Name: 組織工学のためのナノフィブリルパターンコラーゲンの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶ せん断ベースの押出法によるナノフィブリルパターンコラーゲン水ゲルの作製法。標準機器でコラーゲン線維の配向を制御し、組織工学や再生医療への応用を可能にする革新的なバイオマテリアル技術です。

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<meta charset="utf8"></head><body>指向性パターニングによる人工ナノフィブリルコラーゲンの作製

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</ol>

<table><tbody><tr><td>コラーゲンI.、高濃度、ラットテール</td>コー<td>ニング</td><td>CB354249</td><td></td></tr><tr><td>エクリプスTE-2000-U顕微鏡</td>ニ<td>コン</td><td>TE-2000-U&nbsp;</td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>超厚手顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-267-005</td><td>コラーゲン押出面に適しています</td></tr><tr><td>FEI Helios G3 NanoLab DualBeam</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td>走査型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>ガラスカッターツールセット 2mm-20mm ペンシルスタイル オイルフィード カーバイドチップ</td><td>Amazon/MOARMOR</td><td>B07Y1D243Hガラス</td><td>カッターのオプション</td></tr><tr><td>ハミルトン Kel-F ハブ ブラントポイントニードル (ルアーロック、22 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-574</td><td>コラーゲン押出し用針</td></tr><tr><td>Nexterion スライド H 3-D</td><td>ショット</td><td>NC0782819</td><td>疎水性スライド</td></tr><tr><td>PBS 錠剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 8000</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>シームレスセルロース透析チューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S25645G</td><td></td></tr><tr><td>スネークスキン透析クリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>シンセグラスグラスカッター</td><td>シンセウェア</td><td>31-501-927</td><td>ガラスカッターのオプション</td></tr></tbody></table>

組織工学のためのナノフィブリルパターンコラーゲンの作製

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

このプロトコルは、整列(図2)またはランダム(図3)配向したナノフィブリルで構成されるコラーゲンハイドロゲルを製造するための簡単なせん断ベースの押出技術について説明しています。ナノフィブリルパターニングは、シリンジ速度とコラーゲン押出速度の組み合わせによる調整によって達成されるせん断力の精密な制御に依存しています。フィブリルアライメントを誘導するための最適値は、以前に340 mm / sのシリンジ速度と3.2 mL / minのコラーゲン押出速度であると決定されています28,29。このバランスは、整列したナノフィブリルの形成だけでなく、マクロスケールでのハイドロゲルの機能を確保するためにも重要です。この比率がずれていると、思った通りにパターン化されていないハイドロゲルや、コラーゲンストリップを含むハイドロゲルが薄すぎる(直径&lt;0.5mm)、厚い(直径&gt;1.5mm)、波状になって使用する恐れがあります。たとえば、シリンジの動きが速すぎると、押し出し速度が遅すぎると、ストリップが薄くなりますが、反対の比率では、比率の不均衡の程度に応じて、厚いまたは波状のストリップが生成されます(図4A-D)。これらの巨視的な特性の違いは、細胞の沈着と局所接着に影響を与えるのに十分なストリップ間のばらつきを生み出す可能性があります。
コラーゲンの押し出しと組み立てに続いて、ハイドロゲルの作製は初期乾燥段階(多くの場合は1〜3時間)を経て進行し、その後、1x PBSで洗浄ステップを受けます(図2 および 図3)。最適なトポグラフィー結果を達成するには、洗浄ステップのタイミングと強度の微妙なバランスが必要です。洗浄が不十分または遅延すると、繊維トポグラフィーが乱れ、フィブリル上のPBS塩結晶の痕跡によって示されます。対照的に、製造後のコラーゲンの過剰または時期尚早な洗浄は、トポグラフィーの特徴を覆うコラーゲンの溶解層をもたらします(図4E、F)。
走査型電子顕微鏡(SEM)は、コラーゲンハイドロゲル内の整列したまたはランダムなナノフィブリル配向の存在を確認します。配向したヒドロゲルとランダムヒドロゲルの両方において、ナノフィブリルは30〜50 nm29のフィブリル直径を示す。定性的には、整列したハイドロゲルが一軸整列したナノフィブリルを含んでいることは明らかです(図5)。このアライメントは、以前に2D高速フーリエ変換解析を使用して定量化されており、アライメントプロットは、アライメントされたハイドロゲルに対して180°間隔で2つの異なるピークを表示し、低周波のピークのみを示すランダムに配向されたハイドロゲルとは対照的です28。
初代マウス骨格筋筋芽細胞の明視野画像は、コラーゲン線維の異方性ナノトポグラフィー誘導が細胞の整列を促進することを示しています(図6)。これらのナノパターン化されたコラーゲンハイドロゲルは、筋芽細胞26だけでなく、内皮細胞23,24などの他の細胞タイプでも細胞の整列を誘導することが示されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig01.jpg"> 
図1:超高密度コラーゲンとカットガラススライド調製の概略図:(A-F)コラーゲン透析のプロセス:(A)透析チューブを3インチストリップに調製し、最初のクリップを固定、(B)高密度ストックコラーゲンをチューブに装填して2番目のクリップを固定、(C)ロードされた透析チューブをポリエチレングリコール(PEG)フレークで包む、 (D)飽和PEGフレークの除去、(E)PEGフレークの水洗い、(F)超高密度コラーゲンの微量遠心チューブへの保存。(G-L)スライドガラスの切断プロセス:(G)研究用スライドガラスの入手、(H,I)ダイヤモンドチップガラスカッターによるスライドガラスのスコアリング、(J)スコアのない側からのスライドガラスの破損、(K)カットガラスの水洗い、(L)スライドガラスの乾燥。BioRenderを使用して作成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig02.jpg"> 
図2:整列したコラーゲンハイドロゲルの作製プロセス ステップ1:10x PBS温めたバッファーへのコラーゲンのせん断下での押し出しと線維化の誘導。 ステップ2:カットガラススライドへの押し出しコラーゲンの取り付け。 ステップ3:ヒドロゲルのサイズを拡大するための追加の押し出しコラーゲンの取り付け。 ステップ4:コラーゲンハイドロゲルの乾燥。BioRenderを使用して作成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig03.jpg"> 
図3:ランダムコラーゲンハイドロゲルの作製プロセス。ステップ1:カットされたスライドガラス(シングルストリップ)へのコラーゲンの押し出し。 ステップ2:コラーゲンの継続的な押し出しはサイズを増加させます(複数のストリップ)。 ステップ3:押し出しコラーゲンを10X PBSバッファーに浸して、線維化を開始します。 ステップ4:ハイドロゲルの乾燥。BioRenderを使用して作成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig04.jpg"> 
図4:コラーゲンハイドロゲルの作製プロセスで起こりうるエラーステップ(A-F)最適な厚さのコラーゲンストリップ、(B)過度に厚いコラーゲンストリップ、(C)厚さが不十分なコラーゲンストリップ、(D)波状のコラーゲンストリップ、(E、F)走査型電子顕微鏡で示したコラーゲン表面の過剰洗浄の例。スケールバー = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig05.jpg"> 
図5:整列したコラーゲンハイドロゲルとランダムコラーゲンハイドロゲルの走査型電子顕微鏡画像。 画像は電子顕微鏡を使用して撮影しました。ビーム条件は2keV、電流範囲は25〜100pA、作動距離は4〜5mmに設定されました。画像は、6144 x 4096 ピクセルの解像度で一貫して 1 μs の滞留時間で保存されました。スケールバー = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig06.jpg"> 
図6:整列したランダムなコラーゲンハイドロゲルで培養した初代マウス筋芽細胞。 筋芽細胞は、イメージングに先立って3日間、ハイドロゲル上で培養しました。明視野画像は、倒立顕微鏡を使用して10倍の倍率で撮影されました。矢印は整列したナノフィブリルの配向を示します。スケールバー = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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革新的なバイオファブリケーション技術が開発されました。これは、生体内の組織の建築的特徴、構成要素、機械的特性に似た3次元の構築物を設計するためです。この技術は、新開発の犠牲材料であるBSAゴムを特徴としており、詳細な空間的特徴を転写することで、さまざまな組織の生体内構造を再現します。...

三次元バイオミメティック・テクノロジー：小説Biorubberはコラーゲンハイドロゲルで定義されたマイクロ・マクロスケールのアーキテクチャを作成します。

ここで提示されるプロトコルは、機械研究、疾患モデリング、およびスクリーニング用途に適した、二重極を有するマルチウェルプレートで48組織の平行培養のための設計された結合組織を生成するプロトコルである。プロトコルは、異なる臓器や種からの線維芽細胞と互換性があり、ヒトの原発性心臓線維芽細胞とここで例示される。...

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ&lt;250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。...

長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル

プラスチックメンブレンを使用した組織培養インサートは、細胞層やバリア組織のモデルを確立するための透過性サポートとして、細胞培養ラボのゴールデンスタンダードです。ここでは、プラスチックメンブレンを、組換え官能基化されたクモの糸タンパク質から作られた、より生物学的に関連性のあるメンブレンに置き換える簡単な方法を紹介します。...

ナノフィブリル基底膜模倣品 カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

学ぶ せん断ベースの押出法によるナノフィブリルパターンコラーゲン水ゲルの作製法。標準機器でコラーゲン線維の配向を制御し、組織工学や再生医療への応用を可能にする革新的なバイオマテリアル技術です。

組織工学のためのナノフィブリルパターンコラーゲンの作製

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