性は存在しませんでした。このことは、RapR-Shp2の活性化がHeLa細胞内で急速な形態動態変化を誘導し、細胞の拡散と突出を促進することを示しています。この図は、Fauser et al.12から修正されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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