フィブロネクチン接着および回遊アッセイを用いた軟骨細胞および軟骨形成細胞の単離

軟骨組織工学や再生医療の分野では、進行中の治療の改善や新たな治療戦略の開発など、生物学的・機能的なアウトカムを向上させることが依然として求められています。現在の前臨床研究では、軟骨治癒の実行可能な選択肢として、軟骨由来軟骨形成因子の使用の可能性が示されています。現在の研究には、追加の成長因子と遺伝子組換え技術を使用して、より低い肥大力を維持しながら軟骨形成能力をさらに高める戦略が含まれています。

軟骨形成体は、命名法に関するコンセンサスの欠如、多様な単離技術、特性評価の難しさ、培養条件のばらつき、根本的なメカニズムの理解が限られているなどの実験上の課題に直面しています。軟骨形成細胞が一般的に使用される細胞と比較して良好な結果をもたらすことを臨床的に実証することで、軟骨関連の病状に関連する全体的な負担を大幅に軽減できる可能性があります。前駆細胞に由来する細胞外小胞などの無細胞代替法を使用した改良された治療法の進化、および本物の硝子様軟骨の再生のための組換え戦略の使用。

まず、無菌条件下でヒトのドナーから1X PBSで脛骨大腿関節または膝関節を採取し、採取した関節をフードの滅菌アンダーパッドに移します。関節を安定させるために、軟骨を上に向けて軟骨下骨を保持します。22番のメスの刃を使用して、体重がかからない領域から長方形の軟骨の削りくずを採取します。

軟骨を表層から深層まで8mm×10mmのセクションに切断します。PBSでスライスを洗った後、1〜2ミリリットルのプレーンダルベッコ改質イーグル培地(DMEM)が入ったシャーレに入れます。次に、22番のメスの刃を使って、軟骨スライスを1mm立方体よりも小さいサイズにミンチにします。

まず、抽出した人間の膝関節からミンチ軟骨を入手します。刻んだ軟骨を、酵素消化のために0.15%コラゲナーゼII型を含む10ミリリットルの無血清DMEM/F-12を含む直立したT25フラスコに入れます。フラスコをそのまま二酸化炭素インキュベーターに12〜14時間放置します。

一晩消化した後、放出された軟骨細胞を含む培地を新鮮な滅菌遠心チューブに移します。セルストレーナーを使用して、細胞を破片から分離します。等量のDMEM/F-12を10%ウシ胎児血清(FBS)と添加します。

濾過した細胞を1,200Gで37°Cで5分間遠心分離する。上清を捨てた後、ペレットを1ミリリットルの培地に再構成します。トリパンブルー排除アッセイを使用して生存細胞をカウントします。

次に、軟骨細胞を1平方センチメートルあたり10, 000細胞の濃度でT25フラスコにロードします。10%FBSを含むDMEM/F-12を使用して、セルを必要な継代数まで拡大します。3日ごとに培地をリフレッシュしてから、EDTAを含む0.125%トリプシンを使用してサブコンフルエンスで細胞を回収します。

軟骨細胞は、ロード後すぐに付着し、拡大するにつれて丸みを帯びた丸石の形状から線維芽細胞の外観に移行しました。まず、抽出したヒトの脛骨大腿関節または膝関節から軟骨の削りくずを入手します。軟骨の削りくずを、最初に0.2%プロナーゼを3時間使用し、続いて0.04%コラゲナーゼII型を摂氏37度に維持された振とう水浴で12時間使用して、一晩連続して酵素消化します。

次に、6ウェルプレートの必要な数のウェルを1.5ミリリットルのPBSフィブロネクチン溶液でコーティングします。プレートをしっかりと密封し、摂氏4度で一晩冷蔵します。翌日、フィブロネクチンでコーティングされた6ウェルプレートを冷蔵庫から取り出します。

余分なフィブロネクチンを除去した後、コーティングされたウェルに2〜3ミリリットルのプレーンDMEM/F-12培地を加えます。放出された軟骨細胞を、ウェルあたり4, 000細胞の密度でコーティングされたウェルに播種し、プレートを20分間邪魔しないままにします。インキュベーション後、余分な培地と非接着性細胞を吸引します。

ウェルに10%ウシ胎児血清を含むDMEM/F-12を2〜3ミリリットル加えます。軟骨形成前駆細胞、またはCPC、クローンを得るために、標準培養条件下で接着細胞を10〜12日間維持し、次に0.125%トリプシンEDTAを使用してCPCクローンを180秒間分離し、その後、5平方センチメートルごとに1クローンの割合で再生します。濃縮ポリクローナル CPC を必要な合流点まで拡大します。

フィブロネクチン接着アッセイを受けた軟骨細胞はクローン増殖を示し、10日目までに5人の集団が倍増します。まず、採取した関節関節から剃った軟骨外植片を補充したDMEM/F-12培地で採取します。外植片を入れたプレートを、摂氏37度に設定された二酸化炭素インキュベーター内に48時間置きます。

2日後、外植片を10ミリリットルの0.1%コラゲナーゼ溶液を含む遠心分離チューブに移し、酵素消化を行います。チューブを摂氏37度で2時間インキュベートします。消化後、外植片を1X PBSですすぎ、新鮮なDMEM/F-12培地を含むプレート内の同じウェルに戻します。

プレートをインキュベーター内で標準的な培養条件下で維持し、その後の数日間にわたる軟骨形成体の移動を監視します。外植片がサブコンフルエンスに達したら、0.125%トリプシンEDTA溶液を使用して、間葉系軟骨形成細胞またはMCPを収穫します。補充されたDMEM/F-12培地を使用してMCPを展開します。

軟骨形成体は、培養の10日目までに外植片の端から移動を開始し、さらに拡大する紡錘形の成長パターンを示します。