Name: 単離されたミトコンドリアにおける異種生物の輸送と効果の解明:呼吸器測定および酵素アッセイからの洞察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶミトコンドリア呼吸測定と酵素アッセイを用いた異種生物の効果評価法。ラット、蚊、ダニの単離ミトコンドリアを対象に、電子伝達系の変調を解析し、標的生物に特異的なバイオセーフ殺虫剤開発への知見を提供する。

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<meta charset="utf8"></head><body>治療用および生物殺虫剤への応用のためのミトコンドリア機能の変化

<ol><li>Javadov, S., Kozlov, A. V., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in health and diseases.</a> Cells. 9 (5), 1177(2020).</li>
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<li>Kesari, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+natural+biomolecule+picein+attenuates+Menadione+induced+oxidative+stress+on+neuroblastoma+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Plant-derived natural biomolecule picein attenuates Menadione induced oxidative stress on neuroblastoma cell mitochondria.</a> Antioxidants (Basel, Switzerland). 9 (6), 552(2020).</li>
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<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-targeted+nanocarriers+doubled+the+toxicity+of+oxidative+phosphorylation+and+ATP+synthesis+disruptive+insecticides+against+Spodoptera+frugiperda%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Nano%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-targeted nanocarriers doubled the toxicity of oxidative phosphorylation and ATP synthesis disruptive insecticides against Spodoptera frugiperda.</a> Environ Sci Nano. 9 (10), 3873-3884 (2022).</li>
<li>Lees, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insecticide+screening+platforms+indicate+that+Mitochondrial+Complex+I+inhibitors+are+susceptible+to+cross-resistance+by+mosquito+P450s+that+metabolise+pyrethroids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">New insecticide screening platforms indicate that Mitochondrial Complex I inhibitors are susceptible to cross-resistance by mosquito P450s that metabolise pyrethroids.</a> Sci Rep. 10 (1), 16232(2020).</li>
<li>Leung, M. C. K., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+a+target+of+organophosphate+and+carbamate+pesticides%3A+Revisiting+common+mechanisms+of+action+with+new+approach+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as a target of organophosphate and carbamate pesticides: Revisiting common mechanisms of action with new approach methodologies.</a> Reprod Toxicol. 89, 83-92 (2019).</li>
<li>Al-Harbi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+insecticidal+effects+of+plants+essential+oils+extracted+from+basil%2C+black+seeds+and+lavender+against+Sitophilus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Evaluation of insecticidal effects of plants essential oils extracted from basil, black seeds and lavender against Sitophilus oryzae.</a> Plants. 10 (5), 829(2021).</li>
<li>Kim, S. -I., Roh, J. -Y., Kim, D. -H., Lee, H. -S., Ahn, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+activities+of+aromatic+plant+extracts+and+essential+oils+against+Sitophilus+oryzae+and+Callosobruchus+chinensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stored+Prod+Res%22%5BJournal%5D)">Insecticidal activities of aromatic plant extracts and essential oils against Sitophilus oryzae and Callosobruchus chinensis.</a> J Stored Prod Res. 39 (3), 293-303 (2003).</li>
<li>Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradford+assay+for+determining+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bradford assay for determining protein concentration.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236 (2), 302-308 (1996).</li>
<li>Voss, D. O., Campello, A. P., Bacila, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+the+oxidative+phosphorylation+of+rat+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and the oxidative phosphorylation of rat brain mitochondria.</a> Biochem Biophys Res Commun. 4, 48-51 (1961).</li>
<li>Gonçalves, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+biological+activity+of+the+essential+oil+from+Thapsia+minor%2C+a+new+source+of+geranyl+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Crops+Prod%22%5BJournal%5D)">Composition and biological activity of the essential oil from Thapsia minor, a new source of geranyl acetate.</a> Ind Crops Prod. 35 (1), 166-171 (2012).</li>
<li>Somlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+des+lactico-cytochrome+c+reductases+%28d-et+l-%29+de+la+levure+aerobie+par+les+lactates+%28d-+et+l%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Gen+Subj%22%5BJournal%5D)">Induction des lactico-cytochrome c reductases (d-et l-) de la levure aerobie par les lactates (d- et l).</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 97 (2), 183-201 (1965).</li>
<li>Mason, T. L., Poyton, R. O., Wharton, D. C., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+Oxidase+from+Bakers%27+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c Oxidase from Bakers' Yeast.</a> J Biol Chem. 248 (4), 1346-1354 (1973).</li>
<li>Nelson, D. L., Cox, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%3A+International+Edition%22">Lehninger Principles of Biochemistry: International Edition</a>. , Macmillan Learning. https://play.google.com/store/books/details?id=wZqp0AEACAAJ (2021).</li>
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<li>Maxwell, J. T., Tsai, C. -H., Mohiuddin, T. A., Kwong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+mitochondrial+calcium+influx+in+isolated+mitochondria+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyses of mitochondrial calcium influx in isolated mitochondria and cultured cells.</a> J Vis Exp. (134), e57225(2018).</li>
<li>Vesga, L. C., Silva, A. M. P., Bernal, C. C., Mendez-Sánchez, S. C., Romero Bohórquez, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrahydroquinoline%2F4%2C5-dihydroisoxazole+hybrids+with+a+remarkable+effect+over+mitochondrial+bioenergetic+metabolism+on+melanoma+cell+line+B16F10%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Tetrahydroquinoline/4,5-dihydroisoxazole hybrids with a remarkable effect over mitochondrial bioenergetic metabolism on melanoma cell line B16F10.</a> Med Chem Res. 30, 2127-2143 (2021).</li>
<li>Vesga, L. C., Bueno, Y., Stashenko, E., Mendez Sánchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efecto+del+aceite+esencial+de+Eucalyptus+citriodora+sobre+el+metabolismo+energ%C3%A9tico+mitocondrial%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Colomb+Qu%C3%ADm%22%5BJournal%5D)">Efecto del aceite esencial de Eucalyptus citriodora sobre el metabolismo energético mitocondrial.</a> Rev Colomb Quím. 43 (2), 10-17 (2015).</li>
<li>Borrero-Landazabal, M. A., Duque, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+to+design+insecticides+against+Aedes+aegypti+using+in+silico+and+in+vivo+analysis+of+different+pharmacological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Model to design insecticides against Aedes aegypti using in silico and in vivo analysis of different pharmacological targets.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 229, 108664(2020).</li>
<li>Valmas, N., Zuryn, S., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+uncouplers+act+synergistically+with+the+fumigant+phosphine+to+disrupt+mitochondrial+membrane+potential+and+cause+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial uncouplers act synergistically with the fumigant phosphine to disrupt mitochondrial membrane potential and cause cell death.</a> Toxicology. 252 (1-3), 33-39 (2008).</li>
<li>Slocińska, M., Rosinski, G., Jarmuszkiewicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+mitochondrial+uncoupling+protein+4+and+ATP-sensitive+potassium+channel+cumulatively+decreases+superoxide+production+in+insect+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept+Lett%22%5BJournal%5D)">Activation of mitochondrial uncoupling protein 4 and ATP-sensitive potassium channel cumulatively decreases superoxide production in insect mitochondria.</a> Protein Pept Lett. 23 (1), 63-68 (2016).</li>
<li>Borrero Landazabal, M. A., Carreño Otero, A. L., Kouznetsov, V. V., Duque Luna, J. E., Mendez-Sanchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+mitochondrial+electron+transport+chain+and+oxidative+stress+induced+by+alkaloid-like+%CE%B1-aminonitriles+on+Aedes+aegypti+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Alterations of mitochondrial electron transport chain and oxidative stress induced by alkaloid-like α-aminonitriles on Aedes aegypti larvae.</a> Pestic Biochem Physiol. 144, 64-70 (2018).</li>
<li>Castillo-Morales, R. M., Carreño Otero, A. L., Mendez-Sanchez, S. C., Da Silva, M. A. N., Stashenko, E. E., Duque, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affectation%2C+DNA+damage+and+AChE+inhibition+induced+by+Salvia+officinalis+essential+oil+on+Aedes+aegypti+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affectation, DNA damage and AChE inhibition induced by Salvia officinalis essential oil on Aedes aegypti larvae.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 221, 29-37 (2019).</li>
<li>Montagut, D. C., Bueno, Y., Vesga, L. C., Stashenko, E. E., Mendez-Sanchez, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cymbopogon+flexuosus+%28nees+ex+steud.%29+w.+watson+essential+oil+effect+on+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Essent+Oil+Res%22%5BJournal%5D)">Cymbopogon flexuosus (nees ex steud.) w. watson essential oil effect on mitochondrial bioenergetics.</a> J Essent Oil Res. 34 (3), 233-239 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,6-ジクロロフェノールインドフェノール</td><td>メルク</td><td>119814</td><td>使用日当日に調製してください。</td></tr><tr><td>Bradford試薬</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Carvacrol</td><td>Merck</td><td>W224511</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c</td><td>Merck</td><td>C2506</td><td>感光性コンバーは、アルミホイルで覆います。溶液中では、冷凍庫に保管する必要があります。</td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>メルク</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>メルク</td><td>>E3889</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 四ナトリウム塩二水和物</td><td>メルク</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>メルク</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>メルク</td><td>60178</td><td>溶液中で 2 週間ウィールします。</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC マイクロプレート フォトメーター</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51119100</tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>567550</td><td></td></tr><tr><td>Oroboros O2k&nbsp;</td><td>オロボロスインスツルメンツ</td><td>10203-03</td><td>https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/</td></tr> <tr><td>フェナジンメトスルフェート&nbsp;</td><td>メルク</td><td>P9625</td><td>は使用当日に調製してください。</td></tr><tr><td>フェリシアン化カリウム&nbsp;</td><td>メルク</td><td>244023</td><td>使用当日にご用意ください。</td></tr><tr><td>Potter Elvehjem組織ホモジナイザーチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Merck</td><td>557368</td><td>エタノールに可溶です。感光性コンバーはアルミホイルで覆います。溶液中では、冷凍庫に保管する必要があります。</td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム</td>メル<td>ク</td><td>S9637</td><td>溶液では、冷凍庫に保管する必要があります。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>メルク</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元二ナトリウム塩水和物</td><td>メルク</td><td>N8129</td><td>感光性コンバーは、アルミホイルでそれを覆います。溶液中では、冷凍庫に保管する必要があります。</td></tr></tbody></table>

単離されたミトコンドリアにおける異種生物の輸送と効果の解明:呼吸器測定および酵素アッセイからの洞察

Unveiling Xenobiotic Transport and Effects in Isolated Mitochondria: Insights from Respirometric and Enzymatic Assays

このプロトコルで得られた結果を分析する前に、ミトコンドリアの電子伝達鎖の生化学について少し覚えておくことが不可欠です。まず、NADHは、複合体Iに位置する酸化還元中心に一対の電子を供給します。そこで、複合体Iからユビキノンへ、続いて複合体IIIへ、そしてそれらをシトクロムcに供与する複合体IVへ、そして最後に酸素が最終的な電子受容体である複合体IVへ、電子の輸送が始まり、それを水に還元します。一方、コハク酸は複合体IIに電子を供給します(コハク酸デヒドロゲナーゼとも呼ばれます)。電子は複合体IIからユビキノンに移動し、そこから上記と同じ経路をたどります。ユビキノンは電子を複合体IIIに輸送し、続いて複合体IVに通過し、酸素を還元します20。
この研究で概説されているプロトコルは、ラットの肝臓および均質化された ネッタイシマカ の幼虫のミトコンドリア生体エネルギーに対する生体異物の影響の評価を容易にし、この方法論を他のさまざまな種に外挿することを可能にします。最初に、このプロトコルでは、エッセンシャルオイル(EO)や二...

Mitochondria are often referred to as the cell's powerhouse due to their crucial role in energy production through the electron transport chain (ETC). ...

unveiling-xenobiotic-transport-effects-isolated-mitochondria-insights

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

サンプル間のミトコンドリア膜電位の比較は、細胞の状態に関する貴重な情報をもたらします。ミトコンドリアを単離し、蛍光を使用して阻害剤およびアンカプラーに対する反応を評価するための詳細な手順について説明します。このプロトコルの方法と有用性は、細胞培養と細胞ストレスの動物モデルの使用によって説明されています。...

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

ここでは、麻酔をかけたブタから大腿四頭筋の標本を採取し、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離します。次に、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、およびIVの呼吸数を高解像度呼吸測定を使用して決定します。...

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。...

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

高分解能呼吸計を用いた酸化的リン酸化の評価は、ミトコンドリアおよび細胞エネルギー代謝の機能解析の不可欠な部分となっている。ここでは、チャンバーおよびマイクロプレートベースの高分解能呼吸計を使用して細胞エネルギー代謝を分析するためのプロトコルを提示し、各デバイスの主な利点について説明します。...

チャンバーおよびプレートベースの呼吸計を使用して細胞および組織の生体エネルギーを評価するための高解像度呼吸法

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

これらのプロトコルは、タツノオトシゴの細胞外フラックス分析を使用して、3Dがん細胞株由来スフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝を調べるのに役立ちます。...

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸は、細胞の生体エネルギー学の貴重な指標です。ここでは、さまざまな酵母種に適用できるこの表現型を定量化するためのプロトコルを紹介します。...

酵母全細胞におけるミトコンドリア呼吸の定量化

学ぶミトコンドリア呼吸測定と酵素アッセイを用いた異種生物の効果評価法。ラット、蚊、ダニの単離ミトコンドリアを対象に、電子伝達系の変調を解析し、標的生物に特異的なバイオセーフ殺虫剤開発への知見を提供する。

単離されたミトコンドリアにおける異種生物の輸送と効果の解明:呼吸器測定および酵素アッセイからの洞察

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